באמצעות 22C 3 נוגדן Anti-PD-L1 להתרכז ביופסיה ודוגמאות ציטולוגיה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא

Summary

כדי להרחיב את היכולת של מעבדות ברחבי העולם כדי להעריך את הזכאות של חולים עם סרטן ריאות לטיפול pembrolizumab, באופן אמין לשחזור, פיתחנו וזמינותו של העושה את תרכיז נוגדן 22C 3-נרחב זמין immunohistochemical autostainer, עבור דגימות ביופסיה והן ציטולוגיה.

Abstract

יחידני Pembrolizumab אושרה לטיפול, השנייה-שורה ראשונה של חולי PD-L1-הבעת מתקדמים סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC). בדיקות עבור הביטוי PD-L1 PD-L1 אימונוהיסטוכימיה (IHC) 22C 3 לוויה אבחון וזמינותו, אשר נותן שיעור הגידול ניקוד (TPS), אומתה על גידול רקמות. פיתחנו ממוטבת מפותחות מעבדה מבחן (LDT) המשתמשת את תרכיז נוגדן 22C 3 (אלב) על autostainer IHC נרחב זמין עבור דגימות ביופסיה ו ציטולוגיה. תוכנית-המיתאר PD-L1 הוערך עם דגימות ביופסיה ומקטעים לזווג רקמת הגידול כל 120, עם 70 לזווג דגימות ביופסיה ו ציטולוגיה (שוטף הסמפונות, n = 40; השתפכות, n = 30). Ab 22C 3 שמבוסס להתרכז LDT הראה שיעור קונקורדנציה גבוה בין ביופסיה (~ 100%) ציטולוגיה דגימות (~ 95%) בהשוואה ל- PD-L1 IHC ביטוי באמצעות וזמינותו לוויה 22C 3 IHC PD-L1-TPS שני חותכים נקודות (≥1%, ≥50%). LDT ממוטבת המובאים כאן, באמצעות את תרכיז אלב 22C 3 כדי לקבוע את הביטוי PD-L1 ברקמת הגידול שני, דגימות ציטולוגיה, ירחיב את היכולת של מעבדות ברחבי העולם כדי להעריך את הזכאות של חולי NSCLC לטיפול pembrolizumab יחידני באופן אמין לשחזור.

Introduction

האחרונות ניסויים קליניים הראו את היעילות של pembrolizumab, monoclonal IgG4 קאפה isotype מואנשים שחוסמת את האינטראקציה בין מות תאים מתוכנת 1 (PD-1), שלה ליגנדים, PD-L1 ו- PD-L2, לטיפול בחולים עם מתקדם NSCLC^1,2,3,4.

כיום, pembrolizumab אושרה לטיפול של NSCLC PD-L1-הבעת ' בחולים הן טיפול-תמים עם ביטוי PD-L1 תוכנית-המיתאר של ≥50%, אין גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR) או לימפומה אנפלסטית קינאז (ALK) הגידול גנומית סטיות³ בעבר מטופלים חולים עם תוכנית-מיתאר PD-L1 של ≥1%¹.

PD-L1 חלבון הביטוי שזוהה על-ידי IHC כבר בשימוש נרחב עבור טיפולים אנטי-PD-1/PD-L1 כמו assay סמן ניבוי. בניסויים קליניים pembrolizumab, המיתאר PD-L1 שהושג עם פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) דגימות רקמה נקבע באמצעות PD-L1 IHC 22C 3 assay לוויה, או⁵. Assay זו אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) ומאז CE המסומן באירופה מצפני הגידול PD-L1 TPS⁵.

אפשרויות נוספות גלובלית על פני מוסדות עבור הערכות איכותי ואמין של המיתאר PD-L1 עם LDTs להשתמש בו את תרכיז נוגדן 22C 3 חיוניים לתמיכה קלינית ההחלטות הנוגעות זכאות החולה pembrolizumab טיפול. מספר רב של מעבדות הפתולוגיה אין גישה PD-L1 IHC 22C 3 אבחון לוויה וזמינותו. לכן, הפיתוח של LDTs אמינה ועקבית תואם פלטפורמות autostainer IHC נוספים, הנפוצה היא חיונית.

יתר על כן, יש צורך בהקמת LDTs באמצעות דגימות ציטולוגיה המהווים סוג הדגימה היחיד הזמין לעתים קרובות מחולים NSCLC. PD-L1 IHC 22C 3 מסייע וזמינותו מאומת כריתות, ביופסיות מחט הליבה של bronchoscopies רק אם ברונכוסקופיה מניבה 100 תאים סרטניים. למרות סוגי דגימה לעיל מתקבלים לעיתים קרובות, ציטולוגיה דגימות נאספים ביתר קלות, סוג הדגימה הנפוץ ביותר הזמינים ב^6,כמה מוסדות⁷. עם זאת, יש כיום אין assay אבחון המאומת זמין עבור הערכת הביטוי PD-L1 בדגימות ציטולוגיה; תואם עם דגימות ציטולוגיה אמין LDTs להמשיך לקדם את בדיקת PD-L1 באיכות גבוהה.

יתר על כן, בעת יצירת האימות קליני של LDT, IHC צריכה להתבצע באופן דומה מבחן מסחרי המאומת קלינית המתאימה⁸. למשל, מספר שלבים קריטיים צריך לאמת כדי לקבל את האות באותו בסעיפים טורית כגון נוגדנים טיטור, עיכובים pretreatment, זמן הדגירה, מערכות הגברה⁹.

לאחרונה פיתחנו של LDT ממוטבת העושה את תרכיז נוגדן 22C 3 להעריך את הביטוי PD-L1 על הגידול ביופסיות ו ציטולוגיה דגימות^10,11. . מצאנו את הקונקורדנציה גבוהה עם LDT לעומת "תקן הזהב" PD-L1 IHC 22C 3 assay^10,11. פרוטוקול המאומת קלינית זה יתמוך אמין, איכותי PD-L1 בדיקות על-פני אזורים ברחבי העולם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (ועדת האתיקה מחקר אנושי, מרכז Hospitalier Universitaire דה ניס/Tumorothèque BB-0033-00025).

הערה: פרוטוקול זה במיוחד מותאמת לשימוש של נוגדן 22C 3 להתרכז זמינים מסחרית אוטומטיות IHC הוספת גוון לסמלים (המכונה כפי autostainer כאן, לראות את הטבלה של חומרים) עבור גידול ביופסיות ודוגמאות ציטולוגיה.

1. הכנת דגימות רקמה הגידול

1. לתקן את רקמת הגידול בפורמלין 10% נייטרלי במאגר (NBF) בקלטת.
   הערה: רקמת הגידול גידולים ריאות proximal מתקבל בדרך כלל על ידי ברונכוסקופיה, בביצוע הרגעה מתונה pulmonologist, או ריאות מומחה. נגעים היקפיים, מחלות ריאה ' מאטום לשקוף ', מסומן ביופסיה transbronchial או מחט. הליכים אלה נעשים בדרך כלל חדר ניתוח או יחידת טיפול נמרץ.
2. להטביע את הקלטת פרפין.
   הערה: קיבוע יכולה להיות מושגת על ידי זלוף או טבילה מיד לאחר ניתוח, בדרך כלל דורש 8-10 h. אמצעי האחסון מקבע צריך להיות גבוה יותר נפח דגימה 15 – 20 x. לא מומלץ לתקן ביופסיה רקמות עבור יותר מ 10 h, כי overfixation יכול לגרום מיסוך של אנטיגן. מהירות קיבעון היא בערך 1 מ/שעה בטמפרטורת החדר.
3. לחדור את דגימת הרקמה קבוע עם שעווה במעבד רקמות (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: התייבשות מתבצע בשלוש אמבטיות אלכוהול עם הגדלת ריכוזים 70%, 85% ו- 90%. מים סוף סוף הוסר על ידי שלוש אמבטיות אלכוהול המוחלט הסופי. קרחת היער מתבצע שלוש אמבטיות טולואן, חדירה שעווה, שעווה חמה אמבטיות (44 – 60 ° C).
4. להטביע את הרקמה בתוך תבנית מלאה פרפין מותכת (ראה טבלה של חומרים) ולחכות התמצקות.
5. בסעיף ברקמות עובי של 3 μm על מיקרוטום פרפין-מוטבע.
6. העברת הכלים פרפין לכוס מיקרוסקופ הטעון חיובית שקופית (ראה טבלה של חומרים).
7. יבש את השקופית עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: אחסן את קטעי רקמה ב 2-8 ° C (מועדפת) או בטמפרטורת החדר עד 25 ° C כדי לשמר את antigenicity, כתם בתוך 15 ד' של חלוקתה.

2. הכנת דוגמאות ציטולוגיה

1. לאסוף את הסמפונות כביסות בפתרון משמרים (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: בשביל זה, ברונכוסקופיה רגילים משתמשים בטכניקה.
   1. שטיפה חלוקת סמפון מתחננות שיטעמו. לאסוף כביסה במיכל נקי. תווית המיכל עם המטופל הראשון, שם משפחה, תאריך הלידה, ואת מקור הדגימה.
2. להעביר את הסמפונות כביסות צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 2 גר' DL-Dithiothreitol אבקה (ראה טבלה של חומרים), מערבולת הצינור במשך 30 דקות ולאחר מכן centrifuge זה ב x 250 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של פתרון mucolytic (ראה טבלה של חומר).
4. לנער את הדגימה כעשרים דקות במהירות בינונית (רמה 9), centrifuge זה ב 250 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הסר את תגובת שיקוע, להפקיד בגדר תא במנורות האוסף המכיל 10% NBF.
6. להוסיף 4 טיפות של ריאגנט הכנה בלוק תא (ראה טבלה של חומרים) כדי בגדר התא.
7. להעביר בגדר תא קסטה, תקן את זה ב 10% NBF, פרפין- להטביע אותו עבור התא בלוק והכנה חלוקתה (ראה שלבים 1.1 – 1.7).

3. PD-L1 מכתים Assay

1. . הפעילי את autostainer ואת המחשב
2. לחץ פעמיים על הסמל autostainer ובחר את המשתמש.
3. לחץ על 'צור תווית' ולאחר מכן על "פרוטוקול".
4. לחץ פעמיים על פרוטוקול 22C 3.
   הערה: הפרוטוקול קודם מותקן במחשב של autostainer על ידי לחיצה על ' צור פרוטוקול '. פרוטוקול מלא מסופק 1 קובץ משלים.
5. לכתוב מזהה המטופל על התווית ולחץ על 'הדפסה'.
6. לתקוע את התווית על השקופית.
7. פתח את המגירה שקופית על-ידי לחיצה על הלחצן של המגירה זה נבחר.
8. מקום השקופית עם תוויות על משטח תרמי עם התווית פונה ואת פנימה.
9. סגור את המגירה שקופיות.
10. להסיר את הפקקים של החלוקה וטען את ריאגנטים על מדפים של נוגדנים.
11. פתח את מכסה המנוע הוספת גוון לסמלים ומניחים המדפים על קרוסלת של ריאגנטים מוודא כי הם מתאימים ולהחזיק בעמדה.
12. סגור את מכסה המנוע.
13. התוכנה, לחץ על הכלי ישמש ולחץ על 'זורמים'.
14. בסוף ההליך IHC, לשטוף את השקופית למשך מספר שניות עם מי ברז וטיפה אחת של ניקוי.
15. נתרענן השקופית עם אמבטיה אחת של אתנול 100% ואמבט השני של אתנול 95% למשך מספר שניות.
16. השקופית לתוך המכונה coverslipping להעלאה אוטומטית של coverslip המקום.

4. הפרשנות ההכתמה PD-L1

הערה: פתולוג מוסמך, יש לבצע את הפרשנות של הבדיקה IHC PD-L1.

1. להעריך את איכות ההכתמה PD-L1 על-ידי ניתוח הפקדים חיוביים ושליליים לפני הבדיקה של הדגימה של המטופל.
   הערה: התוצאות המתקבלות על הדגימה של המטופל נחשבים לא חוקיים אם ההכתמה של הפקדים אינה מקובלת.
2. לאשר הנוכחות של מינימום של 100 תאים סרטניים קיימא תחת מיקרוסקופ.
   הערה: דוח כאשר הדגימה של החולה יש פחות מ-100 תאים סרטניים.
3. בהגדלה גדולה נמוך של 4 X, להעריך את כל אזורי גידול שלילי וחיובי שהשתמרה היטב.
   הערה: בהגדלה נמוכה, קרום חלקי להכתים או קרום מכתים בעוצמה חלשה (1 +) עשוי להיות קשה לזהות.
4. ניקוד חלקי או מלא של קרום התא מכתים.
   הערה: ההכתמה cytoplasmic יש ייכללו פרשנות.
5. לחשב תוכנית-המיתאר על-ידי הערכת שיעור PD-L1 בתאים גידול חיובי יחסית תאים סרטניים כל נוכח באזורי הגידול שהשתמרה היטב.
   הערה: רק תאים סרטניים קיימא צריך להיבדק. כל הסלולר רכיבים אחרים, כגון תאים חיסוניים, תאים עם נמק, תאים נורמליים, וממצאים, צריך להיות נשלל מכל הבחינה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות ההליך שהוצגו כאן, ולא כפי שתואר בפירוט של קבוצה זו האחרונה פרסומים^10,11, LDT ממוטבת קלינית אומתה עם 120 דגימות ביופסיה ארכיוני FFPE NSCLC של חולים שעברו ניתוח כריתה או ביופסיה בבית החולים האוניברסיטאי פסטר, ניס, בין מרץ 2007 ו- 2016 מרס. יתר על כן, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הבדיקה והאימות של LDT ממוטב באמצעות. תתרכזי נוגדן PD-L1 22C 3, על-ידי השוואתה עם ה^10,המקביל בדיקה קלינית המאומת מסחרי¹¹. 22C 3 מרוכז נוגדן מבוססי LDT הראה שיעור קונקורדנציה גבוה בין ביופסיה (~ 100%) דגימות ציטולוגיה (~ 95%) בהשוואה הביטוי PD-L1 IHC נקבע באמצעות וזמינותו PD-L1 IHC 22C 3 ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NovaPrep HQ1	Novacyt	NA	Preservative solution for cytology specimens
Novaprep® HQ+ B	Novacyt	NA	Mucolytic solution
Tissue-Tek VIP 6	Sakura	6042 VIP 6
Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System	Sakura	5229 TEC 5
microscope glass slide SuperFrost Plus	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS4
DL-Dithiothreitol powder	Sigma-Aldrich	D3801
Heidolph Multi Reax Vortex Shaker	Thermo Fisher Scientific	13-889-410
Shandon Cytoblock	Thermo Fisher Scientific	7401150
22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody	Agilent Dako	#M365329
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx	Agilent Dako	SK006
Autostainer Link 48	Agilent Dako	AS480
BenchMark ULTRA autostainer	Ventana	#750-600
OptiView HQ Universal Linker	Ventana	#760-700
OptiView HRP Multimer	Ventana	#760-700
OptiView Amplification H2O2	Ventana	#760-099
OptiView Amplifier	Ventana	#760-099
OptiView Amplification Multimer	Ventana	#760-100
OptiView DAB	Ventana	#760-700
OptiView Copper	Ventana	#760-700
Hematoxylin II	Ventana	#790-2208
Bluing Reagent	Ventana	#760-2037
Cell Conditioning 1 (CC1)	Ventana	#950-124
Tissue-Tek Film Coverslipper	Sakura	4742