א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

Summary

הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.

Abstract

הזדקנות התא הוא אחד הסימנים ההיכר של ההזדקנות ידוע להשפיע על תוחלת חיים בריאה. תרופות מסוגל להרוג תאים senescent במיוחד בתרבות התא, כינה senolytics, יכול להפחית את הנטל התא הסנאני בvivo ולהאריך את ברינספנה. מספר מחלקות של senolytics זוהו עד כה כולל HSP90 מעכבי, Bcl-2 מעכבי משפחה, piperlongumine, פפטיד FOXO4 מעכבות ושילוב של Dasatinib/Quercetin. זיהוי של SA-β-Gal ב-pH מוגברת למטה הוא אחד הסמנים המאופיינת הטוב ביותר לזיהוי של תאים הסנאים. מדידות התאים הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) באמצעות מצע הפלורסנט C₁₂fdg בשילוב עם קביעת מספר התאים הכולל באמצעות הצבע המשולב DNA שפותח את האפשרות ל מסך עבור תרופות senotherapeutic המקטינה את הפעילות הכוללת של SA-β-Gal על-ידי הריגת תאים סנסטיים (senotherapeutic) או על-ידי דיכוי SA-β-Gal ופנוטיפים אחרים של תאים סנסטיים (senomמורקס). שימוש בפלטפורמת הרכישה והניתוח של תמונת פלורסנט באיכות גבוהה מאפשר הקרנת תפוקה מהירה וגבוהה של ספריות תרופות לאפקטים ב-SA-β-Gal, מורפולוגיה של תאים ומספר תאים.

Introduction

הזדקנות תאית תוארה בפעם הראשונה על ידי ליאונרד הייפליק ו פול מורהד, אשר הראה כי תאים נורמליים יש יכולת מוגבלת להתרבות בתרבות¹. תאי הסנקו אינם מתרבים למרות הנוכחות של חומרים מזינים, גורמי גדילה וחוסר במגע מעכבות, אבל להישאר metabolically פעיל². תופעה זו ידועה בתור הזדקנות מחודשת והיא יוחסה בעיקר לקיצור טלומר, לפחות בתאים אנושיים³. מחקרים נוספים הראו כי התאים יכולים גם להיות המושרה לעבור הזדקנות בתגובה גירויים אחרים, כגון הלחץ אונגניים (אוננציה המושרה, או), נזק לדנ א, תרופות ציטוטוקסיים, או הקרנה (הנגרמת באופן מלחיץ, SIS)^{4 ,} מיכל ^{5 , 6}. בתגובה לנזק לדנ א, כולל הסחף טלומר, תאים מאוהים, להתחיל צמיחת תאים בלתי מבוקרת, או לעבור אפופטוזיס אם הנזק לא ניתן לתקן. במקרה זה, הזדקנות התא נראה מועיל כפי שהוא פועל בצורה מדכאים הגידול². לעומת זאת, הזדקנות מוגברת עם ההזדקנות בשל הצטברות של נזק הסלולר כולל נזק לדנ א. מאז התאים הסננסלי יכול להפריש ציטוקינים, מטאלופרוטאינסים וגורמי גדילה, כינה את האג הסודי הקשור הפרשה (sasp), זו עלייה בגיל תלוי בתקופת הזדקנות הסלולר sasp תורמת הומאוסטזיס רקמות ירידה ו לאחר מכן הזדקנות. כמו כן, גידול זה תלוי גיל בנטל הזדקנות ידוע לגרום מחלות מטבולית, רגישות למתח, תסמונות פרוגריה, לקויי ריפוי^7,8 והוא, בין השאר, אחראי על רבים הקשורים לגיל מחלות, כגון טרשת עורקים, אוסטיאוארתריטיס, ניוון שרירים, היווצרות כיב, ומחלת אלצהיימר^{9,10,11,12,13}. ביטול תאים senescent יכול לעזור למנוע או לעכב את תפקוד הרקמה ולהאריך את בריבן¹⁴. זה הוצג במודלים העכבר הטרנסגניים^14,15,16 , כמו גם באמצעות תרופות ושילובי סמים שנתגלו באמצעות מאמצי סינון סמים וניתוח ביולוגי של מסלולים המושרה במיוחד בתאי הס,^{17,18,19,20,21,22}. זיהוי התרופות הטיפוליות האופטימליות יותר, היכולת לצמצם ביעילות רבה יותר את הנטל החיצוני של התא, הוא השלב הבא חשוב בפיתוח גישות טיפוליות להזדקנות בריאה.

התאים הסנאריים מציגים תכונות פנוטיטיות ומולקולריות אופייניות, הן בתרבות והן בvivo. אלה סמנים הזדקנות יכול להיות הגורם או תוצאה של אינדוקציה הזדקנות או תוצר לוואי של שינויים מולקולריים בתאים אלה. עם זאת, אף סמן יחיד לא נמצא באופן ספציפי בתאי הסנקו. כיום, זיהוי הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) הוא אחד השיטות המבוססות על תאים בודדים ומבוססות-תא יחיד למדידת הזדקנות בתוך מבחנה ובvivo. SA-β-גל הוא הידרוקלז ליסוזומל עם פעילות אנזימטית אופטימלית ב-pH 4. מדידת פעילותה ב-pH 6 אפשרי מכיוון שתאי הסנסזים מראים פעילות ליזוזומלית מוגברת^23,24. עבור תאים חיים, pH מוגברת ליזוזומל מושגת על ידי ליסוזומיום המלחה עם וולאואר H⁺-atpase מעכבי Bafilomycin A1 או אנדוזומחמצה מעכבי ככלורוקין^25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-גלפטוטוסייד (C₁₂fdg) משמש מצע בתאי החיים כפי שהוא שומר על מוצר ביקע בתאים בשל 12 הפחמן ליפופילית moiety²⁵. חשוב לעשות זאת, SA-β-Gal הפעילות עצמה אינה מחוברת ישירות עם כל מסלול מזוהה בתאי הסנקו והוא אינו נחוץ כדי לגרום הזדקנות. בעזרת שיטת הפעולה הזאת, ניתן לזהות את תאי הסנסאלים גם באוכלוסיות הטרוגניות וברקמות ההזדקנות, כגון ביופסיות עור מאנשים מבוגרים. זה גם שימש כדי להראות מתאם בין הזדקנות התא ההזדקנות²³ כפי שהוא סמן אמין עבור זיהוי תא הסננסאס במספר אורגניזמים ותנאים^27,28,29, . בסדר, ³⁰ כאן, התפוקה הגבוהה SA-β-Gal הקרנת מבוסס על מצע פלורסנט C₁₂fdg באמצעות העכבר הראשי מעובריים מתחלקים (mefs) עם לחץ חמצוני הנגרמת על ידי הזדקנות התא מתוארת היתרונות והחסרונות שלה נדונים. למרות שניתן לבצע את התיקון הזה עם סוגים שונים של תאים, השימוש Ercc1-לקוי, DNA תיקון לקוי mefs מאפשר אינדוקציה מהירה יותר של הזדקנות בתנאים של לחץ חמצוני. בעכברים, ביטוי מופחת של תיקון ה-dna endonuclease ERCC1-xpf גורם לקויי dna תיקון, הצטברות מואצת של נזק dna אנדוסוגני, מוגבה ROS, בתפקוד מיטוכונדריאלי, מוגברת נטל תא העין, אובדן תפקוד תא גזע ו הזדקנות מוקדמת, דומה להזדקנות טבעית^31,32. באופן דומה, Ercc1-mefs לקוי לעבור הזדקנות במהירות רבה יותר בתרבות¹⁷. תכונה חשובה של שיטת ה-MEF של הארגון היא שבכל החדרים יש שילוב של תאים מיוחדים ובלתי-מוגדרים, ומאפשרים הדגמה ברורה של השפעות מיוחדות לתאים. עם זאת, למרות שאנו מאמינים כי השימוש בלחץ חמצוני בתאים הראשוניים כדי לגרום הזדקנות הוא פיזיולוגי יותר, שיטת זה גם ניתן להשתמש עם קווי התא שבו הזדקנות המושרה עם סוכני DNA נזק כמו etפאות או הקרנה.

Protocol

השימוש בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים שסקריפס פלורידה והשימוש.

1. הדור של המחלמה עובריים מתחלקים (MEF) – 12-15 ימים

1. לבודד את סוג פראי ו Ercc1^-/- mefs מתוך עכברים נשים בהריון ביום העובריים 13 (E13) כמתואר בעבר³³.
   הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים במכסה של תרבות הרקמה תחת תנאים אספטי ושימוש בכלים סטריליים.
2. . לכרות את ראש העובר מעל העיניים
3. הסירו את הרקמה האדומה (הלב והכבד) והשתמשו בהן במקרה הצורך.
4. להכין 500 mL של התערובת 1:1 של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו F10 של האם עם 10% סרום העובר העוברי, 1x חומצות אמינו לא הכרחי, פניצילין, ו סטרפטומיצין כמו בינוני גדילה ולחמם אותו עד 37 ° צ' עבור סביב 15 דקות לפני כל שימוש. אחסן בינונית צמיחה ב-4 ° c.
5. מודחלת את שאר העובר עם 0.25% טריפסין/EDTA במשך 10 דקות.
6. האוהב העובר לתוך חתיכות 1 מ"מ ופיפטה את הרקמה למעלה ולמטה מספר פעמים.
7. הוסף 10 מ ל של הצמיחה בינונית ורקמות הצלחת של עובר אחד לכל 10 ס מ בקוטר הלוח התרבות התאים (מעבר 0).
8. לטפח תאים ב 37 ° c, 3% O₂, 5% CO₂.
   הערה: רק תאי MEF מתחברים ללוחות של תרבית רקמה שאינם מצופים בתנאים אלה.
9. שנה את המדיום כל יום במעבר 0 כדי להסיר מקטעי רקמות ושברי תאים שאינם מצורפים.
   הערה: בהתאם לגודל העובר ולאיכות הבידוד, התא בדרך כלל מגיע לידי שליטה לאחר 2 עד 3 ימים.
10. טריסינוניזציה
    1. הסר בזהירות את בינוני הצמיחה ולשטוף תאים עם 10 מ ל של 1x PBS פעמיים.
    2. הוסף 2 מ ל של 0.025% טריפסין/EDTA פתרון לתאים בקוטר 10 ס מ לוחות ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 2-3 דקות.
    3. ודא שהתאים מנותקים מהמשטח על-ידי בדיקת התאים מתחת למיקרוסקופ.
    4. הפסקת העיכול באמצעות הוספת אותה כמות של מדיום גדילה.
    5. העבר את התאים לצינור חרוט ולתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות ולמחוק את הסופרנטאנט.
    6. השהה את התאים מחדש בזהירות במדיום גדילה טרי, ספירת תאים והזרע אותם בלוחות חדשים בצפיפות התא המתוכננת.
11. לצורך טיפוח-תרגול של תאים שאינם מניבים, ה1:4 והרחבת למעבר אחר ב-3% O₂, 37 ° צ' לתשואות תאים נוספים (מעבר 1).
    הערה: בשלב זה ניתן לשמור על התאים בתרבות או לשמור לשימוש מאוחר יותר בחנקן נוזלי, בקריוצלוחיות המכילות כ-1,000,000 תאים לכל אחד. שלב זה מציע גם את האפשרות ליצור אצווה מעורבת של תאים מבעלי חיים שונים כדי להפחית את השונות הבאה מניתוח בעלי חיים יחיד.
12. כדי לגרום להזדקנות התא, זרעים פיצול תאים confluent ממעבר 1 ביחס של 1:4 ו-דגירה אותם ב 20% O₂, 37 ° c, 5% CO₂ עבור 3 ימים; תנאי התרבות האלה הם בעלי אטמוספירה מלאת חמצן.
    הערה: טיפוח התאים ו blastocysts תחת ריכוזי חמצן הסביבה יכול להעלות סמנים של הסלולר באופן ספציפי כאשר תיקון נזק DNA הוא לקויי^34,35,36.
13. חזור על הליך זה עבור 2 פסקאות נוספות.
14. כדי לפקח על הזדקנות תאית, למדוד את העלייה הדרגתית בקוטר התא ובעוצמת התאים במהלך כל הטריסיזציה באמצעות מערכת המונה מתקדם מונה התא.
15. הערכת הפחתת ההתפשטות של התאים על-ידי קביעת הכפל האוכלוסיה (PD) באמצעות המשוואה
    PDT = (t₂-t₁)/3.32 x (log n₂ – היומן n₁)
    הערה: זמן הכפלת האוכלוסיה נעשה בשימוש רק עבור תאים לא-מסנטיים.
16. השתמש במעבר מוקדם סוג פראי או Ercc1^-/- mef תאים שנשמרו ב 3% O₂, 37 ° c, 5% CO₂ כתאי בקרה שאינם מסנתיים.

2. שיטת ההקרנה הβ-גל המשויכת – 2-3 ימים

1. הכנת 10 מ"מ פתרונות מלאי ב-DMSO של כל התרופות כדי להיבדק ולאחסן מאגר ali, ב-80 ° c. אין להקפיא ההפשרה פתרונות מניות כמו זה עשוי להקטין את פעילות הסמים.
   הערה: כאן, HSP90 מעכב 17DMAG שימש כתרופה בחרדה מסוגל במיוחד להרוג תאים הסנאט¹⁷.
2. ביום הניסוי להפשיר את aliquot, לדלל את הסמים במדיום תרבות טרייה ולהוסיף לתאים המכילים בינוני ממוזג ביחס 1:1 כדי להניב את הריכוז הסופי במדיום צמיחה.
3. השתמש ב-96-ובכן לפני דילול לוחות לדילול סדרתי ושילובי תרופות.
   הערה: עבור תאים MEF, זה היה באמפירי נקבע כי ריכוזי DMSO לא יעלה על 2% ולשלוט בתאים שטופלו עם ריכוזי DMSO הגבוהה ביותר בשימוש צריך להיכלל בכל לרוץ.
4. Seed 5 x 10³ תאים הסנסי או 3 x 10³ תאים שאינם מסנסוניים לכל טוב ב 96 הצלחות היטב לפחות 6 h לפני הטיפול ב 100 μl של גידול בינוני ו דגירה ב 20% O₂, 37 ° c, 5% CO₂.
   הערה: התאים צריכים להיות כ 80% שוטפת לפני הטיפול.
5. השימוש בקיר שחור/הרקמה התחתונה ברור הרקמות, טיפל 96 לוחות היטב כדי למזער את אות הפלורסנט מוצלב ורקע.
   הערה: עם זאת, לוחות ברורים נבדקו גם בהצלחה.
6. הוסף מדלל סמים לתאי MEF ו-דגירה עבור 24 שעות עד 48 h תחת 20% O₂, 37 ° c, 5% שיתוף₂ תנאים.
7. שמרו על תאים לא-מסנקיים תחת 3% O₂, 37 ° c, 5%₂ תנאים.
8. עבור ליזוזומלית, להכין פתרון 10 מ"מ bafilomycin A1, סדרת מחלקים ו לשמור קפוא ב-20 ° c.
9. לניתוח הקרינה הפלואורסצנטית של פעילות SA-β-Gal, להכין 2 מ"מ C₁₂fdg מניות פתרון, חנות ב-20 ° c, ולהגן מפני אור.
10. עבור פתרון העבודה, להכין 100 μM C₁₂fdg במדיום צמיחה ביום הניסוי.
    הערה: יש לבצע את כל צעדי הדגירה הכרוכים ב-₁₂fdg בחשכה.
11. הסר את פתרון התרופה ושטוף את התאים 1 פעם עם 100 μL של 1x PBS.
12. לגרום ליסוזומלית על ידי טיפול מקדים בתאים עם 90 μL של 100 nM bafilomycin A1 הפתרון הכין בינונית תרבות התא טרי במשך שעה אחת 20% O₂, 37 ° c, 5% CO₂.
13. הוסף 10 μL של 100 μM C₁₂fdg עבודה פתרון למדיום התרבות (ריכוז סופי 10 μm).
14. התאים הדגירה עבור 2 h.
15. הוסף 2 μL של 100 μg/mL הואכסט 33342 לצבוע (ריכוז סופי 2 μg/mL) לתרבות, הדגירה עבור 20 דקות.
16. הסר מדיה והוסף 100 μL של מדיום גידול טרי.

3. ניתוח תמונה פלואורסצנטית כמותי של תכולה גבוהה

1. השתמש בפלטפורמת הצילום והניתוח של תמונת פלורסנט בעלת תוכן גבוה כדי לרכוש תמונות פלורסנט של התאים בשני הערוצים המתאימים ללכידת הופסט ו-C12FDG פלואורסצנטית (g., DAPI ו-FITC הגדרות ערוץ הקבועות מראש, בהתאמה).
   הערה: פרוטוקולי הרכישה דורשים הגדרה של מספר משתנים הספציפיים לצורך הצורך. המטרה של פרוטוקול הרכישה היא ללכוד מספר הולם של תמונות פלורסנט במיקוד של מספר מספיק של תאים עבור ניתוח כמותי במורד הזרם.
2. פתח פרוטוקול ניתוח מתאים על-ידי בחירה בכל ערוץ והגדרה, על-ידי התאמת קריטריון סלקטיבי אחד או יותר, מה שנחשב כתכונה של עניין בכל אחד מהערוצים.
   1. עבור הגרעין, להשתמש כל כך פילוח מראש סטים (למשל, פילוח גרעיני, מקטעי ושלפוחית, פילוח ציטופלסמה) שיאפשרו זיהוי של אורגלים סלולריים על בסיס של קריטריונים מרובים כולל מורפולוגיה, גודל, ואות עוצמה. כוונן קריטריונים אלה כדי לכלול גרעינים תוך הימנעות משברים ופסולת גרעינית שייתכן שיש להם אות, אבל שהם, למשל, גדולים מדי או קטנים מדי כדי להיות גרעינים.
   2. בדוק את האות בערוץ FITC אשר הוא הקרינה הפלואורסצנטית C₁₂fdg ומייצגת את כמות הפעילות הβ-גלטוסידהקשורים ביותר בתאים.
      הערה: בתאי הסננסאוז יש פעילות גבוהה יותר הקשורה לβ-גלטוסידאז מאשר תאים שאינם מסנזים; עם זאת, C₁₂fdg פלואורסצנטית יהיה לא דיסקרטית ורציפה, המחייב הקמת סף בין מה שנחשב C₁₂fdg-חיוביים ו-c₁₂fdg-שלילי תא.
   3. באמצעות תוכנה אנליטית זמינה מסחרית, צור מספר מופעים בהם אזור מוגדר המקיף את הגרעין (תא שוערת) חופף לפחות פעם אחת עם הסף הגבוה ביותר C₁₂fdg.
      הערה: התוכנה האנליטית יוצרת באופן אוטומטי ספירה באמצעות קישור ליעד. זוהי ההגדרה המעשית של הבדיקה של תא בינארי, מתאים ל_-12fdg-חיוביים.
3. לנתח את כל הדגימות בטריליטה עם 3-5 שדות לערכים מסוימים וממוצע והסטיות הסטנדרטיות המחושבות בהתאם.
4. חשב את אחוז התאים המסנסתשימוש בנוסחה הבאה:
   תאי סנס100 4 (%)

4. שיטת אימות פרמטרים

1. עבור כל הדגימות של מקדם הווריאציות הפנים והבין-מתוך-שיטת (% קורות חיים) חושבו באמצעות הנוסחה הבאה:
   קורות חיים של שיטת הפנים (n = 10 חוזר ונמדד בניסוי אחד) = x 100 (%)
   קורות חיים בין-שיטת (n = 5 ניסויים עצמאיים ) = x 100 (%)
2. למטרות הקרנה, לקבוע את הערך Z, פרמטר סטטיסטי כדי להעריך את איכות הטיפול, מתאים שטופלו עם 200 ננומטר rapamycin עבור 24 שעות ב 20% O₂, 37 ° צ', 5% CO₂ (בקרה חיובית עבור תרופות senotherapeutic) ולא מטופל תאי הסנלי (שליטה שלילית).
   הערה: ערך ה-Z חושב בהתאם ל-Zhang ואח '.³⁷. ערכי Z בין 0.5 ל-1 מצביעים על כך שניתן להשתמש באפשרות לסינון תרופות.

תוצאות

הפעילות SA-β-Gal ניתן לזהות בתאים המושרה על ידי דרכים שונות של תשישות replicative ומתח חמצון, כדי אונאוגן ההפעלה^23,25,38. במודל הנוכחי באמצעות Ercc1-לקוי העכבר העובריים תאים, normoxic תנאי הצמיחה (20% O₂) היו מספיקים כדי לגרום הזדק?...

Discussion

SA-β-Gal הוא ביואריקר מוגדר היטב עבור הזדקנות הסלולר התגלתה במקור על ידי Dimri et al. (1995) מראה כי שהפיצוצים האנושיים הסחיים יש להגדיל את הפעילות של SA-β-Gal כאשר העלה ב-pH 6²³ לעומת תאים מתרבים. בינתיים, בתוך מבחנה ובvivo של SA-β-Gal הוקמו עבור סוגי תאים שונים ורקמות^25,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013-CV	medium
Ham's F10	Gibco	12390-035	medium
fetal bovine serum	Tissue Culture Biologics	101	serum
1x non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl	amino-acids
bafilomycin A1	Sigma	B1793	lysosomal inhibitor
C12FDG	Setareh Biotech	7188	b-Gal substrate
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	DNA intercalation agent
17DMAG	Selleck Chemical LLC	50843	HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System	GE Healthcare		High Content Imaging System