JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות תלת מימדי של החולה-derived גליובלסטומה תאים בתוך orthogonally tunable biomaterials כחיקוי של מטריקס המוח. גישה זו מספקת במבחנה, פלטפורמה ניסיוני זה שומר על מאפיינים רבים של ויוו גליובלסטומה תאים בדרך כלל לאיבוד בתרבות.

Abstract

גליובלסטומה (GBM) הוא הסרטן הנפוץ ביותר, עדיין הקטלני ביותר, מערכת העצבים המרכזית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים התמקדו איך מטריצה חוץ-תאית (ECM) של הסביבה המוח ייחודי, כדוגמת חומצה היאלורונית (HA), מקלה על התקדמות GBM, הפלישה. עם זאת, רוב במבחנה הדגמים תרבות כוללים תאים GBM מחוץ להקשר של ה-ECM. Xenografts מאתר של תאים GBM נמצאים בשימוש נפוץ גם כן. עם זאת, מודלים ויוו להקשות לבודד התרומות של תכונות בודדות של microenvironment הגידול מורכב להתנהגות הגידול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מבוססת הידרוג תלת מימדי (3D) תרבות HA זה מאפשר לחוקרים לשנות באופן עצמאי ריכוז HA וקשיחות. משקל מולקולרי גבוה HA, פוליאתילן גליקול (PEG) מהווים hydrogels, אשר תפור באמצעות תוספת מסוג מייקל בנוכחות תאים חיים. תרבויות הידרוג תלת-ממד של החולה-derived הכדאיות בנספח תאים GBM והתפשטות שיעורי כמו, או טוב יותר, כאשר תרבותי gliomaspheres כסטנדרט. מערכת הידרוג מאפשר גם התאגדות של פפטידים ECM-מימטי לבודד את ההשפעות של תאים ספציפיים-ECM אינטראקציות. Hydrogels שקופים שטיחות כך תאים חיים יכול לדימות בתרבות תלת-ממד. לבסוף, HA הידרוג תרבויות תואמים טכניקות סטנדרטי עבור ניתוחים מולקולרית, תאית, כולל PCR, סופג המערבי cryosectioning ואחריו immunofluorescence מכתים.

Introduction

מערכות תלת מימד (3D) תרבות מסכם את הדברים אינטראקציות בין התאים שלהם שמסביב (ECM) מטריצה חוץ-תאית ברקמות מקורית יותר שלהם1,דו מימדי עמיתיהם (2D)2. החידושים הנדסת רקמות הניבו תרבות מתוחכם, 3D פלטפורמות המאפשרות מבוקרת חקירות רכיבים כימיים 1) איך של מטריקס microenvironment משפיעים על תא התנהגויות ו 2) היעילות של חדש טיפולית אסטרטגיות עבור מספר מחלות, כולל סרטן2. בעוד במבחנה מודלים יכול לזהותה, סיסטמי אותות האנדוקרינית ואת המערכת החיסונית, ולכן לא יכול להחליף לחלוטין ויוו מודלים, הם מספקים מספר יתרונות כולל הפארמצבטית, בקרה ניסויית, כל אחד מהחדרים מכיל ומהירות. כאן, אנו מתארים את השימוש hydrogels המוח-מימטי שבו תלת-ממד תרביות של תאים סרטניים במוח החולה-derived ללכוד היבטים רבים של פיזיולוגיה הגידול, בפרט, הדינמיקה של רכישת טיפול ההתנגדות3. לעומת שיטות אחרות במבחנה , תרבויות אלה כדאי מייצגים ויוו הגידול מודלים, מחקרים קליניים3.

גליובלסטומה (GBM) הוא הסרטן תכופים וקטלני ביותר שמקורם במוח, עם חציון ההישרדות של 1-2 שנים רק4,5. בשנים האחרונות, מחקרים רבים התמקדו השפעת הסביבה מטריקס הגידול ב- GBM-6,-7,-8. ECM המוח ייחודי דווחה להשפיע על נדידת תאים GBM, התפשטות והתנגדות טיפולית6,7,8,9,10,11 , 12. חומצה היאלורונית (HA) הוא גליקוזאמינוגליקן שופע (איסור פרסום) במוח, זה מקיים אינטראקציה עם אחרים GAGs ואיפה proteoglycans לטופס הידרוג דמוי רשת שינוי13. מחקרים רבים דיווחו על HA ביטוי בגידולים GBM והשלכותיה עוקבות על סרטן התקדמות8,9,13,14,15,16 ,17. רכיבים אחרים ECM להשפיע גם על GBM גידול וצמיחה של הפלישה6,7,15,18. לדוגמה, fibronectin ו vitronectin, אשר בדרך כלל overexpressed ב- GBM, לגרום heterodimerization של קולטני אינטגרין פני שטח התא דרך איגוד רצף "RGD" וליזום מורכבים cascades איתות המקדמים הגידול הישרדות19 20, ,21. מלבד השפעות הביוכימי, תכונות פיזיקליות של המטריקס רקמות להשפיע גם על GBM התקדמות22,23.

רכישת מתמיד של עמידות לטיפולים הוא אחד המניעים העיקריים של GBM קטלני4. סמים מציג תוצאות מבטיחות במודלים 2D או gliomasphere נכשלו מחקרים בבעלי חיים מאוחרים יותר, מקרים קליניים3, המציין כי ההשפעות של גורמים microenvironmental באופן משמעותי תרמו GBM הגידול תגובה1. בעוד מודלים בעלי חיים יכול לספק תלת-ממד, מבחינה פיזיולוגית המתאים microenvironment לתאים החולה xenografted ולהפיק24,תוצאות הרלוונטית קלינית25, המורכבות של המוח microenvironment ויוו הופך מאתגרת כדי לקבוע אילו תכונות, כולל אינטראקציות סלולרי-מטריקס, מפתח על ספציפי לתוצאות ביולוגי. זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות ייהנו משימוש של פלטפורמות תרבות פשוטה שבה מוגדרים הביוכימי ומאפייני ביופיזיקלי.

בניגוד biomaterial שדווחה בעבר דגמי26,27 microenvironment הגידול GBM, אשר לא מתגשם נכון שליטה בתכונות הביוכימי ופיזית בודדים של ECM, פלטפורמת biomaterial אורתוגונלית סופגת מאפשר כאן דיווח על התרומות של תכונות עצמאיות מרובות פנוטיפ תאים GBM. כאן, אנו מציגים מערכת הידרוג מבוסס-HA, orthogonally tunable, לתרבות תלת-ממד של החולה-derived תאים GBM. Hydrogels נוצרות מתוך שני מרכיבים פולימריים: HA פעילים ביולוגית 1) ו- 2) ביולוגית אינרטי פוליאתילן גליקול (PEG). פג הוא חומר מסתיימים, הידרופילית בשימוש נרחב עם חלבון נמוכה ספיחה ו מינימלית immunogenicity28. כאן, כ- 5% של moieties חומצה גלוקורונית ב- HA שרשראות הן functionalized עם קבוצות תיול כדי לאפשר crosslinking כדי זמינים מסחרית 4-זרוע-יתד הסתיים עם maleimides באמצעות תוספת מסוג מיכאל. בצורתו הנפוצה ביותר בגוף, HA קיימת בשלשלאות משקל מולקולרי גבוה (HMW). כאן, רמה נמוכה של שינוי של HMW HA (500-750 kDa) מסייעת לשמירה על אינטראקציות מקורית של HA, קולטני התא שלה, כולל CD4429. על ידי החלפת פג-תיול HA-תיול תוך שמירה על יחס טוחנת קבועה של תיולים הכולל כדי maleimides, ריכוז HA יכול להיות decoupled מן התכונות המכאניות של hydrogels שנוצר. יתר על כן, הפקדים stoichiometric יכול לשמש כדי נזווג המסתיימת בציסטאין פפטידים למספר ממוצע מוגדר של הזרועות המסתיימת ב- maleimide על כל 4-זרוע-יתד. התאגדות של פפטידים נגזר ECM, דבק מאפשרת אינטראקציות עם אינטגרינים על תאים בתרבית, שדרכו אותות ביוכימיים וכימיים הן transduced1. תוספת Maleimide-תיול מתרחשת מהר מאוד בתנאים פיזיולוגיים, צמצום הזמן הנדרש תא כימוס, למקסם הישרדות של החולה-derived תאים. יתר על כן, תרבויות הידרוג יכולים להיות מטופלים כמו דגימות רקמה טיפוסי, עולים בקנה אחד עם טכניקות אפיון סטנדרטי כולל סופג המערבי, cytometry זרימה של immunofluorescence מכתים. הפרוטוקול הבא מתאר את נהלי בדיית hydrogels, הקמת תרבויות תלת-ממד של החולה-derived תאים GBM וטכניקות לניתוח הביוכימי.

Protocol

כל השלבים אוסף רקמה אנושית בוצעו תחת פרוטוקולים המאושרות כמוסד.

1. Thiolation של חומצה היאלורונית

הערה: יחסי טוחנת מתוארים לגבי המספר הכולל של קבוצות carboxylate אלא אם צוין אחרת.

  1. להמיס 500 מ"ג נתרן היאלורונית (HA, 500-750 kDa) ב 10 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים, יונים (לשכפל2O) ב החיטוי עיקור, 250 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק. מערבבים את הפתרון (~ 200 סל ד) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפזר באופן מלא HA. השתמש בר stir, צלחת מגנטית מערבבים כדי לשמור התגובה זע במהלך הליך thiolation.
  2. באמצעות 0.1 M חומצת מימן כלורי (HCl), להתאים את רמת החומציות של הפתרון HA 5.5. שוקלים לצאת 69.6 מ"ג (0.25 x יחס טוחנת) של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
    הערה: למרות undissolved EDC אפשר להוסיף ישירות אל הפתרון HA, זה בדרך כלל יותר קל להתמוסס EDC לראשונה ב 1 מ"ל של לשכפל2O ולאחר מכן להוסיף במהירות את הפתרון EDC לפתרון HA. טרום התפרקות ב 1 מ"ל של לשכפל2O יכול להעשות גם עם N-hydroxysuccinimide (NHS), cystamine dihydrocholoride לפני הוספת התגובה בשלבים 1.3 ו- 1.4.
  3. להוסיף 17.9 מ ג (0.125 x יחס טוחנת) NHS התגובה. להתאים את ה-pH של התמיסה תגובה ל 5.5 שימוש 0.1 M HCl, דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.
  4. להוסיף 70.0 מ ג (0.25 x יחס טוחנת) של cystamine dihydrochloride לתוך הפתרון התגובה. השתמש 0.1 M הידרוקסיד הנתרן (NaOH) כדי להתאים את ה-pH ל 6.25. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך הלילה תוך כדי ערבוב.
  5. למחרת, השתמש 1 M NaOH כדי להתאים את ה-pH של התמיסה התגובה בסביבות 8. להוסיף 192 מ ג (4 x יחס טוחנת) של dithiothreitol (DTT) התגובה. להתאים את ה-pH בחזרה ל- 8 לאחר תוספת של DTT ולהשאיר ערבוב במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
  6. השתמש 1 M HCl כדי להתאים את ה-pH ל- 4. להעביר את התערובת התגובה כולה לתוך קרום דיאליזה טרום רטוב (משקל מולקולרי ניתוק סביב 13 kDa) ו dialyze נגד לשכפל2O מראש להתאים ל- pH 4.
    הערה: היקף לשכפל2O לדיאליזה צריך להיות לפחות 40 פעמים הנפח של הפתרון יפעלו ויגיבו HA (למשל, 50 מ ל מדגם 2 ל' לשכפל2O, pH 4).
  7. להחליף את הפתרון דיאליזה (לשכפל2O, pH 4) פעמיים ביום במשך 3 ימים בטמפרטורת החדר.
  8. לסנן את הפתרון dialyzed דרך קרום מיקרומטר 0.22, מסנן מונחה ואקום. פלאש להקפיא תמיסת thiolated HA בחנקן נוזלי. השתמש של איזה שהוא לופילייזר להקפיא יבש דגימות מעל 2 ימים. Thiolated חה בטופס יבש יכול להיות מאוחסן של desiccator און ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.
  9. כדי לקבוע את מידת thiolation, להשתמש במבחן של אלמן ו/או פרוטון NMR ספקטרוסקופיה30,31.

2. הכנת חומרים Crosslinking

  1. להמיס thiolated HA-הריכוז הרצויה (בדוגמה זו, 13.3 מ"ג/מ"ל) ב- saline באגירה HEPES (20 מ מ HEPES במאגר מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) של האנק, התרגלו למניית pH של 8-9) המבחנה אמבר כדי למזער חשיפה תאורת. שמור את הפתרון זע ללא הרף.
    הערה: היווצרות חוב דיסולפידי בין תיולים מצומדת כדי HA עלולה להתרחש אם ה-pH הוא מעל 8, ריכוז הפתרון הוא גבוה מדי, או הפתרון שנשאר זע במשך זמן רב מדי לפני gelation. כדי למנוע בעיה זו, השתמש מתחת 15 מ"ג/מ"ל של thiolated HA, להמיס thiolated HA תוך שעתיים על הקמת hydrogels.
  2. להמיס 4-זרוע-פג-maleimide (פג-מל, 20 kDa) ו- 4-זרוע-פג-תיול (פג-תיול, 20 kDa) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4, להכין 50 מ"ג/מ"ל פג-מל ופתרונות פג-תיול מניות.
    הערה: זה לוקח לפחות שעה מלאה להתמוסס ריאגנטים פג.
  3. אם הוספת ECM-derived פפטידים, להמיס פפטידים המכילים ציסטאין PBS להכין פתרון מניות.
    הערה: השתמש ריכוז מניות של 2-4 מ מ.
  4. גומי סיליקון להשרות תבניות אתנול לפחות 20 דקות כדי לנקות ואז החיטוי אותם עבור עיקור.

3. הידרוג Crosslinking, כימוס תא

הערה: בתור דוגמה העטיפה של ארבעה הפרט, hydrogels 80 µL עם 0.5% (w/v) HA מודולוס compressive של 1 kPa הוא תיאר3. אנא עיין בטבלה 1 מתכונים לדוגמה המניבים hydrogels עם מאפיינים שונים: שני hydrogels שילוב של פפטיד אינטגרין מחייב RGD ו- hydrogels שני שילוב כמוסות ציסטאין כפקד שלילי לפעילות פפטיד. זריעה ריכוז של החולה-derived תאים GBM הוא תאים למ"ל 500,000.

  1. הפתרון מניות פג-מל (50 מ"ג/מ"ל, משלב 2.2) 12.5 מ"ג/מ"ל מדולל על-ידי הוספת µL 40 של הפתרון מניות 120 µL PBS. פצל את הפתרון מדולל שני צינורות microcentrifuge 1.5 mL כך כל שפופרת יש 80 µL.
  2. הוסף µL 16 מניות RGD פתרון (2.8 מ"מ, משלב 2.3) שפופרת אחת µL 16 מניות ציסטאין לפתרון (2.8 מ"מ, משלב 2.3) הצינור השני. מערבולת לערבב. במקום הפתרונות של פג-מאל-RGD או פג-מאל-CYS על הקרח עד לשימוש בשלב 3.9.
    הערה: ההליך כפי שמתואר כאן התשואות hydrogels עם ~ 140 מיקרומטר של פפטיד. . זה שווה ערך כ 1 מתוך כל הזרועות 8 פג זמין מלהיות כבוש עם פפטיד. זה יכולים להיות מגוונים על ידי שינוי היחס טוחנת של פפטידים המסתיימת בציסטאין לקבוצות maleimide זמין. באופן כללי, ריכוז מרבי של 280 מיקרומטר של פפטיד יכולה להיות מושגת תוך השארת עדיין מספקת מספר קבוצות maleimide זמין עבור הידרוג crosslinking.
  3. לדלל את פג-תיול מניות פתרון (50 מ"ג/מ"ל, משלב 2.2) 5 מ"ג/מ"ל על ידי ערבוב 4 µL של 50 מ"ג/מ"ל פתרון מניות עם µL 36 ל- PBS. הוסף µL 120 של מומס, thiolated HA מהשלב 2.1 לתערובת.
    הערה: הפתרונות של HMW חה הם מאוד צמיגה. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש micropipette רחב-דיזה עצה להעביר פתרונות. פיפטה לאט כדי להימנע פתרון נדבקות קירות micropipette עצה וכדי לשפר את דיוק המדידה.
  4. למקם את התבניות נקי, יבש (להכין בשלב 2.4) כל טוב של צלחת 12-ובכן שטופלו תרביות רקמה. משתמש נקי, בוטה סוף טיפ פיפטה, הקש את ג'ל עובש ואיטום שח כפול בין תבניות בתחתית הצלחת היטב.
    הערה: בודק את החותם שוב לפני כימוס למניעת דליפה.
  5. המעבר בתרבית תאים GBM, מביצועם לתאים בודדים, לקבוע ריכוז תא תיאר כאמור3.
    הערה: כמה שורות GBM לא יכול להיות חלופה מועדפת לתאים בודדים. במקרה זה, ניתן לכלול כל gliomaspheres. עם זאת, להכין הפומבית תאים בודדים לאחר תא מדויקים סופר לשיפור הפארמצבטית. הפרוטוקול עבור gliomasphere passaging משתנה בין מעבדות שונות, רבים מהם סביר תואם הידרוג אנקפסולציה.
    1. (מומלץ) צנטריפוגה gliomaspheres ב 500 g x עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע ולהוסיף 1 מ"ל של האנזים דיסוציאציה תא בגדר התא. לאחר מכן, תדגור במשך 5 דקות, בעדינות הקשה את הצינור כדי להתסיס
    2. להוסיף 4 מ של תרבות שלמה בינונית (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL הפארין, תוספת G21 ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב DMEM/F12) לתאים.
    3. צנטריפוגה שוב ב 500 g x עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. לבסוף resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של המדיום מלאה, עוברים תאים על תנאי דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. שטיפה (מומלץ) לשחזר מסננת עם אוטם 4 נוספים של המדיום מלאה כדי למקסם את מספר התאים.
  6. מעריכים את הריכוז של תאים ההשעיה באמצעות hemocytometer. פצל התליה תא 2 צינורות צנטריפוגה, איפה כל שפופרת מכיל תאים ~ 80,000. צנטריפוגה ב 500 g x עבור 5 דקות; באופן כללי, תאים 80,000 יפצה 2 80 µL hydrogels.
  7. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend גלולה אחת ב- 80 µL של פג-מאל-RGD פתרון, גלולה השני ב- 80 µL של פג-מאל-CYS פתרון (להכין בשלב 3.1).
  8. שימוש µL 200, wide-דיזה micropipette עצה, לוותר על µL 40 בפתרון HA (מתוך שלב 3.3 לעיל) לתוך כל עובש סיליקון גומי (כמו להכין בשלב 3.4).
  9. שימוש µL 200, wide-דיזה micropipette עצה, מערבבים את µL 40 של פג-מאל-CYS או פג-מאל-RGD פתרון תא עם הפתרון HA ב כייר. פיפטה למעלה ולמטה במהירות לא יותר מ 10 פעמים. חזור על כל תרבות ג'ל בהכנה.
    הערה: שלב זה דורש אימון, מאז gelation הראשונית מתרחשת במהירות (תוך 30 s). פיפטה מעלה ומטה תוך כדי תנועה הטיפ למיקומים שונים בתבניות כדי להבטיח אפילו ערבוב. שמור תמיד את הקצה מתחת למפלס נוזלי כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. לא לערבב יותר מדי פעמים כמו ג'ל יכול לקבל נוצר בתוך micropipette הפתרון עצה. פג-מאל-CYS ו- PEG-מאל-RGD יכול להיות משולב-יחסי בדרגות שונות כדי להשיג את הריכוז פפטיד RGD הרצוי.
  10. מקום טוב-הצלחת המכיל ג'ל-אנקפסולציה תאים לתוך חממה תרבות תא 37 ° C 5-10 דקות להבטיח השלמה של התגובה.
  11. להוסיף 2-2.5 מ של תרבות בינוני בכל טוב עם ג'לים במבנה תקין. השתמש סטרילי, 2 µL פיפטה עצה או מיקרו-מרית, להפריד בעדינות את התבנית ואת ג'ל. השתמש מלקחיים מראש מעוקרות להסרת העובש מהצלחת היטב. מקם את הצלחת טוב לחזור תא חממה (37 ° C ו- 5% CO2) עבור תרבות, ניסויים עתידיים.
    הערה: משוך כייר אנכית כלפי מעלה כדי למנוע פגיעה התרבויות ג'ל. באופן כללי, בינוני בתרבויות ג'ל יש להחליף כל 3-4 ימים. הקפידו לא תשאף hydrogels בעת הסרת בינוני. אם זו בעיה, אנו ממליצים להשתמש פיפטה של העברת פלסטיק. אם מתוכנן ביולומינסנציה הדמיה כדי לעקוב אחר מספר הטלפון הנייד, תאים GBM חייב להיות transduced עם lentivirus קידוד צורונים ביטוי לוציפראז לפני כימוס, כפי שתואר לעיל3. עבור ביולומינסנציה הדמיה, להוסיף 1 מ מ D-luciferin תרבות בינוני 1 h לפני הפריה חוץ גופית הדמיה.

4. lysate הכנה סופג המערבי

  1. מקררים 1.5 mL צינורות microcentrifuge על הקרח (1 לכל דגימות ג'ל). צנטריפוגה מגניב עד 4 ° C.
  2. הסר בינוני טוב צלחות. העברת ג'לים לתוך צינורות prechilled microcentrifuge.
  3. להוסיף 100 µL ריפה מאגר עם מעכבי פרוטאז/פוספטאז x 1.
  4. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 20 גרם, לשבור את הג'ל על ידי דחיפת התערובת כל דרך המחט לפחות 20 פעמים.
  5. פלאש ספין המדגם באמצעות microcentrifuge העליון ספסל ומקום הדגימה בחזרה על קרח.
  6. מערבולת דוגם בקצרה כל 5 דקות עבור סכום כולל של 20 דקות.
  7. צנטריפוגה דגימות ב 14000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
  8. תגובת שיקוע להעביר צינורות microcentrifuge חדש, צונן מראש ולאחסן ב-20 ° C (לטווח קצר) או ו-80 מעלות צלזיוס (לטווח ארוך). לבצע באמצעות הליכים סטנדרטיים, כמו שתואר לעיל3אלקטרופורזה בג'ל.

5. לחילוץ תאים בודדים מתרבויות הידרוג עבור Cytometry זרימה

  1. הסר בינוני והעברת תרבות ג'ל (מתוך שלב 3.11) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  2. דגירה ג'ל עם 500 µL של התא דיסוציאציה האנזים (למשל, TrypLE אקספרס) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מדי פעם להרים את הצינור כדי להתסיס.
  3. להעביר את התערובת לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל 5 מ של מדיום מלאה. מניחים את הצינורית על קרח.
  4. צרף מחט 20 גרם לתוך מזרק 10 מ"ל. משוך בעדינות את המתלים תא למעלה ולמטה דרך המחט 8 פעמים.
  5. לזרום את התערובת דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש. החל אוטם 5 נוספים של מדיום מלאה דרך מסננת כדי לאסוף את כל התאים הנותרים.
  6. Centrifuge הדגימה ב 400 x g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע resuspend בגדר במאגר הרצוי עבור cytometry זרימה (באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים3).

6. הקפאה קריוגנית של Hydrogels על חלוקתה

  1. הסר בינוני מתרבויות ג'ל (מתוך שלב 3.11).
  2. דגירה ג'ל תרבויות עם 2 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    התראה: PFA הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
  3. ביום הבא, להסיר מחברים. להוסיף 2 מיליליטר 5% סוכרוז ב- PBS ג'לים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  4. החלף 5% סוכרוז פתרון 2 מ של 20% סוכרוז ב- PBS, דגירה למשך 30 דקות.
  5. החלף סוכרוז פתרון 2 מ של סוכרוז 20% טרי ב- PBS, תקופת דגירה של 30 דקות נוספות.
  6. בפעם השלישית, החלף את הפתרון סוכרוז 2 מ של סוכרוז 20% טרי ב- PBS. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  7. להכין 20% סוכרוז במתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר).
    הערה: בגלל צמיגות של OCT, פירוק סוכרוז יכול לקחת קצת זמן (עד הלילה). אנו ממליצים לשים את התערובת על גבי מטרף במהלך פירוק כדי לשמור על עצבנות.
  8. למחרת, להסיר את הפתרון 20% סוכרוז, בעדינות שופכים את 20% סוכרוז בפתרון OCT הג'ל. הקפד לכסות את כל הג'ל. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  9. להעביר את הג'ל לתוך המרכז של תבנית להטבעה בעזרת מרית גדולה, שטוח; זה חייב להעשות בזהירות כדי למנוע נזק הג'ל.
  10. מגניב 2-methylbutane בפנים cryochamber עם עודף של קרח יבש.
  11. למלא את להטבעה OCT טהור (ללא סוכרוז). למלא כדי מתחת לקצה העליון של עובש.
  12. להקפיא את הדגימה הידרוג על ידי טבילה ב 2 מקורר-methylbutane והמשך ואז חלוקתה.
  13. סעיף המדגם באמצעות cryostat; סעיף עובי 10-18 מיקרומטר וטמפרטורה אופטים של-26 ° C מומלצים.
  14. לבצע הליכים סטנדרטיים immunostaining על ג'ל משרטוטי תרבות, כפי שתואר לעיל3.
    הערה: PFA ידוע מגרה, גורם מסרטן. בבקשה לטפל ולחסל מחברים לפי מקומית לתקנים ולתקנות.

7. מן דוגמאות הידרוג החילוץ RNA הכולל

הערה: כאן, אנו מתארים פרוטוקול באמצעות פרסומת קיט (ראה טבלה של החומרים) כדי לחלץ RNA הכולל מתאי הידרוג תרבותי. המאגרים כל החומר זמינים בתוך ערכת בשימוש.

  1. הסר את תרבות בינוני. השתמש פיפטה העברה של P1000 עם נשא רחב עצה להעביר את התרבות הידרוג לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  2. להוסיף 350 µL מאגר RLT התרבות הידרוג.
  3. באמצעות מחט 20 גרם המצורפת מזרק 1 מ"ל, לגרוס את הג'ל על ידי דחיפת התערובת כל דרך המחט לפחות 20 פעמים.
  4. להעביר את כל התערובת לתוך עמודה מהמגן הניח צינור אוסף 2 מ"ל. צנטריפוגה ב g x 13,000 למשך 2 דקות.
  5. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. להיזהר שלא להפריע את התמיסה ג'ל בחלק התחתון.
  6. מערבבים את הדגימה lysate עם 350 µL של 100% אתנול. העברת כל המדגם מקום בטור (הערכה) ספין בשפופרת אוסף 2 מ"ל. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 13,000 x g.
  7. עבור והשלבים לטיהור RNA עבור ה-PCR, לפי התקנון הכללי המסופקים על ידי היצרן קיט.
    הערה: לאחר ה-RNA מופק, פרוטוקולים סטנדרטיים עבור ה-PCR יכול לשמש.

תוצאות

עבור כל אצווה של thiolated HA, מידת thiolation צריך אפשרות לאמת באמצעות H1-NMR או הבדיקה של אלמן. חה שינוי באמצעות ההליך שמתואר כאן באופן עקבי יוצר thiolation ~ 5% (המוגדר כיחס טוחנת תיולים כדי HA disaccharides) (איור 1).

הגדרה זו פלטפורמ?...

Discussion

הדור של לשחזור נתונים באמצעות מערכת תלת-ממד תרבות זו דורשת: 1) עקבי thiolation אצווה-כדי-אצווה של HA, 2) תרגול כדי להשיג ערבוב של הידרוג מבשרי וטיפול יעיל של הידרוג תרבויות כדי למנוע נזק ו- 3) ממוטבים זריעה צפיפות עבור כל קו תא בשימוש.

כאשר אחוז משקל מסוים של HA היא הרצויה ב הידרוג, מידת t...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה במימון NIH (R21NS093199) ופרס של 3R UCLA קשת. תודתנו שנמנמתי ללכת למעבדה של ד ר הארלי קורנבלום למתן השורות תא HK301 ו- HK157. אנו מודים גם UCLA רקמות פתולוגיה הליבה מעבדה (TPCL) עבור cryosectioning, מתקן ליבה מתקדמות אור מיקרוסקופ/ספקטרוסקופיה (צדקה) ב קליפורניה Nanosystems המכון (CNSI) באוניברסיטת קליפורניה לשימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי, UCLA Crump המכון הדמיה מולקולרית באמצעות מערכת הדמיה IVIS, UCLA מולקולרית מכשור מרכז (MIC) למתן ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית, ו Cytometry Core זרימה של Jonsson מקיף סרטן מרכז (JCCC) באוניברסיטת קליפורניה על מתן אינסטרומנטציה עבור זרימת cytometry.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pH meterThermo FisherN/AAny pH meter that has pH 2-10 sensitivity
Stir plateThermo FisherN/AGeneral lab equipment
Erlenmeyer flask (125mL)Thermo FisherFB-501-125
dialysis tubesThermo Fisher21-152-14
2L polypropylene beakerThermo FisherS01916
sodium hyaluronanLifecoreHA700k-5500-750 kDa range
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)sigma aldrich130672-5G
Hydrochloric acid (HCl)Thermo FisherSA48-500
Sodium hydroxide (NaOH)Thermo FisherSS266-1
Cystamine dihydrochlorideThermo FisherAC111770250
Dithiolthreitol (DTT)Thermo FisherBP172-25
Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acidSigma AldrichD218200-1G
Deuterated water (deuterium oxide)Thermo FisherAC166301000
0.22µm vacuum driven filterCellTreat229706
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Hanks' balanced salt saline (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-arm-PEG-maleimideJenKem TechnologyA7029-1molecular weight around 20kDa
4-arm-PEG-thiolJenKem TechnologyA7039-1molecular weight around 20kDa
L-Cysteine sigma aldrichC7880-100G
RGD ECM mimetic peptideGenscript BiotechN/ACustom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated
silicone moldsSigma AldrichGBL664201-25EAUse razor blade to cut into single pieces
complete culture mediumVariousVariousDMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs
patient derived GBM cellN/AN/A
20G needleBD medical305175
1mL syringeThermo Fisher14-823-434
10mL syringeBD medical302995
RIPA BufferThermo FisherPI-89901
protease/phosphatase inhibitor mini tabletsigma aldrich5892970001
vortex shakerThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermo Fisher12604013
70µm cell strainerThermo Fisher22-363-548
ParaformaldehydeThermo FisherAC416785000Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4
D-sucroseThermo FisherBP220-1
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compoundThermo FisherNC9373881
Cell culture incubatorThermo FisherN/AAny General One with 5% CO2 and 37C
fridge/freezerThermo FisherN/AAny General Lab equipment with -20C and -80C capacity
Disposable embedding moldsThermo Fisher12-20
LyapholizerLabconcoN/AAny -105C freeze dryers
HEPESThermo FisherBP310-500
Amber vialKimble Chase60912D-2
Wide orifice pipette tipsThermo Fisher9405120
2-methylbutaneThermo Fisher03551-4
Dry IceN/AN/A

References

  1. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. . Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
  2. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  3. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  5. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
  6. Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
  7. Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
  8. Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
  9. Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
  10. Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
  11. Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
  12. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  13. Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
  14. Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
  15. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
  16. Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
  17. Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
  18. Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
  19. Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
  20. Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
  21. Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  24. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  25. Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
  26. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  27. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  28. Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
  29. Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
  30. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
  31. Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
  32. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138microenvironmentbiomaterialmechanobiology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved