A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה נועד לתאר hepatocyte חזירי בידוד ו- ex-vivo המסירה הגן כדי לרפא את הדגמים של מחלות מטבוליות באמצעות השתלת תאים עצמיים. אף על פי המודל הזה נהנה יתרונות ייחודיים לטובת טיפול מוצלח, היישום הוא בסיס רלוונטי להתייחס אינדיקציות ומחלות נוספות.
ריפוי גנטי הוא הבחירה האידיאלית כדי לרפא הרבה שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד. לשעבר-vivo, וקטורים lentiviral השתמשו בהצלחה בטיפול של מחלות רבות hematopoietic בבני אדם, כמו השימוש שלהם מציע ביטוי transgene יציבה בשל היכולת של וקטור לשלב לתוך הגנום המארח. שיטה זו ממחישה את היישום של ex-vivo טיפול גנטי של hepatocytes למודל בעלי חיים גדולים מסוג tyrosinemia תורשתי אני. תהליך זה מורכב 1) בידוד של ראשי hepatocytes מן החיה תורם עצמיים/נמען, 2) ex-vivo המסירה הגן באמצעות התמרה חושית hepatocyte עם וקטור lentiviral, 3) עצמיים השתלת hepatocytes המתוקן באמצעות הפורטל הווריד הזרקה. ההצלחה של השיטה מתבססת בדרך כלל הסרת יעיל וסטרילי ההסרה בכבד, זהיר של הדגימה נכרת עבור בידוד של קיימא hepatocytes מספיק עבור התמרה חושית מחדש engrafting, אחוז גבוהה של תאים מבודדים, ו אספטי ניתוחים בכל כדי למנוע זיהום. תקלה טכנית באחד השלבים הבאים יביא תשואה נמוכה של קיימא transduced hepatocytes להשתלה עצמיים או זיהום של החיה תורם/נמען. הדגם חזיר של האדם סוג 1 תורשתי tyrosinemia (HT-1) עבור גישה זו היא נוטה באופן ייחודי, השיטה כפי אפילו אחוז קטן של engraftment של תאים המתוקן יוביל איכלוס של הכבד עם תאים בריאים המבוססת על רב עוצמה יתרון סלקטיבי hepatocytes מקורי-חולה. למרות בחירה צמיחה זו לא יהיה נכון לגבי כל הסימנים, גישה זו היא קרן להרחבת לתוך אינדיקציות אחרות, מאפשרת תמרון של סביבה זו כדי לטפל במחלות נוספות, שניהם בתוך הכבד, ומעבר, בעוד שליטה חשיפה וקטור ויראלי והזדמנות רעילות את המטרה, tumorigenicity.
שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד הם משפחה של מחלות גנטיות המשפיעות באופן קולקטיבי רבים כמו לידות חי 1 ב 8001. רבים של מחלות אלו יכולים להירפא באופן פונקציונלי על ידי החדרת המתוקן עותק יחיד של הגן המושפעת לתוך מספר מספיק של hepatocytes3הינם פגמים גנטית יחיד2 . אחוז hepatocytes זה דורש תיקון בפועל משתנה לפי המחלה4 והיא תלויה במידה רבה על האופי של החלבון שזה מקודד, לדוגמה, חלבונים הנמצאות מופרש לעומת cytoplasmic. ברוב המקרים, היעילות של כל טיפול למחלה מטבולית לבדיקה בקלות באמצעות הנוכחות של סמנים לעיתים קרובות זמינים במחזור.
HT-1 הוא שגיאה מולדת של חילוף החומרים של הכבד, תוצאה של פגם fumarylacetoacetate ההידרולז (FAH)5, השלב האחרון אנזימטי של טירוזין חילוף החומרים6. FAH לקוי מוביל לבנות של מטבוליטים רעילים בכבד יכול לגרום אי ספיקת כבד חריפה ומוות או בצורה כרונית של המחלה יכולה לגרום שחמת של hepatocellular קרצינומה. המחלה קלינית מנוהלת על ידי הממשל של 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), מעכב מולקולה קטנה של אנזים במעלה הזרם של FAH בחילוף החומרים טירוזין. המחלה מספק סביבה אידיאלית בו לבדוק שיטות טיפול גנטי, כמו תיקון מוצלח של אפילו מספר קטן של hepatocytes יביא בסופו של דבר איכלוס של הכבד כולו עם תאים המתוקן במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים 7 , 8. מצב זה מתרחש מאחר לתקן תאים יש יתרון הישרדות עמוקה על תאים שלא תוקנו בשל הצטברות מטבוליטים רעילים בחודש האחרון. אובדן hepatocytes שלא תוקנו מאפשר הרחבת סלקטיבי hepatocytes המתוקן בקנה אחד עם יכולת ההתחדשות של הכבד. הטיפול ניתן בעקבות בקלות על ידי מדידת הירידה במחזור טירוזין ורמות succinylacetone בעקבות השתלת.
כדי להצדיק את העיקרון החודרני של ההליך, הכוללת של hepatectomy חלקית, המטרה של גישה זו להיות תרופה עמיד. לכן, משמשים וקטורים lentiviral חסרי יכולת השכפול כי הם ישתלבו stably לתוך הגנום hepatocyte9. להבטיח משלוח של הגן המתוקן על כל התאים הבת כמו הכבד גדל ומרחיב כדי להחליף את אובדן מהיר של תאים שלא תוקנו. זה יתרון על וקטורים (AAV) ויראלי adeno הקשורים, אשר קיימים בעיקר episomes כי רק ניתן להעביר לתא הבת יחיד במהלך מיטוזה10 ובכך מאבד כל השפעה של הטיפול תוך מספר שבועות.
אף גוף גדל והולך של ספרות תומך הבטיחות של lentivirus11, חששות מעל genotoxic אירועים הם חמאני להגביל את התמרה חושית של המארח לתאים סביבה מבוקרת במבחנה . וקטור בחינם הוא הציג לעולם מערכתית למחשב המארח, כאשר מבוצע בשיטה זו, הגבלת החשיפה hepatocytes זה יהיה יוצג מחדש עם השתלת עצמיים דרך וריד שער הכבד.
הדו ח מתאר את שיטת הניתוח ואת שמחוץ הליכים המשמשים כדי לבודד hepatocytes עבור ג'ין טיפול ex-vivo ו עוקבות עצמיים השתלת12 לטיפול של חזיר HT-18. התהליך המלא כולל 1) hepatectomy חלקית, המשמשת מקור hepatocytes ו גירוי לצמיחה עבור הכבד של המחשב המארח, 2) בידוד של hepatocytes מהכבד נכרת ואחריו שמחוץ ג'ין תיקון, ולבסוף 3) בעלי חיים לטבע של hepatocytes המתוקן בחזרה לתוך המחשב המארח. השיטה המתוארת החלים על כל הדגמים בעלי חיים גדולים עם כמה שינויים, אבל היתרון של הסביבה סלקטיבית עבור hepatocytes המתוקן יהיה רק FAH לקויה חזיר13 .
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המוסדיים הנחיות, ולא היו שנסקרו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) לפני לימוד התנהגות. בהליכים המתוארים כאן בוצעו על זכר ונקבה החווה לבן גדול חזירים (50% לבן גדול Landrace/50% הרקע הגנטי) למעלה 3 חודשים של גיל זה נחשבים בריא ומתאים לניתוח. חיות שוכנות חברתית אלא אם כן נחשב לא תואם על ידי צוות וטרינרי מוסדיים. בעלי חיים ניזונים רמות המתאים של צ'או פעמיים יומי ולא נצפתה סימנים קליניים על ידי צוות טיפול לפחות פעם ביום.
1. הכנה לניתוח
2. לפרוסקופיה Hepatectomy חלקית
3. hepatocyte בידוד
4. התמרה חושית hepatocyte
5. השתלת hepatocyte
6. לאחר הניתוח לשחזור ותחזוקה
7. מתכונים
מגיב | HWM | מגיב | לכל אני (10 x) | לכל II (10 x) |
וויליאמס-E אבקת (g/L) | 10.8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
NaHCO3 (g/L) | 2.2 | אשלגן כלורי (g/L) | 5 | 5 |
HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
עט/דלקת (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (g/L) | 9.5 | - |
סרום שור עוברית (mL/L) | 100 | N-acetyl-L-ציסטאין | 8 | 8 |
ה-pH | 7.3 | (N-A-C, g/L) | ||
ניטרוגליצרין (mL/L) | 5 | 5 | ||
2 H2 CaCl2O (g/L) | - | 7 | ||
Collagenase D (mg/mL) | - | 0.2 | ||
ה-pH | 7.4 | 7.6 |
טבלה 1: מתכונים פתרונות בשימוש בבידוד Hepatocyte ממקטעים בכבד.
כריתה כבד והשתלות עצמיים מיוצגים סכמטי באיור1. במדגם מייצג של חזירים 5 שעברו כריתה הכבד, רובם היו תשואות של > עונה 1 פרק 109 hepatocytes כ 80% פנוי (טבלה 2), מספק אפשרויות רבות של תאים עבור כל סוג של הצורך מניפולציות, כולל גנים טיפול. תרבות עוקבות של מושת?...
הדו ח מתאר שמחוץ ג'ין עצמיים טיפול בגישה לרפא מודל חזירי של HT-1. זה כרוך hepatectomy חלקית, ואחריו שמחוץ hepatocyte בידוד, התמרה חושית של hepatocytes מבודד עם וירוס lenti נושאת את transgene מתקנת. המתוקן hepatocytes עצמיים מושתלים ואז לחזור החיה לקוי FAH דרך וריד שער8. השיטה המתוארת אמנם החלים על כל ה...
המחברים אין לחשוף.
המחברים מודים דוויין Meixner על מומחיות בביצוע את הזרקת וריד שער הכבד, סטיב Krage, ג'ואן פדרסון, לורי Hillin לתמיכה במהלך הניתוחים. עבודה זו נתמכה על ידי בית החולים של מינסוטה קרן של הילדים רפואה רגנרטיבית מינסוטה. R.D.H. מומן באמצעות פרס NIH K01 DK106056, מרכז מרפאת מאיו פרס פיתוח הקריירה רפואה רגנרטיבית.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
0 PDS | Ethicon | Z340H | |
2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
(N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved