Lentiviral בתיווך וקטור ריפוי גנטי של Hepatocytes לשעבר Vivo עבור השתלת עצמיים של החזירים

Summary

פרוטוקול זה נועד לתאר hepatocyte חזירי בידוד ו- ex-vivo המסירה הגן כדי לרפא את הדגמים של מחלות מטבוליות באמצעות השתלת תאים עצמיים. אף על פי המודל הזה נהנה יתרונות ייחודיים לטובת טיפול מוצלח, היישום הוא בסיס רלוונטי להתייחס אינדיקציות ומחלות נוספות.

Abstract

ריפוי גנטי הוא הבחירה האידיאלית כדי לרפא הרבה שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד. לשעבר-vivo, וקטורים lentiviral השתמשו בהצלחה בטיפול של מחלות רבות hematopoietic בבני אדם, כמו השימוש שלהם מציע ביטוי transgene יציבה בשל היכולת של וקטור לשלב לתוך הגנום המארח. שיטה זו ממחישה את היישום של ex-vivo טיפול גנטי של hepatocytes למודל בעלי חיים גדולים מסוג tyrosinemia תורשתי אני. תהליך זה מורכב 1) בידוד של ראשי hepatocytes מן החיה תורם עצמיים/נמען, 2) ex-vivo המסירה הגן באמצעות התמרה חושית hepatocyte עם וקטור lentiviral, 3) עצמיים השתלת hepatocytes המתוקן באמצעות הפורטל הווריד הזרקה. ההצלחה של השיטה מתבססת בדרך כלל הסרת יעיל וסטרילי ההסרה בכבד, זהיר של הדגימה נכרת עבור בידוד של קיימא hepatocytes מספיק עבור התמרה חושית מחדש engrafting, אחוז גבוהה של תאים מבודדים, ו אספטי ניתוחים בכל כדי למנוע זיהום. תקלה טכנית באחד השלבים הבאים יביא תשואה נמוכה של קיימא transduced hepatocytes להשתלה עצמיים או זיהום של החיה תורם/נמען. הדגם חזיר של האדם סוג 1 תורשתי tyrosinemia (HT-1) עבור גישה זו היא נוטה באופן ייחודי, השיטה כפי אפילו אחוז קטן של engraftment של תאים המתוקן יוביל איכלוס של הכבד עם תאים בריאים המבוססת על רב עוצמה יתרון סלקטיבי hepatocytes מקורי-חולה. למרות בחירה צמיחה זו לא יהיה נכון לגבי כל הסימנים, גישה זו היא קרן להרחבת לתוך אינדיקציות אחרות, מאפשרת תמרון של סביבה זו כדי לטפל במחלות נוספות, שניהם בתוך הכבד, ומעבר, בעוד שליטה חשיפה וקטור ויראלי והזדמנות רעילות את המטרה, tumorigenicity.

Introduction

שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד הם משפחה של מחלות גנטיות המשפיעות באופן קולקטיבי רבים כמו לידות חי 1 ב 800¹. רבים של מחלות אלו יכולים להירפא באופן פונקציונלי על ידי החדרת המתוקן עותק יחיד של הגן המושפעת לתוך מספר מספיק של hepatocytes³הינם פגמים גנטית יחיד² . אחוז hepatocytes זה דורש תיקון בפועל משתנה לפי המחלה⁴ והיא תלויה במידה רבה על האופי של החלבון שזה מקודד, לדוגמה, חלבונים הנמצאות מופרש לעומת cytoplasmic. ברוב המקרים, היעילות של כל טיפול למחלה מטבולית לבדיקה בקלות באמצעות הנוכחות של סמנים לעיתים קרובות זמינים במחזור.

HT-1 הוא שגיאה מולדת של חילוף החומרים של הכבד, תוצאה של פגם fumarylacetoacetate ההידרולז (FAH)⁵, השלב האחרון אנזימטי של טירוזין חילוף החומרים⁶. FAH לקוי מוביל לבנות של מטבוליטים רעילים בכבד יכול לגרום אי ספיקת כבד חריפה ומוות או בצורה כרונית של המחלה יכולה לגרום שחמת של hepatocellular קרצינומה. המחלה קלינית מנוהלת על ידי הממשל של 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), מעכב מולקולה קטנה של אנזים במעלה הזרם של FAH בחילוף החומרים טירוזין. המחלה מספק סביבה אידיאלית בו לבדוק שיטות טיפול גנטי, כמו תיקון מוצלח של אפילו מספר קטן של hepatocytes יביא בסופו של דבר איכלוס של הכבד כולו עם תאים המתוקן במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים ^{7 , 8}. מצב זה מתרחש מאחר לתקן תאים יש יתרון הישרדות עמוקה על תאים שלא תוקנו בשל הצטברות מטבוליטים רעילים בחודש האחרון. אובדן hepatocytes שלא תוקנו מאפשר הרחבת סלקטיבי hepatocytes המתוקן בקנה אחד עם יכולת ההתחדשות של הכבד. הטיפול ניתן בעקבות בקלות על ידי מדידת הירידה במחזור טירוזין ורמות succinylacetone בעקבות השתלת.

כדי להצדיק את העיקרון החודרני של ההליך, הכוללת של hepatectomy חלקית, המטרה של גישה זו להיות תרופה עמיד. לכן, משמשים וקטורים lentiviral חסרי יכולת השכפול כי הם ישתלבו stably לתוך הגנום hepatocyte⁹. להבטיח משלוח של הגן המתוקן על כל התאים הבת כמו הכבד גדל ומרחיב כדי להחליף את אובדן מהיר של תאים שלא תוקנו. זה יתרון על וקטורים (AAV) ויראלי adeno הקשורים, אשר קיימים בעיקר episomes כי רק ניתן להעביר לתא הבת יחיד במהלך מיטוזה¹⁰ ובכך מאבד כל השפעה של הטיפול תוך מספר שבועות.

אף גוף גדל והולך של ספרות תומך הבטיחות של lentivirus¹¹, חששות מעל genotoxic אירועים הם חמאני להגביל את התמרה חושית של המארח לתאים סביבה מבוקרת במבחנה . וקטור בחינם הוא הציג לעולם מערכתית למחשב המארח, כאשר מבוצע בשיטה זו, הגבלת החשיפה hepatocytes זה יהיה יוצג מחדש עם השתלת עצמיים דרך וריד שער הכבד.

הדו ח מתאר את שיטת הניתוח ואת שמחוץ הליכים המשמשים כדי לבודד hepatocytes עבור ג'ין טיפול ex-vivo ו עוקבות עצמיים השתלת¹² לטיפול של חזיר HT-1⁸. התהליך המלא כולל 1) hepatectomy חלקית, המשמשת מקור hepatocytes ו גירוי לצמיחה עבור הכבד של המחשב המארח, 2) בידוד של hepatocytes מהכבד נכרת ואחריו שמחוץ ג'ין תיקון, ולבסוף 3) בעלי חיים לטבע של hepatocytes המתוקן בחזרה לתוך המחשב המארח. השיטה המתוארת החלים על כל הדגמים בעלי חיים גדולים עם כמה שינויים, אבל היתרון של הסביבה סלקטיבית עבור hepatocytes המתוקן יהיה רק FAH לקויה חזיר¹³ .

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המוסדיים הנחיות, ולא היו שנסקרו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) לפני לימוד התנהגות. בהליכים המתוארים כאן בוצעו על זכר ונקבה החווה לבן גדול חזירים (50% לבן גדול Landrace/50% הרקע הגנטי) למעלה 3 חודשים של גיל זה נחשבים בריא ומתאים לניתוח.  חיות שוכנות חברתית אלא אם כן נחשב לא תואם על ידי צוות וטרינרי מוסדיים.  בעלי חיים ניזונים רמות המתאים של צ'או פעמיים יומי ולא נצפתה סימנים קליניים על ידי צוות טיפול לפחות פעם ביום.

1. הכנה לניתוח

1. לנהל telazol 5 מ"ג/ק"ג ו- 2 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים intramuscularly לזירוז הרגעה. לנהל הבופרנורפין SR subcutaneously במינון של 0.18 mg/kg על שיכוך כאבים לאחר הניתוח (הצפוי שיכוך כאבים של מינון זה יהיה עד 72 שעות). בדוק באופן ידני את החיה של תגובות לוודא הרגעה.
2. ברגע מטושטשת, הכנס של קטטר תוך ורידי לתוך הווריד האוזן היקפיים לגישה תרופתי.
3. לנהל תוך ורידי 25 מ"ג/ק"ג צפאזולין, ו שרירית 5 מ"ג/ק"ג של ceftiofur אולטרסאונד.
   1. לנהל תמיסת מלח דרך הווריד כדי לשמור על לחץ הדם וקצב הלב בגבולות הנורמה הפיזיולוגיות לאורך כל ההליך.
4. המקום הזונדה להורדת הלחץ בבטן. לבצע צנרור אנדוטרכאליות עם צינור אנדוטרכאליות בגודל מתאים ודא השמה נכונה על-ידי דחיסת החזה באופן ידני כדי לזהות נשיפה, ואז מכנית לאוורר את החיה עם 1-3% איזופלוריין.
5. הניחו שלהם הוא, לדוגמה, הפניות רל (א), לחץ דם השרוול, רגש טמפרטורה, ואת -אוקסימטר אל צג ולהקליט סימנים חיוניים. מקם את החיה במצב פרקדן, לשפשף את הבטן של כלוב הצלעות כדי האגן עם betadine ולאחר לעטוף sterilely.
6. לאוורר את הנושא עם 1-3% איזופלוריין במהלך ההליך כדי לשמור על מטוס כירורגי של הרדמה. להמשיך לעקוב סימנים חיוניים עבור שינויים ולהתאים איזופלוריין בהתאם כדי לשמור על קצב הלב ברמות החתך מראש אם לחץ הדם טיפות להפחית איזופלוריין באופן דרמטי, וליזום כמוסד שאושרו על-ידי סוכנים כדי לשחזר את חיוניות, כגון אפינפרין תוך ורידי.
   1. להקליט את קצב הלב, קצב הנשימה, לחץ הדם, טמפרטורת הגוף על תקליט הליך כירורגי כדי לעקוב אחר לשמור על רווחת בעלי חיים לפי המדיניות ספציפיים מוסד כדי להבטיח תאימות לתקני רווחת בעלי חיים גדולים.

2. לפרוסקופיה Hepatectomy חלקית

1. לבצע היציאה הראשונית האתר כניסה באמצעות טכניקת חסן כותב פתוח cephalad הטבור. כאשר הצפק הוא מדמיין, בבטחה להציג נקז 12 מ מ לתוך חלל הבטן. עוברים 5 מ מ, 30 מעלות, היקף דרך יציאה זו.
2. Insufflate את הבטן עם CO₂ ל 15 מ מ כספית. תחת פריט חזותי ישיר עם המצלמה לפרוסקופיה, במקום שתי יציאות נוספות 5 מ מ. מאתרת על לרוחב האונה השמאלית של הכבד. למיקום המדויק של היציאות תלוי גודל של האנטומיה של החיה.
   1. בשלב זה, הנח את לפרוסקופיה, חזיון הבטן באחד הנמלים 5 מ מ.
3. לזהות על קטע הלטראלי השמאלי של הכבד בביצוע פיסורה העיקריים של האונה השמאלית. הבקע הזה מפריד רפואי וקטעים הלטראלי השמאלי. לאבטח את מבנה הפורטל יחד עם וריד הכבד לאורך הבקע הזה באמצעות שדכן כירורגי (ראה טבלה של חומרים). Transect parenchyma דרך הבקע הזה באמצעות פיטורים רציפים של השדכן באמצעות 60, 45 או המון זמן וסקולרית 30 מ מ.
   1. עם השלמת כריתה parenchymal, להעריך את הכבד שריד כדי להבטיח hemostasis נאותה. לשלוט בכל לדמם parenchyma עורק דופן בית או תפר.
4. אחזר המקטע בכבד באמצעות תופסנים על אנדוסקופי ותיק אחזור רקמות אנדוסקופי.
5. הסר את היציאות וסגור החתך יציאה 12 מ"מ שלוש שכבות קטעה גודל 0 בתפר fascia קו האמצע, בתפר 2-0 פועל עבור שכבת הדרמיס עמוק, בתפר 4-0 פועל עבור השכבה subcuticular. היציאות 5 מ מ עשוי להיסגר בשכבה אחת עם 2-0.
6. במקום ההלבשה סטרילי על החתכים (ראה טבלה של חומרים).
7. כאשר התאים יהיה מוכן תוך פחות מ 4 שעות, לשמור על החיות תחת הרדמה כללית וכאב לאחר הניתוח עד autotransplantation.
8. לחלופין, אם התא מניפולציות מחייבים תקופות ארוכות יותר (כגון לאפשר היווצרות hepatocyte spheroids או פרקי זמן ממושכים התמרה חושית/בחירה המבוססת על יישומים נפרדים של שיטה זו) לאפשר החיה להתאושש הרדמה, חזור אינדוקציה הרדמה צעדים לפני autotransplantation כאשר התאים מוכנים.

3. hepatocyte בידוד

1. לחבר משאבה סחרור עם זלוף לספק פתרונות פיזור חמים (בהשתתפות 43 מעלות צלזיוס המים הרותחים) קטטרים להציב כלי נחשף גדול של המקטע בכבד, כך הטמפרטורה הפתרון הוא 38 ° C על מבוא הרקמה. כל צינורות, ציוד ופתרונות חייבת להישמר סטרילי כדי להבטיח שהתאים מתאימים השתלת.
   1. פריים את המשאבה ואת אבובים עם לאדם השני עד צימוד ממוצבת כדי לעבור בין לכל, ואני השני לכל משלוח אל הרקמה. לעבור את צימוד פי למקם ואני פריים שאר הסט אבובים, מילוי מלכודת בועות בשורה לחלוטין למניעת החדרת אוויר בועות לתוך הרקמה.
2. היכון של רוחבי נקי בניצב לחתוך את זרימת הדם הכבד כדי לחשוף את חתכי רוחב של ענפי וריד שער הכבד, ולשננו הוורידים עבור צנתור.
3. Catheterize הורידים חשופים הזמינים עם קטטר צמוד-הולם כדי למנוע דליפה של perfusate. נקרר פורטל לפחות 1 ו- 1 וריד הכבד כדי להבטיח זלוף נאותה של הרקמה.
   1. ודא catheter(s) טענתי/ללא אוויר לפני הצנתר לתוך הווריד.
4. Perfuse חם לכל אני ב- 100 מ ל/דקה, העברת הצינור לשקע וריד ווריד כל 30 שניות מינימלית 1 מחזור בעורקים זמינים כל 15-20 דקות. במהלך לכל אני אינפוזיה, הגדר של צינור הפינוי לרוקן את המגש הליך לתוך מיכל פסולת תחת ואקום.
5. לעבור לאדם השני ב- 100 מ ל/דקה, רכיבה על אופניים דרך העורקים כמו עם לאדם, עבור סכום כולל של 30 דקות. לפי השנייה, להשתמש משאבה חזרה למחזר לכל II חזרה למאגר המים עבור ניהול מחדש לשמר את ההכנה של האנזים פעיל. מוגדר פחות המשאבה יצוא המשאבה ההחזרה (קרי, 94 mL/min), נזהר שלא לחזור אוויר הבקבוק מקור.
   1. אם הקפסולה בכבד נשברת, הזמן הזה יכול להיות מופחת.
   2. אם הכבד אינו מתעכל באופן מלא (לא נותר גומות עם מוקד לחץ עדין) 5 דקות נוספות של זלוף יכול להתבצע.
6. מדי פעם (בערך כל 5 דקות) לתעד את טמפרטורת פני השטח מלכודת בועות ו/או הכבד על מנת להבטיח hepatocytes לא מתקררים. אם הכבד מתקררת (< 35 ° C) להגביר את החום של האמבט במים כדי לשחזר את טמפרטורת הכבד קרוב 38 מעלות צלזיוס. הכבד צריך בלאנש כפי זלוף התמורה.
7. הסר את הכבד צלחת סטרילי או צלחת פטרי להובלה בתא המנוע תרבות. שער שדה סטרילי עם תלוי סטרילי כדי לשמור על תקינות במהלך עיבוד hepatocyte.
8. לחשוף את הקטע הכבד מאסו סטרילי ויציפו את הכבד עם hepatocyte קר שטיפת המדיה (HWM). לשבש את הקפסולה על-ידי גרירת מספריים לרוחב חלקו העליון. לובש כפפות סטריליות, לעסות בעדינות את הכבד לשחרר את hepatocytes לתוך האמצעי.
9. לסנן את HWM המכיל hepatocytes דרך גזה סטרילית לתוך בקבוקים צנטריפוגה גדולים (~ 200 מ"ל). לשטוף את hepatocytes באמצעות ההליך הבא שהפקידים, שילוב בגדר תא מן הבקבוקים מרובות לאחר resuspension הראשון (לפי הצורך):
   1. צנטריפוגה 50 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס.
   2. מחוק לגמרי, resuspend ב 150 מ ל HWM.
   3. השאירו את צניפה HWM לאחר לשטוף את 3^rd .
10. ספירת תאים ריכוז באמצעות hemocytometer או התקן אחר, זמינות. תאים אלה מוכנים עכשיו שמחוץ מניפולציה של עניין, כולל ריפוי גנטי, תאי מיון או לוליק-לפני autotransplantation. הנפח הסופי של HWM יכול להיות מותאם למטרה ריכוז מסוים (תאים/mL).

4. התמרה חושית hepatocyte

1. Resuspend hepatocytes בתקשורת (של Dulbecco איגל ששונה בינונית [DMEM], 10% סרום שור בעובר [FBS], פניצילין-סטרפטומיצין, 4 חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic [HEPES], דקסאמתאזון, גורם הגדילה באפידרמיס [EGF], ו- NTBC)-1-2 מיליון תאים לכל mL בשפופרת חרוט על קרח.
2. הפשרת וקטור lentiviral בטמפרטורת החדר ומוסיפים צינור חרוט על הקרח-ריבוי 20 היעד של זיהום (MOI) כדי לאגד את התאים. לסובב תאים ב 4 ° C ב- rpm 10 במשך 90 דקות לאגד את וקטור ויראלי פני השטח של התא.
3. העברת צינורות 37 מעלות צלזיוס במשך 30-40 דק ' היפוך ' כדי לערבב כל 5 דקות כדי להקל על וקטור transducing התאים מאוגד.
4. צנטריפוגה תאים ב g x 50 ב 4 ° C עבור 4 דק Resuspend תא צניפה בתוך תמיסת מלח-ריכוז הרצוי על קרח. חזור על זה לשטוף כדי להבטיח הסרה של כל וקטור לא מאוגד משלב הכנת.
5. במידת האפשר, צלחת aliquots מספקת של תאים (קרי, 500,000 תאים לכל טוב ב 6 טוב תא תרבות צלחת) לבדיקת הכדאיות, הדבקות, התמרה חושית יעילות, וכו '
   הערה: אפשרי לעתים קרובות לא להעריך את הפרמטרים האלה לפני autotransplantation, במיוחד עבור שגרות באותו יום. לדוגמה, ההליך המתואר במסמך זה מועסקים של cDNA Fah לא מתויגות תחת השליטה של אלפא-1 antitrypsin הכבד ספציפיים ייצוג המקדם, אשר לא היה ברצון assayable ב hepatocytes לפני השתלת. עם זאת, תאים מצופים אלה יכולים להיות לבדיקה מיד לאחר autotransplantation כמחוון של ההצלחה של התמרה חושית (קרי, דרך סופג המערבי) או מנבא ההצלחה הכללי של ההליך.

5. השתלת hepatocyte

1. לזהות את וריד שער הכבד באמצעות אולטרסאונד באמצעות מתמר 2 עד 5 מגה-הרץ. ישירה של 18 גרם, 5 אינץ ' המחט לכיוון הראשי וריד שער הכבד proximal כדי שלו נגע הסתעפות.
2. להתחיל אינפוזיה ידני איטי של למעלה hepatocytes⁹ 1 x 10 (כ- 10 גרם) באמצעות מזרק. נטר פורטל לחצים במהלך ההשתלה באמצעות קטטר אינפוזיה.
   1. אם לחצים בפורטל להגדיל יותר מ- 8 מ מ כספית מעל הבסיס, להשהות אינפוזיה ולאפשר את הלחץ לחזור אל רמות הבסיס.
   2. אם לחצים הפורטל לא לחזור בסיסית לאחר השהיה אינפוזיה במשך חמש דקות, להפסיק את העירוי.
3. לאחר השתלת הסרת קטטר, להשתמש באולטרסאונד הערכת לנוכחות של אירועים קדחת ולהעביר זרימת וריד שער הכבד.

6. לאחר הניתוח לשחזור ותחזוקה

1. להעביר על אזור התאוששות נאותה ולבחון עד בעל-החיים באופן מלא אמבולטורי, ניטור קצב הלב, חמצן, טמפרטורת הגוף כל 15-30 דק. שמור על טמפרטורת הגוף עם שמיכות חמות או גלישת אוויר מחומם, לפי הצורך.
2. לנהל ממנהל המזון 1 מ"ג/ק"ג דרך הפה מדי יום (עד סוף המחקר) כדי להקטין את הסיכויים של כיבי קיבה יכול להתרחש עם התקפי inappetence.
3. במשככי, החיה מתבצע פיקוח הדוק על ידי מעבדה וצוות וטרינרי, בדרך כלל אינו מצריך משכחי כאבים נוספים נפרד מן המינון הבופרנורפין שטרם-נותחו.  אם סימנים של מצוקה/כאב הם נצפו על ידי צוות מוסמך טיפול וטרינרי (חתך שמירה, inappetence, עייפות), יכול להיות מנוהל סוכנים אנטי דלקתית (קרי: Carprofen).

7. מתכונים

1. ראה טבלה 1 מתכונים בשימוש בפרוטוקול זה.

מגיב	HWM	מגיב	לכל אני (10 x)	לכל II (10 x)
וויליאמס-E אבקת (g/L)	10.8	NaCl (g/L)	83	39
NaHCO3 (g/L)	2.2	אשלגן כלורי (g/L)	5	5
HEPES (g/L)	2.6	HEPES (g/L)	24	240
עט/דלקת (100 x, mL/L)	10	EGTA (g/L)	9.5	-
סרום שור עוברית (mL/L)	100	N-acetyl-L-ציסטאין	8	8
ה-pH	7.3	(N-A-C, g/L)
		ניטרוגליצרין (mL/L)	5	5
		2 H2 CaCl2O (g/L)	-	7
		Collagenase D (mg/mL)	-	0.2
		ה-pH	7.4	7.6

טבלה 1: מתכונים פתרונות בשימוש בבידוד Hepatocyte ממקטעים בכבד.

תוצאות

כריתה כבד והשתלות עצמיים מיוצגים סכמטי באיור1. במדגם מייצג של חזירים 5 שעברו כריתה הכבד, רובם היו תשואות של > עונה 1 פרק 10⁹ hepatocytes כ 80% פנוי (טבלה 2), מספק אפשרויות רבות של תאים עבור כל סוג של הצורך מניפולציות, כולל גנים טיפול. תרבות עוקבות של מושת?...

Discussion

הדו ח מתאר שמחוץ ג'ין עצמיים טיפול בגישה לרפא מודל חזירי של HT-1. זה כרוך hepatectomy חלקית, ואחריו שמחוץ hepatocyte בידוד, התמרה חושית של hepatocytes מבודד עם וירוס lenti נושאת את transgene מתקנת. המתוקן hepatocytes עצמיים מושתלים ואז לחזור החיה לקוי FAH דרך וריד שער⁸. השיטה המתוארת אמנם החלים על כל ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314