A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.
מערכים microelectrode (אותי) נמצאים בשימוש נרחב לימודים תפקוד במבחנה. מכשירים אלו מאפשרים בו-זמניות פולשני הקלטה/גירוי של פעילות אלקטרופיזיולוגיות לתקופות ארוכות. עם זאת, המאפיין של חישה אותות מכל המקורות סביב כל microelectrode יכול להיות שלילי כאשר מנסים להבין תקשורת, אות התפשטות מעגלים עצביים. ברשת העצבית, מספר הנוירונים ניתן להפעיל בעת ובעונה אחת, ניתן ליצור פוטנציאל פעולה חופפים, ומקשה להפלות ולעקוב אחר התפשטות אות. בהתחשב מגבלה זו, הקמנו במבחנה התקנה התמקדו הערכת אלקטרופיזיולוגיות תקשורת, אשר מסוגל לבודד ומגבירים אותות עצב עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאת התממשקות והתקנים microfluidic אותי, אנחנו יכולים להפריד תרבויות עצביים עם יישור ומבוקרות היטב של אקסונים ו- microelectrodes. התקנה זו מאפשרת הקלטות של ספייק התפשטות עם יחס אות לרעש גבוה במשך מספר שבועות. בשילוב עם נתונים המתמחה באלגוריתמים לניתוח, הוא מספק נתונים היסטוריים כימות של תקשורת מספר הקשורים מאפיינים כגון הפצת מהירות הולכה כשל, קצב ירי, anterograde קוצים, וקידוד מנגנונים.
פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מלכודת תרבות עצביים ממודר מעל המצע משולב אותי כיצד תרבות נוירונים בתוכנית התקנה זו, כיצד להקליט בהצלחה, לנתח ולפרש את התוצאות של ניסויים אלה. כאן, אנו מראים איך הגדרת הוקמה מפשט את ההבנה של תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב. פלטפורמות אלה לסלול את הדרך עבור במבחנה דגמים חדשים עם topographies הנדסה ורשת עצביים לשליטה. הם יכולים לשמש בהקשר של תרבויות עצביים הומוגנית, או עם תצורות תרבות משותפת איפה, לדוגמה, התקשורת בין נוירונים סנסוריים סוגי תאים אחרים הנמצאים תחת פיקוח, העריך. תוכנית התקנה זו מספקת תנאים מאוד מעניין ללמוד, לדוגמה, neurodevelopment, מעגלים עצביים, מידע קידוד, גישות הקשורים ניוון מוחיים neuroregeneration.
הבנת תקשורת חשמלית של מעגלים עצביים היא צעד מהותי כדי לחשוף את התיפקוד הרגיל, לתכנן אסטרטגיות טיפוליות כדי לטפל בתפקוד. נוירונים לשלב, לחשב, להעביר פוטנציאל פעולה (APs) אשר יפיץ לאורך אקסונים דק שלהם. טכניקות מסורתיות אלקטרופזיולוגים (למשל, מלחציים תיקון) טכניקות עוצמתיות ללמוד פעילות. עצבית אך מוגבלים המבנים התאיים גדולים יותר, כמו סומא או של דנדריטים לעיתים קרובות. טכניקות ההדמיה להציע חלופה ללמוד אותות עצב עם רזולוציה מרחבית גבוהה, אך הם קשים מבחינה טכנית לבצע ולא מאפשרים מדידות לטווח ארוך1. בהקשר זה, השילוב של מערכים microelectrode (אותי) מיקרופלואידיקה יכולה לתרום תרומה חזק ב לחשוף את המאפיינים הבסיסיים של neuron´s פעילות של אות שידור בתוך רשתות עצביים במבחנה2 , 3.
טכנולוגיה MEA מסתמכות על הקלטות חוץ-תאי של תרבויות עצביים. היתרונות העיקריים של מתודולוגיה אלקטרופיזיולוגיות זו הם יכולתה לתמוך לטווח ארוך, בו זמנית ורישום באתרים מרובים, לא פולשנית דרך3. אותי עשויים מסתיימים, גבוהה מוליך ועמידים בפני קורוזיה microelectrodes נעוץ מצע וופל זכוכית. הם תואמים תא קונבנציונאלי התרבות ביו-ציפויים, אשר באמצעות קידום תא אדהזיה באופן משמעותי להגביר את ההתנגדות איטום בין המצע והתאים3,4. יתר על כן, הם מגוונים בעיצוב, עשויים להשתנות microelectrodes גודל, גאומטריה, צפיפות. בסך הכל, לי לעבוד ככלים תרבות תא קונבנציונאלי עם היתרון של ומאפשר בו-זמניות הדמיה לחיות, אלקטרופיזיולוגיות הקלטות/גירוי.
השימוש בטכנולוגיה MEA תרם המחקר של תכונות חשובות של רשתות עצביות5. עם זאת, קיימות תכונות הטבועות המגבילות את הביצועים של לי ללמוד תקשורת והתפשטות APs במעגל עצביים. אותי לאפשר הקלטות של תאים בודדים ומבנים אפילו subcellular כמו אקסונים, אבל בהשוואה אותות somal, אותות עצב יש יחס אות לרעש נמוך מאוד (SNR)6. יתר על כן, המאפיין של חישה חוץ-תאית שדה פוטנציאל מכל המקורות סביב microelectrode כל הסלים המעקב של התפשטות אות במעגל עצביים.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו, עם זאת, כי ההקלטה תנאים טובים יותר יכולה להיות מושגת על ידי כך את microelectrodes מיושרת צר microchannels שבו אקסונים יכולים לגדול. תצורה זו מספקת שעלייה משמעותית SNR כזה כי הפצת האותות עצב יכול להיות בקלות זוהה7,8,9,10,11,12, 13. האסטרטגיה של לכרות ברית microfluidic התקנים עם טכנולוגיית MEA יוצר microenvironment מבודד חשמלית מתאימים להגביר אותות עצב11. יתר על כן, הנוכחות של microelectrodes חישה מרובים לאורך microgroove הוא היסוד עבור זיהוי ואפיון של התפשטות אות עצב.
כזה פלטפורמות במבחנה עם הרשת העצבית מאוד לשליטה topographies ניתן להתאים שאלות מחקר רבות14. פלטפורמות אלה מתאימים לשמש בהקשר של תרבויות עצביים, אך ניתן להרחיב מהנדס תצורות תרבות משותפת, התקשורת בין הנוירונים סוגי תאים אחרים יכול להיות במעקב ואיפה העריך. תוכנית התקנה זו ובכך מספק תנאים מאוד מעניין לחקור מספר מחקרים עצביות הקשורות כגון neurodevelopment, מעגלים עצביים, קידוד מידע, הקשורים ניוון מוחיים, neuroregeneration. יתר על כן, השילוב שלו עם מודלים המתעוררים של האדם pluripotent המושרה בתאי גזע15,16 יכול לפתוח אפיקים חדשים בפיתוח של טיפולים פוטנציאליים עבור מחלות אנושיות המשפיעות על מערכת העצבים.
המעבדה שלנו היא באמצעות פלטפורמה זו שילוב microelectrodes עם מיקרופלואידיקה (µEF) כדי להבין תהליכים עצביים ברמת סלולריים ורשת, שההשפעה שלהם פיזיו - ואת מערכת העצבים פיפטות. בהינתן ערך כזה פלטפורמה בתחום של מדעי המוח, המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד ליצור תרבות עצביים ממודר מעל המצע משולב אותי, כיצד תרבות נוירונים ב פלטפורמה זו וכיצד להקליט בהצלחה, לנתח ולפרש את התוצאות של ניסויים אלה. פרוטוקול זה בהחלט יגרום להעשרת ארגז הכלים ניסיוני עבור תרבויות עצביים במחקר של תקשורת עצבית.
בכל ההליכים הכרוכים חיות בוצעו על פי האיחוד האירופי (EU) דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי (משורבב פורטוגזית חקיקה על-ידי Decreto-Lei 113/2013). פרוטוקול נסיוני (0421/000 000 2017) אושרה על ידי ועדת האתיקה של שני פורטוגזית שהסמכות הרשמית על רווחת בעלי חיים וניסוי (Alimentação de Geral-מחפשת ה Veterinária - DGAV), של המוסד המארח.
1. הכנת תרבות תקשורת, פתרונות אחרים
הערה: להכין טרי פתרונות ציפוי ביום של השימוש בו. ניתן לאחסן את פתרונות ציפוי שאינם בשימוש ומדיה תרבות ב-20 ° C או 4 ° C כמפורט להלן.
2. Microfluidic והכנת ההתקנים MEA
הערה: בצע את השלבים 2.1-2.11 ביום שלפני תא זריעה.
3. לגשת לנתיחה
4. קורטיקלית נוירונים דיסוציאציה ותרבות על µEF
הערה: ההליכים הבאים בוצעו בתוך תא למינארי לאחר 15 דקות במחזוריות של עיקור UV. עובד שטח, כמו גם כל החומרים בתוך המנוע צריך להיות קודם לכן נקיים עם 70% אתנול
5. הקלטה ספונטנית פעילות. עצבית
הערה: תא עצב בקליפת המוח העוברי תרבויות על אותי להפגין פעילות ספונטנית בדרך כלל ברגע 7 ימים במבחנה (DIV), אך לוקח 2-3 שבועות (DIV 14-21) ועד מבוגרים שהפגינו יציבה פעילות. זה תלוי הנסיין להחליט מתי להתחיל את מדידות אלקטרופיזיולוגיות בהתבסס על מטרות המחקר. ב פרוטוקול זה, ההקלטה של פעילות. עצבית של µEF מומחש באמצעות מערכת הקלטה מסחרית (ראה טבלה של חומרים לפרטים חומרה), עם מודול חימום משולב. עבור ביצוע הקלטות, השתמשנו תוכנה זמינה בחופשיות (ראה טבלה של חומרים לפרטים תוכנה).
6. ניתוח נתונים
הערה: השלבים הבאים מראים כיצד להשתמש בתוכנה µSpikeHunter, חישובית כלי שפותח במעבדה של הלומדים (זמינה בחופשיות על פי בקשה דוא ל pauloaguiar@ineb.up.pt), כדי לנתח נתונים הקליט עם µEF. ממשק משתמש גרפי (איור 2) משמש כדי לטעון את הנתונים, לזהות גלים דקר כציוד, לקבוע את הכיוון שלהם (anterograde או רטרוגרדית) מעריכים הפצת המהירויות. µSpikeHunter הוא תואם HDF5 קבצים שנוצר מתוך הקלטות שהושג באמצעות מערכות MEA2100-משפחה, אשר יכול לשמש בשילוב עם 60 - 120-, 256-אלקטרודה אותי. ההקלטות תוך שימוש רב ערוצית הנסיין ניתן להמיר בקלות את הקבצים HDF5 באמצעות התוכנה זמינה בחופשיות (ראה טבלה של חומרים).
באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, E-18 החולדה הנוירונים קורטיקלית נזרע על µEF מסוגלים לפתח ולהישאר בריאים בתנאים אלו תרבות עבור מעל חודש. ברגע 3 עד 5 ימים בתרבות, נוירונים בקליפת המוח לגדול אקסונים שלהם דרך microgrooves לכיוון תא עצב של µEF (איור 1). לאחר 15 ימים בתרבות, נוי?...
פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד להרכיב את µEF, המורכב מכשיר microfluidic, לי עם עיצובים זמין מסחרית רגילה, וכיצד לנתח את הנתונים המוקלט.
בעת תכנון ניסוי, חוקרים יש לקחת בחשבון כי המודל במבחנה הוא מוגבל על ידי הרשת MEA קבוע, אשר מאלץ את הסדרי microgroove. השימוש של microfluidic מסוים או עיצוב MEA ...
המחברים אין לחשוף.
עבודה זו מומנה פדר - פונדו Europeu דה Desenvolvimento האזורית כספים באמצעות 2020 להתחרות - Operacional תוכנית תחרותיות בינאום (POCI), פורטוגל 2020, וכן על ידי הפורטוגזים קרנות דרך FCT - Fundação פארא e Ciência Tecnologia / Ministério דה Ciência, Tecnologia e Ensino מעולה, במסגרת הפרויקט PTDC/CTM-נאן/3146/2014 (POCI-01-0145-פדר-016623). חוסה C מתאוס נתמכה על ידי FCT (PD/BD/135491/2018). פאולו הלומדים נתמכה על ידי פרוגרמה Ciência - פרוגרמה Operacional Potencial Humano (POPH) - קידום של מדעי תעסוקה, ESF, MCTES, תוכנית Investigador FCT, POPH ופונדו Europeu חברתית. המכשירים microfluidic היו מפוברק-INESC - מיקרוסיסטמס, ננוטכנולוגיה, פורטוגל, תחת פיקוחו של ז'ואו פדרו קונדה ו וירג'יניה צ'ו.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved