הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

Summary

Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.

Abstract

ניתוח של חלבון ביטוי glioma רלוונטי עבור מספר היבטים במחקר של הפתולוגיה שלו. חלבונים רבים תוארו גם סמנים ביולוגיים עם יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. ניתוחים אלה של סמנים שימושיים גם לאפיין הגידול neurospheres (NS) המופקים glioma חולים ומודלים glioma. הגידול NS מספקות מודל ערך במבחנה כדי להעריך את תכונות שונות של הגידול שממנו הם נגזרים, ניתן באופן מדויק יותר מראה glioma ביולוגיה. כאן נתאר שיטת מפורט לניתוח סמנים סרטניים NS באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) על גידול פרפין-מוטבע NS.

Introduction

Gliomas הם גידולים מוצקים העיקרי של מערכת העצבים המרכזית מסווגים לפי המאפיינים שלהם פנוטיפי ו genotypic על פי ארגון הבריאות העולמי ה-¹. סיווג זה משלבת נוכחות או היעדרות של מוטציות הנהג, אשר מייצגים מקור אטרקטיבי של סמנים ביולוגיים². סמנים ביולוגיים הן תכונות ביולוגיות ולהשוואה הערכה לציון תהליכים נורמליים ופתולוגיים, כמו גם תרופתי התגובות התערבות טיפולית³. סמנים ביולוגיים ניתן להבחין ב גידול רקמות ותאים שמקורם glioma, המאפשרת אפיון ביולוגי שלו בהיבטים שונים. כמה דוגמאות של סמנים ביולוגיים glioma כוללים מוטציה isocitrate דהידרוגנאז 1 (IDH1), אנזים מוטציה האופייניים gliomas נמוך בכיתה הקשורים עם פרוגנוזה טובה יותר⁴. מוטציה IDH1 מתבטא לעתים קרובות בשילוב עם TP53 אלפא-תלסמיה/מנטלי פיגור תסמונת X-linked (ATRX)-inactivating מוטציות, הגדרת glioma ספציפי של סוג הנכס^4,5. מוטציות ATRX inactivating גם להתרחש ב- 44% של ילדים gliomas בדרגה גבוהה^2,6 , קושרו עם גידולים אגרסיביים, אי יציבות גנומית^6,7. בנוסף, ילדים ' מאטום לשקוף ' מהותי pontine gliomas (DIPG) מובחנים של תת קבוצות לפי נוכחות או היעדרות של מוטציה K27M בגן היסטון H3 H3F3A, או ב- HIST1H3B/C ג'ין^1,6. לכן, כניסתה של אפיון מולקולרי מתיר את חלוקת משנה, מחקר, וטיפול של gliomas כישויות נפרדות, אשר יותר יאפשר הפיתוח של יותר ממוקד טיפולים עבור כל סוג של. בנוסף, הניתוח של סמנים ביולוגיים ניתן להשתמש כדי להעריך תהליכים ביולוגיים שונים כגון אפופטוזיס⁸, autophagy⁹, מחזור התא התקדמות¹⁰, התפשטות תא¹¹תאית התמיינות¹² .

בדגמי בעלי חיים מהונדסים גנטית הנמל נגעים גנטי נוכח סרטן אנושיים הם קריטיים עבור המחקר של איתות המסלולים המתווכות התקדמות המחלה. המעבדה שלנו יישמה את השימוש במערכת transposase היופי ישן (SB) לפתח מודלים מהונדס גנטית עכבר של glioma מחסה מוטציות ספציפיות אשר מסכם את הדברים glioma האנושי יחוברו^13,14. מודלים מהונדס גנטית עכבר אלה משמשים ליצירת NS נגזר הגידול, אשר מאפשרים מחקרים במבחנה במערכת תלת-ממד, תכונות בולטות שיקוף להציג גידולים מקומיים בתוך¹⁵. כמו כן, השתלת orthotopical של NS לתוך עכברים ניתן להפיק גידולים משניים אשר שומרים על תכונות של הגידול העיקרי ומחקים את המאפיינים histopathological גנומית, פנוטיפי של הגידול העיקרי המקביל¹⁵.

בתרבות ללא סרום, תאים סרטניים במוח עם מאפייני תא גזע יכולים להיות מועשר, בנוכחות גורמי גדילה עוריות (EGF) ו פקטורי גדילה פיברובלסט (FGF), הם ניתן לגדל כמו מושבות נגזר תא יחיד כגון NS תרבויות. במערכת זו בררני תרבות ', רוב התאים המבדילים או הבדיל במהירות מתים, ואילו תאי גזע להתחלק ויוצרים האשכולות הסלולר. פעולה זו מאפשרת את הדור של תרבות NS המתחזק glioma הגידול תכונות^16,17,18. Glioma NS ניתן להעריך כמה היבטים של הגידול ביולוגיה, כולל הניתוח של סמנים ביולוגיים בעלי יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירה glioma NS להטביע את התרבויות 3D פרפין לשימוש עבור IHC מכתים. אחד היתרונות של תיקון והטבעה glioma NS הוא כי המורפולוגיה של NS נשמר טוב יותר בהשוואה ל- cytospin המקובלת בשיטה¹⁹, אילו glioma NS מוכתבת עליהם מניפולציה מלחיץ עבור תא דיסוציאציה, להיות שיטוח. בנוסף, הטבעה המרווה כל ביטוי fluorophore אנדוגני מהגידול מהונדס גנטית NS, המאפשרים צביעת על פני ספקטרום פלורסנט. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשמר את המבנה התלת-ממד של תאים glioma דרך פרפין הטמעת תהליך אפיון של glioma neurospheres באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.

1. דור של המוח גידול Neurospheres נגזר דגם העכבר

1. לפני ההליך לנתיחה, להכין תאי גזע עצביים מדיה (Media המועצה לבטחון לאומי: DMEM/F12 עם תוספת x B27 1, 1 השלמה x N2, 1 x normocin 1 x אנטיביוטיקה/antimycotic בתוספת האנושי רקומביננטי EGF ו- basic-FGF בריכוזים של 20 ng/mL כל). למלא את צינור 1.5 מ ל 300 µL של המועצה לבטחון לאומי מדיה ושריין מאוחר יותר.
2. בחר עכבר עם גידול גדול.
   הערה: גודל הגידול ניתן יהיה פיקוח על ידי ביולומינסנציה אם פלסמיד או הוירוס מוזרק מקודד luciferin. בדרך כלל, גידול גדול יש ביולומינסנציה של > 10⁶ פוטונים/s/ס מ²/sr.
3. המתת חסד את העכבר עם מנת יתר של איזופלוריין: להשרות נייר טישו עם איזופלוריין ולהציג את הרקמה euthanization כדורים, הימנעות ממגע ישיר עם העכברים כדי למנוע גירוי. המתן עד העכברים לא מראים רפלקס פדלים (בדרך כלל 5-10 דקות). לערוף את העכבר ומנתחים את המוח כפי שמתואר Calinescu. et al. ¹³.
4. אם הגידולים פלורסנט, השתמש מיקרוסקופ ויבתר מצויד עם מנורת פלורסנט כדי לזהות את מסת הגידול בתוך המוח. עם מלקחיים בסדר, לנתח את הגידול (בדרך כלל 5-7 מ מ קוטר) של רקמת מוח נורמלי.
5. מקום הגידול ביתור בצינור 1.5 mL עם המועצה לבטחון לאומי מדיה (שלב 1.1). Homogenize הגידול עם כבעלי פלסטיק חד פעמיות שמתאימים לתוך דפנות הצינור microcentrifuge על ידי הפעלת לחץ עדין.
6. מביצועם כגיהנום תא, להוסיף 1 מיליליטר דיסוציאציה ללא אנזים מדיה ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
7. לסנן את המתלים תא דרך מסננת תא מיקרומטר 70 ולשטוף את מסננת עם 20 מ של המועצה לבטחון לאומי מדיה.
8. צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות, decant את תגובת שיקוע, וכן להשעות מחדש בגדר 6 מ ל או 15 מ"ל של המועצה לבטחון לאומי מדיה, בהתאם לגודל בגדר.
9. צלחת התליה תא הגידול לתוך הבקבוק תרבות T-25 או T-75 התרבות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה עם אווירה של 95% אוויר ו-5% CO₂.
10. לאחר 3 ימים, להעביר את NS מושעה בריא ואת צלחת אותם מחדש לתוך בקבוקון תרביות רקמה T-25 או T-75. אם יש צורך, להוסיף מדיה לבטחון לאומי נוספת התרבות.
    הערה: בדרך כלל יהיו אוכלוסייה מעורבת של תאים, כמה יהיה מת, כמה דבקה, ויוצרים כמה להיות NS זה צפים בתקשורת

2. שמירה, Passaging את NS

הערה: למנוע יתר ולשמור על תאים על צפיפות גבוהה יחסית. הנהרות נקבע לפי גודל הספירות (שחור מרכזי של יתר כלומר הספירות גדולים). קצב הגידול NS יהיה תלוי oncogenes המשמש ליצירת גידולים.

1. ברגע התרבות NS הגיעה confluency, לאסוף את התרבות בשפופרת צנטרפוגה סטרילי, גלולה NS ב g 300 x במשך 5 דקות.
2. למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של הפתרון ניתוק התא, פיפטה להשעות מחדש בגדר.
3. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מצליף את הצינור כל 2 דקות כדי לסייע תא דיסוציאציה.
   הערה: כאשר NS מגיעים confluency, הם בדרך כלל רואים בעין בלתי מזוינת כמו כדורים לבנים קטנים. על מנת להבטיח תא דיסוציאציה, לפחות כל NS גלוי בטח נעלם
4. הוסף 5 מ של HBSS 1 x ופיפטה מספר פעמים. צניפה תאים על 300 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע. מחדש להשעות את צניפה ב 5 מ של המועצה לבטחון לאומי מדיה בתוספת רקומביננטי EGF ו- basic-FGF.
5. להוסיף 1 מ"ל של תאים 15 מ"ל של המועצה לבטחון לאומי מדיה ותרבות בבקבוקון T-75 ב 37 ° C בחממה תרביות רקמה עם אווירה של 95% אוויר ו-5% CO₂.
6. הוספת גורמי גדילה (EGF ו- basic-FGF) כל 3 ימים. אם התקשורת הופך בהיר וכתום התאים עדיין אינם confluent, לשנות את המדיה. כדי לעשות זאת, centrifuge את NS-300 גרם x במשך 4 דקות ו להשעות מחדש בתקשורת לבטחון לאומי עם גורמי גדילה.
   הערה: בהתאם לגודל בגדר נוצר, תאים ייתכן שיהיה צורך ניתן לחלק את המבחנות יותר.

3. מקפיא את NS לאחסון לטווח ארוך

1. התרבות NS הופך confluent, לבטל את התאים כמתואר בצעדים 2.1 2.4. ברגע בגדר כבר מחדש תלויים HBSS, להסיר את aliquot של ולספור את התאים.
2. צנטריפוגה תאים ב g x 300 במשך 4 דקות ו להסיר ככל האפשר של תגובת שיקוע.
3. מחדש להשעות את צניפה קפואים מדיה (FBS חום-לא פעיל, דימתיל סולפוקסיד 10%). מומלץ להקפיא בין עונה 1 פרק 10⁶ ו- 3 x 10⁶ תאים לכל מבחנה לכל mL.
4. לחלק בתאים cryovials רבים וגם צריך להתקרר לאט הבקבוקונים מחדש על תנאי על ידי הראשון העברת אותן לקרח, ואז ל-20 ° C, ואז ל-80 מעלות צלזיוס, ולבסוף למחרת במיכל אחסון בחנקן נוזלי.

4. קיבוע של הגידול NS

1. תרבות גידול NS בבקבוקון T-25 2-3 ימים עד שהתאים confluent (~ 3 x 10⁶ תאים). לאסוף את הגידול NS צינור חרוטי 15 מ"ל מבקבוק לפחות אחד T-25 confluent. גלולה ב g x 300 במשך 5 דקות.
2. מחדש להשעות את צניפה ב 1 מ"ל של 10% פורמלין ו לשמור בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 דקות הוסף 5 מ של 1 x HBSS-גלולה התאים כפי שנעשה צעד 3.2. חזור על שלב זה עוד פעם אחת.
3. במקום הצינור חרוט 15 מ"ל המכיל בגדר על קרח.

5. פרפין ההטמעה של הגידול NS

1. מחדש להשעות בגדר NS שטף ב 500 µL של 2% agarose נוזל חם ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
2. במקום מיד את NS agarose-מוטבע על הקרח, עד agarose polymerizes. הסר את היצירה agarose מסתירים את NS. מניחים את החלק polymerized agarose עם המחלקה בקלטת בשביל לרקמות עיבוד (איור 2).
3. להמשיך עם עיבוד רקמות (באמצעות מעבד פרפין אוטומטית), שעוות פרפין הטבעה (באמצעות תחנה ההטבעה).

6. חלוקתה של פרפין-מוטבע NS

1. להגדיר את המים הרותחים עד 42 ° C והכנס את הלהב על האזמל הקטן בזהירות באמצעות שתי מברשות כדי לוודא שזה הוא בר-החלקה. השתמש הלהב רק עבור זמירה.
2. מניחים את גוש פרפין על האזמל הקטן. עם היד הלא דומיננטית, לחץ כלפי מטה ידית הממוקמת בצד שמאל השולט העובי של כל מקטע. הקש כדי העצירה השנייה זה מצביע על עובי 30 מיקרומטר.
3. להתחיל זמירה את הבלוק (כלומר., הסרת פרפין עודף) על ידי סיבוב הגלגל יד גס עם יד ימין עד פני השטח של המדגם. בשלב זה, שחרר את הידית ששולטת את עובי החיתוך 10 μm או 5 μm. תפסיק זמירה כאשר השטח של המדגם.
4. מילוי מקרר עם קרח ולהוסיף רק מספיק מים כך כאשר לבלוק פראפין מושם על קרח, המים פועל כמו סרט מסביב לבלוק פראפין, מגן מלגעת ישירות את הקרח. דגירה הרחוב פרפין על קרח למשך 20 דקות.
5. למחוק את הלהב הישן ולהוסיף אחד חדש עבור חלוקתה. בלוק יבש בעזרת גזה, ואז למקם אותו על האזמל הקטן.
6. עם היד הלא דומיננטית, להשיג זוג מלקחיים מעוקל שישמש כדי למשוך את הסרט פרפין. שמור מכחול לח ליד ימין, אשר ישמש כדי להעביר את הכלים פרפין לאמבט המים. להתחיל מקטע על-ידי סיבוב הגלגל יד גס עם יד ימין מהיר בקצב. השתמש המלקחיים ביד שמאל כדי להחזיק את הסרט פרפין.
7. להשתמש את המכחול לח להעביר את הכלים פרפין לאמבטיה מים.
8. השתמש העקומה של המלקחיים על כנו הסעיפים על ידי באופן שטחי הצבת המלקחיים בין שני מקטעים פרפין, ואז דוחפים בעדינות בין שני המקטעים משם.
   הערה: תנועה זו צריכה להיות לגמרי על פני השטח של המקטע פרפין. אל תלחץ על הסעיף.
9. השתמש את המכחול לח לדחוף את המקטעים מופרדים פרפין על גבי שקופיות מיקרוסקופ אדהזיה הטעון חיובית.
10. לאפשר שהשקופיות לילה יבש בתוך ברדס כימי לפני אחסונם בתיבות שקופיות. האחסון של שקופיות תלוי בסוג של כתם שבוצעה.

7. אימונוהיסטוכימיה (IHC) של פרפין-מוטבע NS

1. ממיסים פראפין על ידי הצבת את השקופיות במעמד מתכת המקננת בהם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
2. Deparaffinize השקופיות על-ידי דגירה על הרכבת התייבשות ב RT: 3 x קסילן במשך 5 דקות, 100% אתנול 2 x עבור 2 דקות, 95% אתנול 2 x עבור 2 דקות, 70% אתנול 1 x 2 דקות, ו- 1 x מים יונים 2 דק Hereon, שמור את השקופיות במי ברז עד אחזור אנטיגן , כמו ייבוש יגרום נוגדן ספציפי שאינו מחייב.
3. דגירה השקופיות במאגר ציטראט (חומצת לימון 10 מ מ, דטרגנט ללא יונית 0.05%, pH 6) ב 125 מעלות צלזיוס ל 30 s ו ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 s. לתת להם להתקרר, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות 5 פעמים עם מים מזוקקים.
4. דגירה שקופיות ב RT ב- 0.3% H₂O₂ למשך 30 דקות.
5. לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת מאגר (דטרגנט 0.025% ב- TBS) עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
6. דגירה השקופיות ב RT עם חסימת פתרון (10% הסוס סרום, BSA 0.1% ב- TBS) למשך 30 דקות.
7. דגירה השקופיות בן לילה ב 4 ° C בתוך תא humidified עם נוגדן ראשוני מוכן בפתרון דילול (BSA 0.1% ב- TBS). לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת המאגר עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
8. דגירה השקופיות ב RT מאובטח עם נוגדן משני biotinylated מוכן בפתרון דילול. לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת המאגר עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
9. דגירה השקופיות ב RT בחושך למשך 30 דקות עם peroxidase חזרת אבידין-biotinylated מורכבים. לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת המאגר עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
10. דגירה השקופיות עם DAB-H₂O₂ המצע מותגים כאן למשך 2-5 דקות ב- RT.
11. לשטוף 3 פעמים עם מים מהברז. לטבול (1-2 s) השקופיות hematoxylin לפתרון counterstain, יש לשטוף אותן היטב במי ברז עד קרחת.
12. מייבשים את השקופיות כדלקמן: דגירה במים מזוקקים למשך 2 דקות, לטבול 3 פעמים ב- 80% אתנול, דגירה אתנול 95% 2 פעמים למשך 2 דקות כל אחד, דגירה אתנול 100% 2 פעמים למשך 2 דקות כל אחת, ולבסוף ב קסילן 3 פעמים במשך 3 דקות כל אחד.
13. Coverslip השקופיות עם מדיום מבוסס קסילן הרכבה ולתת להן להתייבש על משטח שטוח ב RT עד שיהיו מוכנים עבור הדמיה.       הערה: אם מבצע 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) מכתים, בשקופיות שניתן לאחסן ב- RT. עם זאת, אם immunofluorescence מכתים מבוצע, שקופיות יש לאחסנו בחושך ב-20 ° C כדי להפחית הלבנת-צילום.

תוצאות

לעקוב אחר התפתחות גידולים ולהעריך אם הגידול הגיע הגודל הדרוש ליצירת NS, ניתחנו את לומינסנציה הנפלטת גידולים באמצעות ביולומינסנציה. פעולה זו מאפשרת לימוד יעילות התמרה חושית הגורים, התקדמות הגידול ע י האות הפריה חוץ גופית של לוציפראז (איור 1א' ו-

Discussion

במאמר זה, אנחנו פירוט שיטה לשחזור רב-תכליתי לביצוע אימונוהיסטוכימיה על glioma פרפין-מוטבע NS, המקיימות המבנה 3D האופיינית של תאים סרטניים גדל המוח בתוך באתרו. טכניקה זו יש את היתרונות הבאים לעומת באמצעות תאי ציפוי זכוכית או משטחי פלסטיק: אני) שימור המבנה התלת-ממד של NS; ii) הימנעות של מתח התא ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse