מערכת אינדוקציה מקובצים באשכולות הפיוניות על ידי סוכר פתרון טבילה טיפול בשתילי תודרנית לבנה

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד לגרום הפיוניות באשכולות בפסיגי הזרע של שתילים תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכר וכיצד להתבונן מבנים תאיים כגון מהכלורופלסט microtubules בתאי המשמר באשכולות באמצעות קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ.

Abstract

התנועה stomatal שמתווכת חילוף הגזים צמח, אשר חיוני פוטוסינתזה ועל דיות. פתיחה וסגירה stomatal מוכשרות על ידי עלייה משמעותית או להקטין את נפח התאים משמר, בהתאמה. בגלל הסעה של יונים, מים מתרחשת בין משמר תאים גדול יותר התאים באפידרמיס הסמוכים במהלך התנועה stomatal, התפלגות במרווחים של הפיוניות הצמח נחשב של התפלגות אופטימלית עבור התנועה stomatal. מערכות ניסיוני perturbing התבנית במרווחים של הפיוניות שימושיים לבחון את המשמעות של התבנית המרווח. זוהו מספר גנים מרכזיים המשויכת להתפלגות stomatal במרווחים, הפיוניות clustered יכולה להיגרם השפעול על ידי שינוי גנים אלה. לחלופין, הפיוניות clustered יכולה גם להיגרם על ידי טיפולים אקסוגני ללא שינוי גנטי. במאמר זה נתאר מערכת אינדוקציה פשוטה עבור הפיוניות באשכולות בשתילי תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. השיטה שלנו היא קלה, ישירות החלים על קווים הטרנסגניים או מוטציה. מהכלורופלסט גדול מוצגים כמו סימן היכר התא הביולוגי של סוכרוז-induced תאי המשמר באשכולות. בנוסף, תמונת הנציגה מיקרוסקופיים קונאפוקלית של microtubules קורטיקלית מוצג בתור דוגמה של התבוננות תאיים תאי המשמר באשכולות. בכיוון רדיאלי microtubules קורטיקלית נשמרת בתאי המשמר באשכולות כמו תאי המשמר במרווחים בתנאי בקרה.

Introduction

סטומה רפואית הצמח הוא איבר חיוני עבור חילוף הגזים על פוטוסינתזה ועל דיות, תנועה stomatal מושגת על ידי שינויים משמעותיים בתאי המשמר דרך ספיגת מונחה יון ושחרור של מים. תחת מיקרוסקופ, ניתן להבחין דפוס הפצה במרווחים של הפיוניות של משטחי העלים והגבעולים. הפיזור במרווחים של הפיוניות נחשב כדי לעזור stomatal, תנועה מוסדר על ידי חילופי יון ומים בין תאי המשמר גובלות תאים אפידרמיס^1,2. מערכות אינדוקציה ניסיוני הפיוניות באשכולות שימושיים חוקרים את החשיבות של ההתפלגות במרווחים של הפיוניות.

בעבר דווח כי קיבוץ באשכולות המרחבי של הפיוניות יכולה להיגרם על ידי שינוי גנטי של גנים מרכזיים משמר תא בידול^3,4 או טיפול עם תרכובת כימית⁵. אנחנו גם דיווח כי טיפול טבילה עם פתרון בינוני בתוספת סוכרים כולל סוכרוז, גלוקוז, פרוקטוז גרם stomatal קיבוץ באשכולות בפסיגי הזרע של תודרנית לבנה שתילים⁶. Callose מופחת בקירות התא החדש הפרדת meristemoids תאים אפידרמיס נצפתה האפידרמיס cotyledon שטופלו סוכרוז, רומז כי סוכרוז פתרון טבילה טיפול משפיעה באופן שלילי על דופן התא, המונע את בריחת ו פעולה חוץ רחמי של ג'ין מפתח מוצרים עבור השומר תאית התמיינות (למשל גורמי שעתוק) לכיוון סמוכים עוריות תאים⁶. מנגנון דומה הוצע ממחקרים על gsl8/chor מוטציות^7,8. מערכת הניסוי שלנו עבור אינדוקציה לשחזור של הפיוניות באשכולות באמצעות פתרון בינוני המכילים סוכרוז הוא די קל וזול. זה יכול לשמש גם כדי לחקור מבנים תאיים כגון organelles, את שלד התא בתאי המשמר באשכולות כאשר חל על קווים הטרנסגניים לבטא פלורסנט סמני את תווית מבנים תאיים^{9, 10}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת 3% סוכרוז המכילה 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון

1. להוסיף 1.1 גרם של מלחי בינוני Murashige-Skoog ו- 15 גר' סוכרוז גביע.
2. מוסיפים 490 מ ל מים מזוקקים ומערבבים היטב בעזרת בר מערבבים.
3. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות קו.
4. לדלל עד 500 מ"ל מים מזוקקים ולהעביר את הפתרון לתוך בקבוק בינוני.
5. לחטא את הפתרון על-ידי autoclaving (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות). אם לא משתמשים מיד, פתרון זה נשמרות ב 4 ° C לאחר עיקור.

2. אינדוקציה של הפיוניות באשכולות מאת המכילים סוכרוז טיפול טבילה פתרון בינוני

1. לחטא את הזרעים.
   1. להכין את הפתרון עיקור על-ידי הוספת µL 500 של 5% כלור פעיל פתרון NaClO µL 1 של 10% טריטון X-100 ל 500 µL במים סטריליים.
   2. מקום ca. 50 הטרנסגניים זרעים לבנה א נושא סמן פלורסנט כגון CT-GFP¹¹ -GFP-TUB6¹² לתוך צינור 1.5-mL.
   3. להוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול פתרון, לערבב היטב על ידי היפוך חמש פעמים. יוצאים 1 דקות.
   4. הזרעים ישקעו לתחתית הצינור. על ספסל נקי, בעדינות להסיר האתנול 70% שימוש של micropipette, וכן להוסיף 1 מ"ל של עיקור פתרון. מערבבים היטב בעזרת היפוך חמש פעמים ולהשאיר למשך 5 דקות.
   5. לשטוף את הזרעים. עדיין עובד בתנאים aseptic על ספסל נקי, בעדינות להסיר הפתרון באמצעות של micropipette, וכן להוסיף 1 מ"ל של מים סטריליים. חזור על שלב זה חמש פעמים.
2. להוסיף 1.5 מ של סטיריליים 3% סוכרוז המכילה 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון כל טוב של צלחת 24-טוב על ספסל נקי.
3. להוסיף שני זרעים סטיריליים כל טוב. סרט הדבקה המכסה על צלחת 24-ובכן באמצעות שתי שכבות של מצלמות-מיקרוסקופים.
4. להעביר את הצלחת. ובכן 24 סדרה קאמרית הצמיחה ב 23.5 ° C עם מחזור בהירה-כהה 12-h/12-ה באמצעות 100 µmol מ'⁻² s^{− 1} לבן אור, תקופת דגירה של 14 ימים.

3. מיקרוסקופיים התבוננות הפיוניות באשכולות

1. מקום 30 µL של 3% המכילים סוכרוז 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון מהבאר של צלחת 24-ובכן במרכז זכוכית (גודל: 76 × 26 מ מ, עובי: 1.0-1.2 מ מ).
2. להסיר cotyledon של שתיל בת 14 יום באמצעות מספריים ויבתר. לצוף על cotyledon עם הצד תצפית כלפי מעלה על המסירה פתרון.
3. הכינו את הדגימה cotyledon על פי השיטה הקודמת שלנו¹³. בעיקרו של דבר, במקום 30 µL של הפתרון על המרכז של כיסוי זכוכית (גודל: 18 × 18 מ מ, עובי: 0.12-0.17 מ מ). הפוך את הזכוכית המכסה ומניחים אותו על cotyledon בעדינות. . תנגב את מאגר עודף באמצעות רקמה נטולת מוך.
4. להגדיר טיפוס על הבמה של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ובחר באשכולות תאי המשמר להשגחה באמצעות תאורה שדה בהיר.
5. לרכוש תמונות קונאפוקלית של מבנים תאיים fluorescently עם תוויות ברורות על פי הוראות היצרן מיקרוסקופ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

. הנה, הוצגו הפרוטוקול עבור שיטה פשוטה של גרימת קיבוץ באשכולות stomatal המכילים סוכרוז פתרון בינוני ב לבנה א שתילים. תאי המשמר באשכולות גדלו ב פתרון בינוני המכילים סוכרוז (איור 1B) יש מהכלורופלסט גדול יותר מאשר תאי המשמר גדל בתנאי בקרה ללא סוכרוז (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הוצגו פרוטוקולים עבור אינדוקציה של הפיוניות באשכולות בשתילי לבנה א על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. כמוצג להלן, שיטה זו היא פשוטה מאוד ולא דורש שום מיומנות מיוחדת אבל יכול לגרום ביעילות הפיוניות באשכולות. יותר מ- 45% תאי המשמר מקובצים עם 3% סוכרוז המכילות בינוני פתרון (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Sumitomo Bakelite	MS-0824R
488 nm laser	Furukawa Denko	HPU-50101-PFS2
488 nm laser	Olympus	Sapphire488-20/O
510 nm long-pass filter	Olympus	BA510IF
524 - 546 nm band-pass filter	Semrock	FF01-535/22-25
530 nm short-pass filter	Olympus	BA530RIF
561 nm laser	CVI Melles Griot	85-YCA-025-040
604 - 644 nm band-pass filter	Semrock	FF01-624/40-25
Confocal laser scanning head	Yokogawa	CSU10
Confocal laser scanning head	Olympus	FV300
Cooled CCD camera	Photometrics	CoolSNAP HQ2
Image acquisition software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition software	Olympus	FLUOVIEW v5.0
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Type-F	ne = 1.518 (23 degrees)
Inverted microscope	Olympus	IX-70
Inverted microscope	Olympus	IX-71
Murashige and Skoog Plant Salt Mixture	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	392-00591	Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens	Olympus	UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35	NA = 1.35
Objective lens	Olympus	UPlanAPO 40x / 0.85 NA	NA = 0.85
Sucrose	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	196-00015