השרשה של תגית חדשה אקוסטית מיקרו עגולי הפה השקט לנוער, צלופח אמריקאי

Summary

מאמר זה מדגים את ההליך עבור השתלת תג אקוסטית מיקרו לנוער עגולי הפה השקט, צלופח אמריקאי. האפליקציה שלנו מבוססת על נסיונות מעבדה, אשר מצביעים על כך תגיות אקוסטית יכול להיות מושתל בהצלחה ללא תופעות לכאורה על שחייה יכולת או הישרדות ואובדן תג מינימלי.

Abstract

עגולי הפה השקט לנוער וצלופחים אמריקאי שימשו הערכות מעבדה לקביעת תופעות אפשריות של תג השרשה. טלמטריה טכנולוגיה זוהתה כדרך להשגת מידע מפורט יותר על התנועה וההתנהגות על פני סולם המרחבי רחבה יותר מזו המתאפשרת עם טכנולוגיית ידועים אחרים. מטרת שיטה זו היא לספק הוראות מפורטות צעד אחר צעד על תג ההשתלה הן lampreys והן צלופח. במחקרי מעבדה באמצעות העברת פעיל לנוער השקט עגולי הפה (120-160 מ מ), קבענו כי הנוכחות של התג לא לשנות את יכולת שחייה בין יחידים מתויגים ולא מתויגים או יש אובדן תג משמעותית (< 3%). תוצאות דומות היו נחושים במהלך בדיקות מעבדה של שלב צהוב צלופחים אמריקאי (113-175 מ מ). התמותה לא אירעה במהלך תקופת המעצר 38-יום ולא היה אובדן תג מינימלי (3.8%). הנוכחות של התג אין כל השפעה משמעותית על יכולת שחייה או ההישרדות של צלופחים מתויג לעומת שולט מתויגות ולא היה אובדן תג מינימלי.

Introduction

הבנת התנהגות דגים ותנועות ליד נהר מבנים, כגון סכרים הידרו, עשוי לעכב העברה במעלה או במורד הזרם מסלולים היא הצורך מחקר שוטף. למרות מחקרים רבים נערכו באמצעות הטכנולוגיה הקיימת, יש עדיין הרבה שאלות מחקר על צלופחים לנוער, הישרדות עגולי הפה, התנהגות. לסייע בשאלות כאלה הפסיפי הלאומי מעבדה (PNNL) פיתח משדר מיקרו אקוסטי חדש תוכננה במיוחד לשימוש צלופחים לנוער lampreys, קרא את תג עגולי הפה/צלופח¹. לפני התפתחות זו, התגים הקיימים אקוסטית היו גדולים מדי כדי להיות יעיל מושתל לתוך החללים בגוף של צלופחים לנוער, lampreys, כתוצאה נטל תג שחורג הסטנדרטים המקובלים (ערך השמרני של תג ליחס משקל הגוף הוא 2% או פחות ספרות אחרים מציע 4-5%)^2,3,4. התגים עגולי הפה/צלופח פולטים אותות מוצפן ייחודי בתדר של 416.7 kHz, אשר מנוטרים באמצעות מקלטי אוטונומית (ההידרופונים) מבנים קבועים או מקלטי נהר ב-^5,6.

אגן נהר קולומביה בארצות הברית, המודעות והדאגה להבנת מחזור חיים שלם של הצלופח השקט (Entosphenus tridentatus) החריף כי אוכלוסיות ירדו באופן משמעותי ב- 40 השנים האחרונות⁷ . הקמה ותפעול של מתקנים הידרואלקטרי עלול להשפיע לרעה עגולי הפה לנוער, כפי שקרה ירידות שלהם לאחר תקופת פיתוח אלקטרי גדול⁸. מקור פוטנציאלי אחד התמותה הוא סכר מעבר כאשר עגולי הפה השקט ילדותי יותר להגר האוקיינוס⁹. משדרים משולב פסיבי (בור) משמשים בדרך כלל עבור העברת זני דגים עשוי לעבור הסחה מבנים (כגון: מערכות העקיפה לנוער), אשר מאפשר דגים מתויג להיות ספור^10,11. אולם, ילדותי עגולי הפה נחשבים להעברת עמוק יותר בתוך עמודת המים מאשר סלמון לנוער, נוטים פחות לעבור דרך מערכות מעקף לנוער¹². בשל ההסתברויות נמוכה זיהוי חוסר מדגרות או מקורות אחרים מרוכז של ילדותי עגולי הפה עבור בור תיוג, מידע על מעבר עגולי הפה לנוער, הישרדות, או התנהגות היא מוגבלת מאוד. הידע של Pacific עגולי הפה התנהגות לנוער הישרדות הם קריטיים לפיתוח אסטרטגיות להפחתת הסיכון למעבר הזרם, כולל העיצוב של מערכות העקיפה לשימוש באלקטרי ומתקני השקיה הסחה מבנים¹³.

הצלופח האמריקני (אנגווילה rostrata) הוא catadromous עם השלב למבוגרים מעבר ממים מתוקים לכיוון האוקיינוס כדי להשריץ. רמות האוכלוסיה שלהם לראות ירידות דרמטיות בעשורים האחרונים. בעבר, הם היו מאוד בשפע כל הנהרות הגדולים הזורמים אל האוקיינוס האטלנטי ואת הזרם דרך נהר סנט לורנס עד ימת אונטריו; אבל מאז 1980, צלופחים אמריקאי חוו ירידות משמעותיות בשפע מניות ועד 50% במפרץ צ'ספיק ככל 97% ימת אונטריו^14,15,16. הגורמים התורמים לירידה שלהם כוללים; בניית סכרים הידרואלקטרי, פיצול, אובדן בית הגידול ומסחרי קציר¹⁷. הם רשומים כיום בתור בסכנת תחת חוק מינים בסכנת הכחדה אונטריו (קנדה). התפתחות קודמים של מתקני הידרו לאורך הנהרות הגדולים של מזרח ארה ב הברית ליצור מכשולים הפוגעים העברות הם נופי הנהר המרשימים של נוער ומבוגרים כאחד.

התג אקוסטית עגולי הפה פיתח/צלופח נעשה שימוש במחקר זה. התגים יוצרו של PNNL ביו-אקוסטיקה מוסמך & מעבדה זרימה¹⁸. התג מודד את אורך 12 מ"מ x 2 מ מ קוטר, ויש משקל של 0.08 g באוויר. בגלל הגודל הכולל קטן של התג, זה יכול לשמש ביעילות להשתלה anguilliform או דג לנוער באמצעות חתך sutureless, עקב חתך קטן נדרש (< 3 מ"מ). יתרונות נוספים של החתך sutureless כוללים: כמות מופחתת של זמן נדרש תהליך כירורגי, ריפוי מהיר יותר קצבי, וירידה אפשרות של זיהומים אתר ההשתלה¹⁹. ניתוח ההשתלה אפקטים יכול להשתנות בתגובה מינים החיים הבמה, אורך חלל הגוף, מיקום החתך, ללמוד ומשך תנאים סביבתיים^20,21,22,23. בנוסף, גודל, משקל הוא משתנה חשוב מכיוון שהוא מספק מידה של הנטל תג (קרי, את המשקל של התג באופן יחסי המשקל של הדג). הנטל תג, בשיתוף עם כל ההיבטים האחרים של תהליך כירורגי (למשל, הרדמה, טיפול, ניתוח), יכול להיות בעל השפעה ישירה על תגית השמירה, הישרדות, צמיחה, שחייה ביצועים, או את היכולת של דגים כדי למנוע טריפה^{24, 25,26,27}.

Protocol

PNNL הוא מוכר על ידי האגודה הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה. צלופחים, עגולי הפה שטופלו לפי הנחיות הפדרלי עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה, ואת הפרוטוקולים עבור המחקר שלנו היו שנערך תובייחמה תושירדל םאות שאושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים של PNNL להשתמש הוועדה.

1. תג הכנה (עיתוי 22 דקות)

1. מקום התגיות בפתרון אתנול 70% למשך 20 דקות.
2. להסיר תגים באמצעות מלקחיים ניילון ומניחים בצלחת זכוכית קטן המכיל מים סטריליים.
3. להסיר תגים ומניחים על כוס הגלולה סטרילי.

2. להכין פתרון הרדמה (תזמון ~ 5 דקות)

1. בכוס פלסטיק קטנה שוקלת 40 גר' Tricaine.
2. לפזר אבקת, מי ברז לתוך גביע 500 מ"ל על צלחת בחישה עם בר למיקסר ולאחר מכן להעביר לבקבוק פלסטיק כדי להשיג פתרון מניות 80 g/L.
3. חזור על הפעולות אותה עם סודה לשתייה ומוסיפים בקבוק 500 מ"ל נפרדים.
4. באמצעות מכולה מפלסטיק 10 L, למלא במים 5 L (אותו מקור מים כמו דג כדי להיות מתויגת).
5. הוסף 6.25 מ של פתרון הרדמה Tricaine ו- 6.25 מ של סודיום ביקרבונט באמצעות gage שפיכת מדידה מחוברת לחלק העליון של הבקבוקים 500 מ"ל כדי לקבל מנה 100 מ ג/ליטר לאמבטיה.
6. מערבבים לערבב פתרון במים.
   הערה: יש מכסה זמין לכסות את האמבטיה כדי להבטיח עגולי הפה לא בורחים תוך כדי הפתרון הרדמה.

3. עגולי הפה תיוג (עיתוי ~ 6 דקות)

1. מקום לנוער עגולי הפה (> 140 מ מ) לאמבט הרדמה באמצעות טבילה קטנה נטו.
2. לחכות 4-5 דקות עבור עגולי הפה להיות מלא demobilized (כבר לא שוחה בפתרון, תוך שמירה על איטי על-ידי התנועה גיל יציב).
3. השתמש טבילה נטו כדי להסיר עגולי הפה, לקחת מידות אורך ומשקל ולהקליט את קוד זיהוי ייחודי של התג אקוסטית.
4. הכנת כרית ספוג תאים סגורים עבים 1.3 ס מ רווי מים µL/L הראשון ולאחר מכן 150 ציפוי המגן (ראה טבלה של חומרים). ציפוי המגן עוזרת לנטרל שיבוש ריריות במהלך הליך כירורגי.
5. במקום הצד הבטני עגולי הפה למעלה על הקצף מוכן. הצב קטע קטן של צינורות עם אספקת מים מוסדרים (מתוך טנק של מים מוגברות) לזרום דרך אזור הפה במהלך תהליך כירורגי. דבר זה מאפשר נשימה בזמן דגים נמצא בתהליך ההשתלה תג.
6. לאתר את האתר היכן החתך יתבצע, ~ 20 מ"מ אחורי עד גיל נקבוביות על הצד השמאלית או הימנית. להשתמש בסרגל עם תכונות או סמני מניחים על משטח קצף לעיון.
7. באמצעות אזמל המיקרוכירורגית סטרילי 3.0 מ מ עם 15° להב (ראה טבלה של חומרים) בזהירות להפוך של 2.5-3 מ מ פתיחת בכיוון לרוחב להבטיח כי האזמל שוחה רק דרך הקיר העור הפנימי. ראה איור 1.
8. מקם את התג מחוטא anteriorly לתוך חלל הגוף בעבודת יד. הפעילו לחץ קל לאתר תיוג כדי להבטיח כי התגית עברה לתוך חלל הגוף.
9. המקום מתויג עגולי הפה אל תוך דלי שחזור המכיל מים טריים מהנהר מסופקים עם דגים טנק משאבת חמצן, אבובים, אבן אוויר.
10. להבטיח את עגולי הפה התאוששו מן הרדמה העברה להחזקת טנק למחקר עתידי.

4. צלופח תיוג (עיתוי ~ 6 דקות)

1. לשכפל את תג הכנה ולהתכונן הרדמה עם מנה ריכוז של 240 mg/L Tricaine והן סודה לשתייה.
2. להוסיף 15 מ"ל של כל אחת לאמבטיה מים 5 L.
3. מקום צלופחים לנוער (> 130 מ מ) לאמבט הרדמה באמצעות טבילה קטנה נטו. לחכות 4-5 דקות עבור צלופח להיות מלא demobilized (כבר לא שוחה פתרון תוך שמירה על איטי אבל גיל קבוע תנועה).
4. השתמש טבילה נטו כדי להסיר צלופח ומניחים בצד הגחוני למעלה על קצף תאים סגורים מצופה עם דגים מגן.
5. לאתר את האתר איפה החיתוך להתבצע, ~ 25 ממ לבסיס של סנפיר החזה בצד שמאל או הימנית
6. באמצעות אזמל המיקרוכירורגית סטרילי 3.0 מ מ עם 15° להב להפוך בקפידה של 2.5-3 מ מ פתיחת בכיוון לרוחב להבטיח כי האזמל שוחה רק דרך הקיר העור הפנימי. ראה איור 2.
7. מקם את התג מחוטא anteriorly לתוך חלל הגוף בעבודת יד. חלות לחץ קל על תיוג האתר על מנת להבטיח תג עבר לתוך חלל הגוף.
8. המקום מתויג צלופחים לתוך החלמה דלי המכיל מים טריים מהנהר שסופק עם דגים טנק חמצן משאבה, צינור, והאוויר אבן.
9. ודא שהצלופח הזה יש התאושש מההרדמה, העברת להחזקת טנק למחקר עתידי.

תוצאות

במחקרי מעבדה עגולי הפה לנוער

נערך מחקר ב- PNNL בשנת 2015 כדי לקבוע אם אפשר להשתיל תג עגולי הפה דמה/צלופח פעיל מעבר עגולי הפה השקט לנוער. סך של עגולי הפה השקט 195 (שלב החיים macrophthalmia) הועברו מאתר אוסף שדה PNNL. נערכו שתי משימות נפרדות. הראשון היה כדי לקבוע כיצד דגים מגיבים תג השרשה. המשתנים שנקבע אובדן תג כלולים, התמותה מושהית וריפוי המחירים עבור דגים מתויג לעומת קבוצת לא מתויגים (בקרה). בשביל השחייה המשימה השנייה נערכו ניסויים עם דגים מתויגים ולא מתויגים קטגוריות גודל 10 מ מ (120-160 מ מ) כדי לקבוע כל תופעות לוואי הקשורות לשחות. דגים משקלי נע בין 1.8 אל נטל g גירסה 7.0 ותג נע בין 4.8 ל- 1.25%. רנטגן הממחישות את המיקום תג בתוך חלל הגוף מוצג באיור 3¹. סך של שני דגים ירד תגיות שלהם במהלך 2 ימי מעצר ראשונים, לא ירד תגיות נוספות נמצאו במהלך שארית תקופת המעצר 28 יום. התמותה cumulate בתקופה זו היה 14.3% (7 דגים) עבור הצלופח מתויגות, 9.6% (5 דגים) עבור קבוצת הביקורת. מתויג הפרט, דגים הבקרה הונחו בתוך תא שחייה ושחה במהירות מים קבועה של 11 ס"מ/s. קצב הזרימה נבחר בהתבסס על הקודם בדיקות מעבדה אשר ציינו קבוע שחייה תנועה בקצה התחתון של מתמשכת שחייה יכולת⁹. הפעם מתכוון לשחות של קבוצת הביקורת היתה 3.15 דקות (SE = 42.5 s) הזמן לשחות הממוצע של קבוצת מושתל היה 2.3 min (SE = 30.2 s), מה שלא היה הבדל משמעותי (t = 0.958; p = 0.172). תוצאות הביצועים שחייה בדיקות הראו מתאם משמעותי בין אורך דג ושחייה משך (קרי, זמן כדי impingement) או מתויגות או קבוצות הבקרה (איור 4). Impingement תיאר את הדג כבר לא מסוגל לשחות במהירות המים קבוע, נחה על המסך במורד הזרם.

במחקרי מעבדה צלופח אמריקאי

כדי לקבוע כל תופעות תג l אפשרי על שחייה ביצועים, ערכנו מהירות שחייה קריטי בדיקות באמצעות U._{הסימנים החיוניים}, (אינדקס של ביצועים שחייה ממושכת) עבור שש קבוצות גודל (n = 120; 113-175 מ מ) של צלופחים מתויגות ולא מתויגות באמצעות תגי דמה אשר נמדד 11.4 מ"מ x 1.8 מ"מ (אורך x קוטר)¹. היה הבדל משמעותי ב- U_crits בין צלופחים מתויגים ולא מתויגים כפי שנמדדה ס"מ/s (איור 5) או ערכים נמדד אורך הגוף/s עבור כל מתויג, קבוצות שאינן מתויגות משולב (איור 6). אנו גם שנערך אחזקה ממושכת של צלופחים מתויג (38 ימים), מצאו תמותה אין בין הקבוצות מתויג אובדן תג נמוך של 3.8% (1 מתוך 26 דגים)¹. בהתבסס על תוצאות המעבדה שלנו, אנו מסיקים כי תגיות אקוסטית מיקרו יכול להיות קטנטנים ביעילות של צלופחים האמריקאי לנוער עם אין השפעות משמעותיות על שחייה, יכולת ההישרדות לטווח ארוך, היה אובדן מינימלי תגית במהלך החיים תג (30 ימים).

איור 1 . תמונות הממחישות רצף תיוג עבור תג הכניסה בעגולי הפה השקט לנוער. (א) עגולי הפה ממוקם על ספוג. (B) החתך עשוי עם האזמל השתלה. (ג) תג להיות מושתל. (ד) עגולי הפה שלאחר תיוג. כל התמונות צולמו של הצלופח אותו (148 מ מ). 

איור 2 . תמונות הממחישות את תהליך תיוג עבור צלופחים האמריקאי לנוער- (א) לפני החיתוך. (B) לאחר החיתוך. (ג) לאחר ההוספה הקדמי של התג. כל התמונות צולמו של הצלופח אותו (138 מ מ). 

איור 3 . תמונות רנטגן של תג עגולי הפה דמה/צלופח בתוך חלל הגוף של עגולי הפה לנוער האוקיינוס השקט. 

איור 4 . Impingement בשיעורי החל לשחות בדיקות ביצועים עבור פקד (לא מתוייגות) ו מתויג עגולי הפה, מופרדים לקטגוריות גודל 10 מ מ עם קווי שגיאה תקן חיובי. גודל מדגם מפורטים בברים בודדים.

איור 5 . תיבת חלקות שחייה קריטי מהירות עבור קבוצות גודל של צלופחים במקצועות ס"מ/s עבור צלופחים מתויגים ולא מתויגים (10 לכל טיפול)- הקווים בתוך כל תיבת מייצגים את החציון; החלק העליון והחלק התחתון קווים מייצגים את ה-75 ו-25 percentiles, בהתאמה; נכון הם. ה-90 העליון ואת התחתון percentiles העשירית; ליניאריים מתוארים על ידי מעגלים סגורים. 

איור 6 . תיבת חלקות שחייה קריטי מהירות הגוף אורך/s עבור צלופחים מתויגים ולא מתויגים (10 לכל טיפול)- הקווים בתוך כל תיבת מייצגים את החציון; החלק העליון והחלק התחתון קווים מייצגים את ה-75 ו-25 percentiles, בהתאמה; נכון הם. ה-90 העליון ואת התחתון percentiles העשירית; ליניאריים מתוארים על ידי מעגלים סגורים. 

Discussion

התוצאות של המחקרים מעבדה מדגימים כי הליך תיוג ותיוג תופעות אין השפעות שליליות על השרידות דגים או יכולת שחייה. אחזקות המורחבת ומעקב אחר הראה כי אובדן תג מינימלי אירעה, לא ניכרה במהלך החיים תג (30 ימים). הליך ההשתלה תג היה יעיל-הצבת תגיות לתוך חלל הגוף מבלי לגרום דימום משמעותי או זיהומים פטרייתיים באתר תיוג. משך הזמן של כל בתיוג תהליך (< 6 דקות) הוא מועיל בכך שהיא מפחיתה מתחים הקשורים עם הדג להיות מורדם. ממצאים אלה מאפיינים את כלי חדש למחקר לנוער עגולי הפה, צלופח המעבר, יכול להיות מנוצל מחקרים עתידיים. טכנולוגיה זו יאפשר לחוקרים לעקוב אחר תנועות עגולי הפה, צלופח בתוך מערכות הנהר, כפי שהם סכרים הידרואלקטרי גישה או מבנים אחרים הפוגעים המעבר דגים. בתורו, התוצאות ניתן ליידע טוב יותר החלטות ניהול במתקנים אלה כדי לעזור לשמר את המינים הללו לאורך כל שלבי החיים לנוער שלהם. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול השרשה ' תג ' כוללים שימוש המינון הנכון של תרופות להרדמה, עומק ואורך של החתך, השמה של תגי, לאחר התאוששות נאותה מחזיקים טנקים זמינים. טכניקה זו יש מגבלות מינימליות. בעיקר, מנתח הכשרה נדרשת לבצע ביעילות < החתך 3 מ מ ומניחים את התגיות על המיקום הרצוי. בנוסף, תהליך התיוג לכלול קטן יותר בגודל צלופחים, עגולי הפה (< 140 מ מ) בשל מגבלות נטל תג. אנו ממליצים שינויים הפרוטוקולים המתואר.

להשתמש בשיטות חלופיות עבור תיוג צלופחים, עגולי הפה כוללים את השימוש בור תגיות. אולם, בור-tags לא פעיל לשדר אותות, ולכן מתויגת בור דגים יכול רק ניתן לבצע ספירה כפי הם entrained, מופנת המתקנים לעקוף או לעבור קרוב גלאי קבוע^10,11. יישומים עתידיים של התג עגולי הפה/צלופח כוללות את היכולת לתייג ולעקוב אחר אוכלוסיות של העברת עגולי הפה וצלופחים בכל סביבה שהם שוכנים. יתרונות נוספים של שימוש בתג עגולי הפה/צלופח יכלול את היכולת להעריך את הישרדות, שיעורי החזרה ב- spillways או באמצעות טורבינות, נסיעות זמן בתוך מאגרי מים נודדות עיכובים, הקשורות בהתנהגות כמו דגים הגישה סכרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 L plastic tub	N/A	N/A
19 L pail	N/A	N/A
3.00 mm scalpel	Beaver-Vistec	377513
500 ml bottle	Nalgene	2089-0016
Adam scale	Certified Material Testing Products	BCL-LBK12A
Air pump	Amazon	N/A
Air stone	Pentair	ALS3
Dip net, 3/32 in mesh	N/A	N/A
Ethanol (70%)	Sigma-Aldrich	24102
Fish protector	Kordon LLC	31456
Foam pad	N/A	N/A
Gloves	Kimberly Clark	N/A
Mixer bar	Sigma-Aldrich	F37110-1128
Plastic tweezer	N/A	N/A
Pouring dispenser gage	Fischer Scientific	13-683-60C
Scalpel handle	Beaver-Vistec	371360
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Stirrer plate	Corning, PC-351	N/A
Tricaine methanesulfonate, MS-222	Western Chemical Inc.	515388	Treated fish destined for food must be held in fresh water above 10°C (50°F) for 21 days before use
Tubing, 6 mm	N/A	N/A