בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.

Abstract

רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic שושלות. Adipogenic הבידול של ובתאים הוא מנגנון מרכזי הנהיגה הרחבה רקמת שומן ועל תפקוד בתגובה השמנת יתר. הבנת שינויים רקמת שומן perivascular (PVAT) היא לפיכך הרלוונטית קלינית במחלה מטבולית. עם זאת, מחקרים קודמים היו יוכפל לאחר המרתו הופיעה העכבר, חיה אחרת מודלים. פרוטוקול זה משתמש אנושי דגימות PVAT בית החזה שנאספו בחולים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. רקמת שומן מן העורקים נאסף ומשומשים עבור explantation של השבר בכלי הדם סטרומה. לנו קודם לכן אישר את הנוכחות של אדיפוז ובתאים ב PVAT האדם את היכולת להתמיין המכילים שומנים בדם adipocytes. במחקר זה, בהמשך ניתחנו את פוטנציאל התמיינות של תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה, ככל הנראה המכיל ובתאים רב עוצמה. השווינו נגזר PVAT לתאי מח עצם האדם MSC עבור בידול לתוך adipogenic, osteogenic, chondrogenic שושלות. לאחר 14 ימים של בידול, כתמים מסוימים נוצלו לאתר הצטברות שומנים בדם adipocytes (שמן אדום O), פיקדונות calcific תאים osteogenic (Alizarin אדום), או glycosaminoglycans, קולגן בתאים chondrogenic (Trichrome של מאסון). בזמן מח העצם MSC ביעילות הבדיל לתוך כל שלוש שושלות, תאים PVAT, נגזר היה adipogenic ו- chondrogenic פוטנציאל, אבל חסרה פוטנציאל osteogenic חזקים.

Introduction

רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, chondrogenic שושלות¹. רקמה זו מרחיבה דרך היפרטרופיה של בוגרת adipocytes de novo הבידול של תושב MSC כדי adipocytes. רקמת שומן Perivascular (PVAT) המקיף את כלי הדם, מווסת את תפקוד כלי הדם^2,3. השמנת יתר-induced PVAT הרחבה מחריף פתולוגיות לב וכלי דם. ואילו הפוטנציאל multipotent של MSC מן האדם מחסני אדיפוז תת עורית כבר למד היטב^4,5, מחקר explanted, הערכת הקיבולת בידול של האדם נגזר PVAT ובתאים, סביר בשל invasiveness הרכש. לפיכך, מטרת עבודה זו היא לספק מתודולוגיה אל explant, להפיץ ובתאים של האדם PVAT של אבי העורקים של חולים עם מחלת לב וכלי דם, כדי לבדוק את הנטייה להבחין ל osteogenic, chondrogenic ו adipogenic שושלות שלהם. מקור שלנו PVAT הוא אתר של השקה של המעקף על עולה אבי העורקים של חולים שמנים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. PVAT בודדים טרי enzymatically-חלופה מועדפת, השבר בכלי הדם סטרומה בודד ולאחר מופצות במבחנה, ומאפשרת לנו לבחון בפעם הראשונה את יכולת התמיינות של האדם נגזר PVAT ובתאים.

השימוש העיקרי תרבותי אנושי PVAT סטרומה וסקולרית שבר, בדקנו שלושה מבחני מתוכנן לגרום גזע/ובתאים להבדיל לכיוון adipogenic, osteogenic, או chondrogenic שושלות. המחקר שלנו מוקדמת לזהות אוכלוסייה של CD73 + CD105 +, תאים PDGFRa + (CD140a) יכולים להתמיין robustly adipocytes⁶, למרות multipotency שלהם לא נבדקה. PVAT ישירות מסדיר את הטון ודלקת כלי הדם⁷. הרציונל לבדיקת הפוטנציאל בידול של אוכלוסייה זו תא הרומן היא להתחיל להבין את השפעת PVAT על תפקוד כלי דם מיוחדות, ומנגנונים של התרחבות PVAT במהלך השמנת יתר. מתודולוגיה זו משפרת את ההבנה שלנו של הפונקציות של רקמת שומן נגזרת ובתאים, מאפשרת לנו לזהות ולהשוות והשונה של ובתאים ממקורות רקמות שונות. עלינו לבנות על גישות הוקמה המאומת בידוד, המבדילים MSC לכיוון שושלות שונות, לייעל את ההליכים כדי למקסם את הכדאיות של האדם נגזר PVAT ובתאים. טכניקות אלה יש שימושים רחב בתחומים של גזע קדמון תא רקמת שומן ומחקר ופיתוח.

Protocol

השימוש ברקמות אנושיות במחקר זה היה מוערך ואושרו על-ידי מוסדיים סקירה הלוח של מיין המרכז הרפואי, כל אנשי הצוות קיבל הכשרה מתאימה לפני הניסויים.

1. תכשירים

1. להפוך את מאגר דיסוציאציה מאת לשחזר 50 מ"ג ללא בעלי חיים collagenase/dispase תערובת אני פתרון עם 1 מ"ל של nanopure H₂O. הכן 1 מ"ג/מ"ל הפתרון עובד על-ידי הוספת 49 מ של גלוקוז גבוהות DMEM המכיל 1% w/v BSA collagenase משוקם / פתרון dispase. חנות מ ל aliquots לעבוד ב-20 ° C וחמים עד 37 ° C באמצעות לכהן אמבט מים לשימוש.
2. להפוך את פתרון לאנטיביוטיקה על-ידי הוספת 1 מ"ל של 100 x אנטיביוטיקה/antimycotic פתרון (הריכוז הסופי הוא 200 יחידות/mL פניצילין, 200 יחידות/mL סטרפטומיצין, 0.5 fungizone µg/mL) 49 מ של HBSS, לאחסן בקירור.
3. להכין פתרון ג'לטין (0.2% w/v) על ידי המסת ג'לטין 200 מ ג של עור שור ב- 100 מ של nanopure H₂או אוטוקלב הפתרון עבור 20 דקות ולאחסן ב 4 º C.
4. הכנת 500 מ"ל של PVAT הצמיחה מדיה: גלוקוז גבוהות DMEM/F12 עם תוספת גלוטמין פירובט נתרן, סודיום ביקרבונט, בתוספת 10% FBS וסוכן µg 100/mL מיקרוביאלית (ראה טבלה של חומרים).
5. להכין מדיה אינדוקציה adipogenic 50 מ ל: 40.8 mL גלוקוז גבוהות DMEM, בתוספת 7.5 mL PVAT הצמיחה מדיה, µL 500 של 100 x פתרון אנטיביוטיקה/antimycotic (ריכוז הסופי הוא 100 יחידות/mL פניצילין, 100 יחידות/mL סטרפטומיצין, fungizone µg 0.25/mL), 0.5 מ מ IBMX (מניות 500 מ מ של 0.1 M NaOH), 1 מיקרומטר דקסמתזון (1 מ מ מניות של אתנול) 5 מיקרומטר רוזיגליטזון (5 מ מ מניות של דימתיל סולפוקסיד), מיקרומטר 33 ביוטין (66 מ מ מניות של דימתיל סולפוקסיד), 100 ננומטר אינסולין (200 מניות מיקרומטר של 0.1% חומצה אצטית), חומצה פנטותנית 20 מיקרומטר (מניות 100 מ מ H₂ O).
6. להתכונן 50 מ של שליטה אינדוקציה מדיה השושלת adipogenic: 40.8 mL גלוקוז גבוהות DMEM בתוספת 7.5 mL PVAT הצמיחה ומדיה µL 500 של עט-דלקת (x 100 מניות).
7. הכנת 50 מל adipogenic תחזוקה מדיה: 41.5 mL גלוקוז גבוהות DMEM בתוספת 7.5 mL PVAT הצמיחה מדיה משלב 1.3, 500 µL עט-דלקת (x 100 מניות), דקסמתזון 1 מיקרומטר (1 מ מ מניות ב- EtOH), מיקרומטר 33 ביוטין (66 מ מ מניות של דימתיל סולפוקסיד), 100 ננומטר אינסולין (200 מיקרומטר מניות ב- 0.1% ac חומצה etic), חומצה פנטותנית 20 מיקרומטר (100 מ מ מניות H₂O).
8. להתכונן 500 מ"ל של מדיה צמיחה שושלות osteogenic ו- chondrogenic: תוספת של גלוקוז גבוהות αMEM בתוספת 10% FBS, גלוטמין x 1 (ראה טבלה של חומרים), ו- 5 מ של עט-דלקת (x 100 מניות).
9. להתכונן 50 מ של אינדוקציה מדיה השושלת osteogenic: 50 מ של מח העצם MSC צמיחה המדיה בתוספת 10 ננומטר דקסמתזון ו β-glycerophosphate 10 מ מ.
10. להתכונן 50 מ של אינדוקציה מדיה השושלת chondrogenic: 50 מ של מח העצם MSC צמיחה המדיה בתוספת 100 ננומטר דקסאמתאזון, 50 µg/mL סודיום אסקורבט-2-פוספט ו- 10 ננוגרם למ"ל TGFβ1. עבור התנאים osteogenic, chondrogenic, התקשורת צמיחה MSC מח עצם הבסיס ישמש כלי התקשורת הלא-אינדוקציה.

2. פרוטוקול 1: התרבות האנושית PVAT תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה

הערה: PVAT resected מהאתר של שתל השקה על העורקים של מרדימים חולים שעברו הליכים שתל מעקף עורקים. אבי העורקים PVAT ממוקם 15 מ"ל חרוט המכיל 10 מ"ל קרח קר גלוקוז גבוהות DMEM F12, יועברו מ חדר הניתוח למעבדה תוך שעתיים של כריתה. אבי העורקים PVAT רקמות שנזרקו במהלך תהליך מעקף, שסברו כמו מחקר בנושאים שאינם בני אדם על ידי ועדה פנימית של המרכז הרפואי מיין.

1. פרוטוקול זה מיועד חתיכה ~ 500 מ"ג של PVAT האנושית (כ 3 x 1 x 0.5 ס מ³). להעביר PVAT האנושי טריים DMEM צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 25 מ ל ונעביר. דגירה עם נדנדה כעשרים דקות ב 4 º C. אמנם PVAT ונעביר, להפשיר aliquot של דיסוציאציה מאגר ב 37 º C.
2. להוסיף µL 50 בפתרון אנטיביוטיקה/antimycotic x 100 מ ל דיסוציאציה מאגר ולחטא בעזרת מסנן 0.22 של מזרק מיקרומטר. להוסיף 1 מ"ל של פתרון ג'לטין 1 טוב של צלחת 24-. טוב. תא למינארי, להשתמש סטרילי מלקחיים ומספריים כדי להעביר PVAT הפתרון לאנטיביוטיקה צלחת פטרי סטריליות. להוסיף 1 מיליליטר דיסוציאציה מראש ומחוממת מאגר הרקמה, דק מינצ הרקמה כולה לתוך slurry (ללא חתיכות גדולות יותר מאשר ~ 2 x מ מ 2²) שימוש סטרילי מלקחיים ומספריים לנתיחה.
3. להעביר את slurry 1 מ"ל למאגר דיסוציאציה 4 מ"ל, דגירה הצינור על צידה ב מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס מסלולית שייקר ב 200 rpm לשעה. לאחר 1 h, אין חתיכות רקמה גלוי יהיה נוכח, הפתרון יופיע כהשעיה תא מעונן.
4. לסנן את הפתרון דרך מסננת תא מיקרומטר 70 להגדיר על גבי צינור חרוטי 50 מ. יש לשטוף את מסננת עם פתרון לאנטיביוטיקה נוספים 10 מ"ל ללכוד תאים רבים ככל האפשר. לא לסחוט את מסננת.
5. גלולה התאים במשך 12 דקות ב x 300 גרם ומפרידה דלי מתנדנדים.
   הערה: לאחר צנטריפוגה, הצינור מופרדים לשכבה העליונה שומן של adipocytes, לאטמוספרה של גלולה. בגדר הוא השבר בכלי הדם סטרומה המכיל תאי אנדותל, תאים חיסוניים, תאי דם, ובתאים.
6. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של HBSS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 300 גרם. חזור על שלב זה עבור סך של 2 שוטף ב- HBSS. לאחר השטיפה הסופית לא lyse כדוריות דם אדומות. ניסיונות חוזרים ונשנים עם מספר מאגרים זמין מסחרית ושעות הדגירה הובילו מסומן הפחתות קדמון תא המצורף ואת הכדאיות.
7. האחות ג'לטין מהצלחת 24-. טוב. לשטוף בעדינות את x 1 טוב עם HBSS כדי להסיר את הג'לטין לא מאוגד.
8. Resuspend השבר בכלי הדם סטרומה גלולה עם תאי דם אדומים שלמים ב 1 מ"ל זרע על גבי הג'לטין מצופים ומדיה צמיחה היטב. להוסיף FGF2 האנושית (resuspended ב- PBS בתוספת 0.01% BSA w/v) ריכוז סופי של 25 ננוגרם למ"ל במדיום תרבות. תקופת דגירה של 24 שעות ביממה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
9. ביום הבא, הסר צמיחה מדיה ושטוף בארות 5 x עם HBSS כדי להסיר תאי דם אדומים, תאים מתים. להוסיף 1 מ"ל של מדיה צמיחה טרי בתוספת 25 ננוגרם למ"ל FGF2.
10. לשנות את המדיה כל 48 שעות, מקפיד להשלים עם 25 ng/mL FGF2 טריים בכל פעם.
11. תאים בדרך כלל להגיע למפגש 100% 7-10 ימים לאחר explant; מעבר תאים ואז:
    1. תשאף צמיחה מדיה ושטוף חד שכבתי 2 ב 1 מ"ל HBSS-x. תשאף כל HBSS מן הבארות ולהוסיף כמה טיפות של התא דיסוציאציה פתרון.
    2. הקש על מערבולת שלוחית מספר פעמים, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO₂ למשך 5-7 דקות להרים את התאים. להוסיף ~ 1 מ"ל של טרי בינוני התרבות התאים מנותקת ולהפיץ µL 500 כדי בארות 2 של צלחת 24-. ובכן, כל המכילה 500 µL הצמיחה מדיה ו-25 ננוגרם FGF2.
12. להמשיך ולהרחיב את התאים נגזר PVAT של האדם כפי שמצוין בשלב הקודם. כל קטע צריך להיות לא יותר מ פיצול 1:2. התאים הם passaged 5 – 7 פעמים לפני בהקצאת עבור מבחני בידול.

3. פרוטוקול 2: התרבות האנושית מח עצם MSC המושבות

הערה: מח אנושי MSC מבודדים כמו שמתואר⁸ ומאוחסן כמו בתחילת המעבר קפוא מניות להקפיא מדיה (70% FBS 20% הבזליים DMEM ו-10% דימתיל סולפוקסיד) ב ~ 100,000 תאים למ"ל N נוזלי₂.

1. במהירות להפשיר בקבוקון של מח העצם MSC נוזלי N₂ 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים, צלחת על אחד טוב של צלחת 6-ובכן תרבות המכיל 3 מ"ל של מדיה צמיחה MSC, דגירה בין לילה-37 ° C ו- 5% CO₂.
2. ביום הבא, תשאף MSC תרבות מדיה ותרחץ התאים 3 ב 2 מ של HBSS-x. ב- 100% הנהרות, תשאף צמיחה מדיה ותרחץ התאים 3 ב 2 מ של HBSS-x. להוסיף 500 פתרון ניתוק התא µL/טוב דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עבור 5 דק. הקש על הלוח כדי להבטיח כל התאים הם רופף, פזר באופן שווה התוכן בארות 2 של צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ"ל MSC צמיחה מדיה.
3. הרחב את מח העצם אנושי ' נגזר PVAT MSC במקביל כ 5-7 קטעים או עד בכמות מספקת לבדיקת הושגה.

4. פרוטוקול 3: צלחת, זירוז, Osteogenic, Adipogenic ו- Chondrogenic שושלות

1. ומסרו המתאים של מח העצם ותאים נגזר PVAT לכל טוב של צלחת 12-ובכן, המתאים משכפל עבור כל תנאי הניסוי. עבור adipogenic ו- osteogenic תנאים, ~ 200, 000 – 225,000 תאים/טוב יש צורך, chondrogenic תנאים, 150,000 – 175,000 תאים/טוב נדרשים.
   הערה: הרצנו מינימום של N = 3 בארות שכפל עבור פקד, בהשפעת התנאים עבור כל השושלת ניסיוני עבור סכום כולל של 2 עצמאית פועל (N = 6 משכפל סה כ).
2. בטל שיוך תאים מן האוכלוסייה האנושית של התא קדמון PVAT והן האוכלוסייה MSC מח אנושי באמצעות פתרון ניתוק התא, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ לאוכלוסיות בריכה 5 דק לתוך צלוחיות חרוט נפרד 15 מ"ל. לסובב את המבחנה למטה ב x 500 g למשך 7 דקות הצניפה התאים. Resuspend ב 1 מ"ל של PBS ולהשתמש hemocytometer להעריך את מספר התאים.
3. צלחת התאים במנות 12-ובכן כפי שמצוין בשלב 4.1. מספקים כלים נפרדים המושרה ו- induced adipogenic, osteogenic, ותנאים, כך ניתן לתקן את המצב הלא-induced בנקודת זמן קודמת מבלי לשבש את פעולת המשך תרבות של התנאי המושרה.
4. להוסיף 1.5 מ של adipogenic ומדיה אינדוקציה osteogenic כל טוב של התנאי המושרה. להוסיף 1.5 מ של adipogenic והתקשורת הלא-אינדוקציה osteogenic כל טוב של המצב הלא-induced. מתחיל אינקובציה של adipogenic ו- osteogenic תא המושרה ו- induced אוכלוסיות-CO 37 ° C ו-5%₂.
5. ספין למטה כמות נותרת ובתאים PVAT האנושי ואת מח עצם האדם MSCs במשך 7 דקות ב 500 x g.
6. לקבוע את אמצעי האחסון הדרושים כדי resuspend הנותרים מח עצם ותא PVAT, נגזר כדורי כדי להשיג צפיפות של תאים/10 100,000 µL (10⁶ תאים/mL). Resuspend כדורי בהיקף מחושב MSC מדיה צמיחה עבור אינדוקציה השושלת chondrogenic. להניע בעדינות את עוצמת הקול של תאים למעלה ולמטה באמצעות pipet כדי להבטיח התפלגות הומוגנית.
7. Pipette 10 µL droplet של הפתרון תא מרוכז אל המרכז בכל טוב כדי ליצור את micromass של תאים 100,000. מקום 1 מ"ל של סטרילי H₂O הבאר סמוכים כדי למנוע התאיידות. דגירה התרבויות micromass עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ כדי לאפשר את micromass להפעיל עליה פונקציית צבירה.
8. לאחר שעתיים, בזהירות להוסיף מדיה בידול chondrogenic עם 10 ng/mL TGFβ1 אנושי לכל אחד מן הבארות המושרה-מצב. בזהירות להוסיף 1.5 מ של התקשורת הלא-אינדוקציה (מח עצם MSC צמיחה מדיה) הבארות תנאי שאינו-induced. השתמש. ובכן 12 צלחות נפרדות עבור התנאים המושרה ו- induced כך שניתן יהיה לתקן את המצב הלא-induced בנקודת זמן קודמת.

5. פרוטוקול 4: תרבות Adipogenic, Osteogenic, ו Chondrogenic שושלות למשך 14 ימים

1. תרבות המושרה ו- induced תנאי כל שושלות שלושה ארבעה ימים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂, מרעננים מדיה כל יומיים. יום 4, לשנות את התנאי השושלת adipogenic המושרה ממדיה אינדוקציה למדיה תחזוקה למשך שארית וזמינותו.
2. לתקן את כל התנאים הלא-induced בפורמלין 10% עבור 12 ח היפטרו פורמלין, לשטוף כל קבוע בארות 2 x ב- PBS כדי להסיר כל עקבות של פורמלין. חנות צלחות ב- PBS ב 4 ° C עד עיבוד.
3. תרבות התנאים המושרה עבור סכום כולל של 14 ימים, מרעננים מדיה כל יומיים. להוסיף TGFβ1 טריים בכל 10 ננוגרם למ"ל הסופי ריכוז עם כל רענון של התקשורת אינדוקציה chondrogenic. להמשיך תרבות השושלת adipogenic adipogenic תחזוקה מדיה, מדיה אינדוקציה השושלת osteogenic, רענון כל יומיים. יום 14, לתקן את תנאי מושרה כל 12 שעות בפורמלין 10% עבור צביעת.
4. לגרד או שופכים את micromass במצב chondrogenic המושרה לתוך קלטת להטבעה. מייבשים את micromass בסדרה של אלכוהול מרוכז יותר ויותר אמבטיות במשך 5 דקות, שמתחילים ב- 70%, 80%, פעמיים ב-95%, ואז פעמיים יותר באלכוהול המוחלט. הכנס את הקלטת סוכן dealcoholization ולאחר מכן להטביע סוף סוף את הקלטת בפרפין חלוקתה, מכתים.

6. פרוטוקול 5: צביעת Adipogenic תנאי עם שמן אדום O

1. להכין שמן אדום O מניות פתרון על ידי המסת 350 מ"ג של שמן אדום O ב- 100 מ של אלכוהול איזופרופיל 100%. מערבבים במשך שעתיים עם בר stir, ואקום דרך מסנן 0.2 µm. פתרון מניות ניתן לאחסן בחושך בטמפרטורת החדר במשך שנה 1.
2. להכין שמן אדום O עובד פתרון על ידי ערבוב 3 חלקים מניות פתרון לשכפל חלקים 2₂0 (למשל 60 מ"ל של פתרון מניות ל- 40 מ"ל לשכפל₂0). הריכוז הסופי של שמן אדום O בפתרון עובדים נמצא 2.1 מ"ג/מ"ל.
3. הסר את כל הנוזלים מבארות. לשטוף כל x 2 טוב עם 60% אלכוהול איזופרופיל, מקפיד להסיר לחלוטין את כל המים ומהצדדים של הבארות. האחות 60% אלכוהול איזופרופיל, להוסיף שמן אדום O הפתרון עובד במהירות בלי לגעת בקירות הבארות כדי לכסות את החלק התחתון. . זה קריטי כי צעד זה נעשה מהר כדי לא לייבש בארות
4. פעם נוספת שמן אדום O, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין.
5. להסיר כל שמן אדום O ולהוסיף מיד מזוקקים H₂O. לשטוף עם מזוקקים H₂O ב-10 מ' להתחיל להסיר או שמן אדום לא מאוגד לאחר 10 דקות, תשאף שמן אדום O וחזור על התהליך כביסה 3 x.
6. לאחר סיום הכביסה, להוסיף PBS, תמונה התאים. חנות צבעונית התאים ב- PBS ב 4 º C.

7. פרוטוקול 6: צביעת תנאי Osteogenic עם Alizarin אדום

1. הסר את כל נוזל מכל קידוח. להוסיף נפח מתאים של פתרון הכתם האדום Alizarin 2% מכל קידוח (1.5 מ"ל לאדם. טוב בשביל צלחת 12-טוב), להטות בעדינות את לוחית--לצד עד הפתרון מכסה לחלוטין הבאר.
2. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר Alizarin אדום הבארות. לשטוף בעדינות כל טוב ארבע פעמים עם מזוקקים H₂O, לוקח זהירות לא מכך גבישי סידן. אפשר להתייבש.

8. פרוטוקול 7: צביעת Chondrogenic תנאי עם מאסון Trichrome

1. אופים שקופיות בתנור יבש 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מקטעים Deparaffinize ו מימה על מים מזוקקים.
   1. לשתות הרבה, מקום שקופיות incubations 3 5 דקות עם סוכנים dealcoholization, ואחריו 5 דקות incubations בסדר יורד ריכוז אלכוהול כדלקמן: שתיים ב- 100% (אתנול מוחלטת), שניים ב 95% אלכוהול, שניים ב 80%, שניים ב-70%, ולבסוף שניים באופן מזוקק או שקופיות יכולים להישאר H₂H₂O בזמן מקבע של Bouin מוכן.
2. מקום 40 מיליליטר מקבע של Bouin בתוך צנצנת פלסטיק coplin פאנטרי (חשפו). מיקרוגל גבוה כדי להביא temp 55 מעלות צלזיוס. המקום שקופית בפתרון מחוממת כעשרים דקות; ולתת לעמוד על הדלפק מכוסה. רחץ פועל מי ברז למשך 10 דקות או עד כל הצבעים צהוב נעלם.
3. כתם במקטעים hematoxylin של וייגארט במשך 10 דקות לשטוף במים ברז למשך 10 דקות.
4. כתם במקטעים של Beibrich השני fuchsin חומצה הפתרון עבור 10 דקות לשטוף 3 x 10 דקות במי ברז. שקופיות mordant phosphotungstic/phosphomolybdic תמיסה חומצית למשך 10 דקות. לא שטוף.
5. מקום שקופיות ישירות אנילין כחול פתרון עבור 10 דקות יש לשטוף עם שני מטבלים קצרה במי ברז.
6. מקום שקופיות חומצה אצטית 1% פתרון עבור 3 עד 5 דקות לשטוף במי ברז עבור 1 מינימלית במקום אתנול 95% עבור 1 מינימלית Dehydrate כמצוין שלב 5.4, הר עם שרף סינתטי.

תוצאות

בידוד של סטרומה השבר בכלי הדם מן האדם PVAT

איור 1A מראה סכימטי של האזור האנטומי שבו הושג PVAT המכסים של אבי העורקים. תיארנו קודם לכן החולה האוכלוסיות שעברו מעקף עורקים הרכבה שמהם הדגימות היו נגזרת⁶.

Discussion

אדיפוז ובתאים של מחסני שונים להשתנות באופן נרחב פוטנציאליים, פנוטיפ ובידול⁹. Culturing נגזר PVAT אבות מתורם יחיד החולה באינדוקציה סימולטני למטה שלוש שושלות שונות, adipogenic, osteogenic, ו chondrogenic, מאפשר חקירה ומבוקרות היטב pluripotent לקיבולת של הרומן הזה אוכלוסיית ובתאים. המתודולוגיה שתוארו בדו ח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G