מודל העכבר המושרה של הפאציט הנגרמת על ידי מדגם של סרטן הפטאותאי העולה בקביעת דלקת הכבד פיברוזיס

Summary

כאן, אנו מתארים את ההתפתחות של מודל מורטין רלוונטי קלינית של סרטן הכבד לכידה של תכונות החיסונית אופייני של סרטן hepatocellular (HCC).

Abstract

העדר של מודל קליני רלוונטי בעלי חיים התייחסות המאפיינים החיסוניים טיפוסי של סרטן hepatocellular (HCC) יש באופן משמעותי את ההסבר של המנגנונים הבסיסיים ופיתוח של אסטרטגיות חיסוני חדשני. כדי לפתח את המודל החי האידיאלי לחבר את HCC האדם, C57BL זכר המוסמכת/6J העכברים הראשון לקבל פחמן ארבלוריד (CCl₄) הזרקה כדי לגרום פיברוזיס בכבד, ולאחר מכן לקבל היסטולוגית נורמלי הפגניים הפטציטים מגבר צעיר SV40 T אנטיגן (תג)-עכברים טרנסגניים (MTD2) על ידי הטחול (ISPL) החיסון. האנדרוגן שנוצר עכברים זכר הנמען בגיל ההתבגרות יוזם ביטוי תג תחת שליטה של מקדם ספציפי לכבד. כתוצאה מכך, hepatocytes הועברו להפוך לתאים סרטניים הגושים הגידול טופס בהגדרה של פיברוזיס בכבד/שחמת. מודל זה הרומן מחקה האדם החניכה HCC והתקדמות בהקשר של פיברוזיס הכבד/שחמת ומשקף את התכונות האופייניות ביותר של HCC האדם כולל תפקוד המערכת החיסונית.

Introduction

סרטן hepatocellular (HCC) הוא הסוג הגדל ביותר במהירות של סרטן בארצות הברית (ארה ב)^1,2,3. בכל שנה, כ 850,000 מקרים חדשים מאובחנים^4,5 ו 700,000 חולים מתים ממחלה קטלנית זו^6,7,8,9,10 , מה שהופך אותו לגורם השני בגובהו של מוות הקשור לסרטן ברחבי העולם. הניהול של HCC כולל כריתת כירורגית, השתלת, אבלציה, chemoembolization, או טיפולים מערכתית, כגון sorafenib¹¹. אבחון וניהול מוקדם עם כריתה כירורגית או השתלת יש יתרון ההישרדות הכולל הגבוה ביותר⁴. למרבה הצער, רוב המטופלים נוכחים בשלב מאוחר יותר ודורשים ניהול עם אבלציה, chemoembolization או sorafenib¹². Sorafenib, קולטן טירופין קינאז מעכב (RTKI), אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות בשנת 2008 כמו טיפול תרופתי מערכתית היחיד זמין לטיפול HCC מחדש. למרות התרופה רק מספק גידול צנוע בהישרדות הכללית, מ 7.9 עד 10.7 חודשים¹³, זה סיפק אסטרטגיה טיפולית חדשה שיכול להיות מנוצל כדי לנהל HCC.

שינוי מערכת החיסון כדי לחסל סרטן הוקמה היא שדה גדל במהירות במחקר סרטן¹⁴. מחקרים חיסוניים במחסום יש מתקדם במידה ניכרת פיתוח תרופות חיסוני טיפול בסרטן^15,16. ה-FDA אישר את השימוש בנוגדנים (Abs) נגד אנטיגן T-לימפוציט לימפוציטים 4 (CTLA-4), מתוכנת חלבון מוות של תאים 1 (PD-1), ואת הליגוה PD-L1 לטיפול של מלנומה, סרטן ריאות, הראש והצוואר סרטן, וסרטן שלפוחית השתן^17, מיכל ^{בן 18 ,} מיכל ^{בן 19 , 20}. ניסויים קליניים של מונותרפיה או טיפול משולב באמצעות נוגדנים אחד או מספר נגד PD-1, pd-L1, או ctla-4 לטיפול HCC מתקדם מתמשך^21,22,23, וכמה ניסויים הראו תוצאות חיוביות. ב 2017, ה-FDA העניק אישור מואץ עבור נוגדן anti-PD-1 לטיפול בחולים HCC, מי הם התנגדות sorafenib, אבל את קצב התגובה הכולל של טיפול זה הוא רק 14.3%. אסטרטגיות אחרות לא תורגמו לפרקטיקה קלינית בשלב זה^24,25. להתגבר על עמידות החיסונית עמוקה מעמיק כדי לשפר את הטיפול במחסום החיסונית²⁶; ניבוי היעילות של טיפול במחסום החיסון; מניעת תופעות לוואי הקשורות למערכת החיסונית; אופטימיזציה של תוואי האדמיניסטרציה, המינון והתדר; ומציאת שילובים יעילים של טיפולים^27,28,29 כולם להישאר מאתגרת מאוד משימות.

ישנן מספר גישות קונבנציונליות המשמשות כדי לגרום HCC במודלים העכבר כיום והם מנוצלים בהתאם לשאלה הספציפית של החוקר מחקר³⁰. כימית המושרה מודלים העכבר עם תרכובות גנוטוקסיל לחקות פציעה הנגרמת ממאירות. Xenograft מודלים דרך או השתלת חוץ רחמי או אורתוטופית של קווי תא HCC מתאימים הקרנת סמים. מספר עכברים ששונו גנטית ההונדסים לחקור את הפתופסולוגיה של HCC. עכברים טרנסגניים ביטוי גנים ויראליים, אונגנים ו/או גורמי גדילה מאפשרים זיהוי של מסלולים המעורבים hepatocarcinogenesis. בשל המגבלות הטמונות, מודלים אלה אינם מחדשים את מאפייני החיסון האופייני שנראו ב-HCC האנושי, אשר הייתה מוגבלת באופן משמעותי בהסבר למנגנון הבסיסי ולהתפתחות של אסטרטגיות חיסוני חדשניות^{14 ,15}. לאחרונה יצרנו מודל מורטין רלוונטי קליני. זה מודל הרומן לא רק מחקה האדם התחלה HCC והתקדמות אלא גם משקף את התכונות הטיפוסיות ביותר של המחלה האנושית כולל תפקוד המערכת החיסונית. אנחנו האפיינו את המאפיינים. הביולוגיים והאימונולוגיים שלו מינוף זה מודל הרומן, יש לנו בחנו אסטרטגיות חיסוני שונות לטיפול HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. הפלטפורמה הייחודית הזאת מאפשרת לנו ללמוד מנגנונים של עמידות חיסוני הנגרמת על ידי הגידול ולפתח אסטרטגיות טיפול הוכחה של HCC כלפי בסופו של דבר תרגום קליני.

Protocol

הערה: כל ההליכים כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי IACUC באוניברסיטת מיזורי. כל העכברים קיבלו טיפול הומאני על פי הקריטריונים המתוארים ב"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה". יש לבצע את ההליך הבא עבור בידוד תאים וחיסונים במכסה ברדס. כל המבצעים צריכים ללבוש את ציוד ההגנה האישי הסטנדרטי לטיפול בעכברים וברקמות.

1. אינדוקציה של פיברוזיס של הכבד שחמת עם הזרקת IP של פחמן טטרלוריד (CCl₄)

הערה: ראה איור 1. (CCl₄ הוא מגיב מאוד מסוכן, זה צריך להיות מטופל בזהירות עם לובש כפפות עמידות כימית)

1. השג עכברים זכרים C57BL/6J שאינם בני 6 עד 8 שבועות (ראו טבלת חומרים).
2. הכינו 10% CCl₄ (v/v) פתרון שמן תירס בשפופרת צנטריפוגה. קבע את אמצעי האחסון הכולל בהתבסס על מספר העכברים שיש להזריק (ראה שלב 1.6).
3. השימוש עכברים מתאים טיפול בטכניקה כדי לבחור עכבר אחד להזרקה.
4. לרסן באופן ידני את העכבר עם החלק הימני שלו (בטן) למעלה.
5. נקה את אתר ההזרקה על קיר הבטן של העכבר על ידי קרצוף עם 70% אלכוהול.
6. להזריק C57BL זכר/6J עכברים עם 160 μL של 10% CCl₄ פתרון על ידי הזרקת הצפק (IP) באמצעות מחט חד פעמי 25-מד.
7. ודא כי המחט חודרת רק דרך הקיר הבטן (כ 4-5 מ"מ) עם משופע בצד עד בזווית מעט ב 15-20 מעלות.
8. להזריק עכברים פעמיים בשבוע עבור סך של ארבעה שבועות-כל עכבר יקבל סך של שמונה זריקות.
   הערה: שבועיים לאחר ההזרקה האחרונה, העכברים שטופלו מוכנים לחיסון ISPL של הפטציטים אונגניים מעכברים MTD2.

2. בידוד תג-העברה של הפטציטים מקו MTD2

הערה: ראו טבלה 1 עבור מתכוני פתרונות.

תמיסת מלח מאוזנת של 10x ארל ללא Ca או Mg (EBSS ללא Ca או Mg)	4 ג ' KCl 68 g 1.4 g NaH2PO4 · H2O 10 גר' דקסטרוז להוסיף מים 1 ליטר, pH כדי 4.32 מעבר במסנן
הפתרון הראשון	20 מ"ל 10x EBSS ללא Ca או Mg 44 משחק3 1.33 מ ל 1.5 מ' הפסי 10 מ ל של 10 מ"ל הוספת מים ל 200 mL
הפתרון השני	100 מ"ל 2.2 משחק3 6.67 מ"ל 1.5 M הפסי הוספת מים ל 1 ליטר
0.75% הפתרון לקולגן	15 מ"ג קולגן סוג 1 20 מ ל של פתרון 2
בינוני מלא	2 RPMI 50 מ ל FBS מסטרפטומיצין לפניצילין 5 מ"ל

טבלה 1: מתכוני פתרונות.

1. השג שורה MTD2 עכברים³⁸ לשמש כמקור של החרופציטים אונגניים.
2. שMTD2 בגיל 5 שבועות עכברים באמצעות 2.5% isofלאנה.
   הערה: ההרדמה המתאימה תיבדק על ידי שיטת הצביטה בבוהן. בקיצור, באמצעות שתי אצבעות, לתת את הבוהן העכבר/הרגל לחיצה טובה. אם אין תגובת נסיגה, החיה שנשפט מספיק עמוק כדי להתחיל בניתוח.
3. כאשר מסומם בצורה מספקת, המקום עכברים במצב פרקדן ולתקן את הגפיים עם הקלטת כדי לספק חשיפה נאותה של משטח הבטן.
4. לבצע חתך באמצע הדרך באמצעות מספריים לאורך האורך של לינאה אלבה גדול מספיק כדי לספק חשיפה נאותה של הכבד.
5. להעביר את המעיים שמאלה כדי לספק חשיפה טובה יותר של הכבד טריאדת הפורטל.
6. נתח מעל הכבד כדי לחשוף את האובורד הנחותים (IVC).
7. לישער את האגודה מעל הכבד באמצעות מהדק עורק.
8. חזרה אל הגבול הנחות של הכבד, להשתמש מחט פרפר (לראות חומרים) כדי לקבל את הגישה IV לווריד הפורטל. תקן קטטר ביד.
9. מבשם ברציפות את הכבד של העכבר באמצעות מזרק הזרקת ב 8.9 mL/min עם 15 מ ל של פתרון 1, 15 מ ל של 0.75% קולגן פתרון 2, ו 15 מ ל של פתרון 2 באמצעות הקטטר.
10. לקצור את הכבד המקורות על ידי גזירה ונטילת מסת הגידול מ MTD2 עכברים בשפופרת חרוט 50 mL עם 10-15 mL של PBS.
11. הסר את PBS ושטוף זמן נוסף עם PBS; לא לצנטריפוגה בשלב זה.
12. חותכים את הכבד לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים ולאחר מכן לשטוף שוב עם PBS 2x כדי להסיר את הדם הנותרים.
13. הוסף 5 מ ל של מדיום RPMI להשלים את הצינור החרוט ברציפות את הכבד עם מספריים לחתיכות קטנות (< 3 מ"מ)-רקמות צריך לעבור בצורה חלקה דרך צינור 5 מ"ל.
14. הוספת RPMI השלם לנפח הסופי של 30 מ ל והשעיית הכבד באמצעות פיפטה 5 מ"ל.
15. לסנן את הפתרון המעורב עם מסננת 70 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL.
16. שטוף מסננת מספר פעמים עם RPMI מלאה ולהתאים את הנפח הסופי ל 50 mL על ידי הוספת RPMI מדיום נוספים.
17. במהירות לסובב את ההשעיה על ידי צנטריפוגה למקסימום של 500 סל ד; ברגע שהמהירות מואצת ל-50 x g, יש לעצור את הצנטריפוגה.
18. וכדורי השעיה ב -20 מ ל של PBS.
19. לספור תאים באמצעות הדרה כחול של טרילון ומכשיר הומוטומטר, ולאחר מכן להתאים את הריכוז של התא ל-2.5 x 10⁶/mL עבור החיסון לתא הבא.
    הערה: התשואה הצפויה מ 5 גרם של רקמת הגידול היא 80,000,000 hepatocytes עם יכולת קיום > 95%.

3. הMTD2 ההפטציטים מעכברים לכבד סוג פראי C57BL/6J על ידי הזרקת ISPL

1. הטכניקה האספטי צריכה לשמש בכל ההליכים
2. הC57BL את העכברים הזכריים של CCl₄שטופלו על ידי גברים עם 2.5% isofלאנה, העכברים צריכים להיות מטופלים עם חומר סיכה כדי למנוע מהעיניים להתייבש.
3. הכן מזרקים עם 200 μL של הפטציטים להזרקה.
4. כאשר מסומם בצורה מספקת, מיקום עכברים עם צד שמאל למעלה.
5. לגלח את כל האגף השמאלי של העכברים, ואז לקרצף את האזור, לסירוגין בין 70% אלכוהול ו betadine שלוש פעמים.
6. מנהל 5 מ"ג/ק"ג של carprofen subcutaneouly לפני חיתוך כירורגי.
7. לעשות חתך 1 ס מ על האגף השמאלי במקביל^{הצלעות 13} מן ההתחלה הקיצונית הקיצוני ממש מתחת לשריר עמוד השדרה.
8. לזהות את הטחול ולאחר מכן. לצבוע אותו בעזרת מלקחיים בוטים
9. מחסנית הטחול עם שני קליפים בגודל בינוני טיטניום. הניחו את שני הסרטונים בין עורק הטחול והווריד, השאירו מקום בין הקליפים לקיצוץ מאוחר יותר לאחר החיסון.
   הערה: המטרה היא לבודד את הקוטב הנחות של הטחול כדי להפחית את הסיכון של זריעה.
10. להזריק 200 μL (500,000) של hepatocytes מוכן לתוך הקוטב הנחות של הטחול באמצעות מחט G 27.
11. מחסנית את הענף הנחות של העוקץ (כלים נחותים של מוט הטחול) עם קליפ בגודל בינוני אחד.
12. חותכים את הטחול בין שני הקליפים שמוקמו בתחילה.
13. להסיר את הקוטב הנחות של הטחול שהוזרק ישירות עם תאים סרטניים.
14. השימוש 3-0 polyglactin 910 בהפרעה תפירה לסגור את שכבת השריר הפנימי.
15. השתמש הפצע מעוקר פלדה מהדקים כדי לסגור את שכבת העור החיצונית.
    הערה: אטבי פלדה מעדיפים על תפרים כדי למנוע בעלי חיים ללעוס תפרים ולהשאיר פצע פעור.
16. מנהל 5 מ"ג/ק"ג של carprofen תת-עורי לאחר תפר.
17. מניחים את כל החיות מתאושש על כרית חימום מבוקרת טמפרטורה וניטור היטב עד התאושש באופן מלא מן ההרדמה.
18. תן לעכברים גישה חופשית למים לאחר הניתוח. אם העכבר הופך להתייבש במהלך הניתוח, ניהול נוזלים תת עורית (< 1 מ ל).
19. הסר קליפי עור ב 7-10 ימים לאחר הניתוח.

תוצאות

הפטציטים אונגניים מבודדים מעכברים תגים-טרנסגניים (איור 2) נזרע בכבד של עכברים מסוג פראי על ידי הזרקה פנים-הטחול (איור 3). Hepatocytes המושתלים בהצלחה ובאמינות גדל אורתופאהנושא גידולים HCC (איור 4) עם הגידול אנטיגן ספציפי SV40 TAg (איור 5) בהגדרה של דלקת הכבד פיברוזיס ...

Discussion

עם פרוטוקול זה, הקמנו מודל מורטין אמין ומהימן של HCC כי מחקה את האדם החניכה של HCC והתקדמות. קלינית, גורמי סיכון רבים לגרום לפציעה בכבד, הכבד פיברוזיס, שחמת והשלב הסופי של HCC. בפרוטוקול שלנו, הזרקת IP של CCl₄ משמש לייצר הראשון פיברוזיס של הכבד בעכברים סוג פראי, אשר מאפשר הhepatocytes הבאים ליצור את ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close