בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

Summary

המטופל-התרבויות הנגזרות של הלבלב אדנוקרצינומה הם מודל תלת מימדי מבוסס במהירות המייצגים תאים סרטניים אפיתל הגידול עם נאמנות גבוהה, המאפשר מחקר טרנסלtional לתוך זה ממאירות קטלני. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות כדי ליצור ולהפיץ אורגנואידים, כמו גם לבצע מאמר ביולוגי רלוונטי באמצעות מודלים אלה.

Abstract

לבלב הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) הוא בין ממאירות קטלנית ביותר. לאחרונה, הדור הבא שיטות תרבות אורגאיד המאפשרות מידול תלת מימדי (3D) של מחלה זו תוארה. מודלים מסוג אורגאיד הנגזר מהמטופל (PDO) יכולים להיות מבודדים הן מדגימות הניתוח והן מהביופסיה הקטנה והצורה במהירות בתרבות. חשוב מכך, מודלים אורגנואיד לשמר את השינויים הגנטיים הפתוגניים שזוהו בגידול של המטופל, הם ניבוי של תגובת הטיפול של המטופל, ובכך מאפשר מחקרים טרנסלבותית. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מקיפים להתאמת זרימת העבודה של תרבות רקמות כדי ללמוד 3D, מטריקס מוטבע, מודלים אורגנואיד. אנו מפרטים שיטות ושיקולים עבור בידוד והפצת הראשי PDAC אורגנואידים. יתר על כן, אנו מתארים כיצד מדיה אורגאיד העידו מוכן איכות בשליטה במעבדה. לבסוף, אנו מתארים בחני האפיון המטה של מודלים אורגנואיד כגון בידוד של חומצות גרעין (DNA ו-RNA), ובדיקות סמים. חשוב לציין שיקולים קריטיים ליישום מתודולוגיה ארגונית במעבדת מחקר.

Introduction

מחלת הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) היא מחלה קטלנית המאופיינת אבחנה מאוחרת ברוב החולים, חוסר טיפולים יעילים, ושיעור כתוצאה נמוכה 5-שנה הישרדות הכוללת שנשאר פחות מ 10%¹. רק 20% מהחולים מאובחנים עם מחלה מקומית מתאים התערבות כירורגית מרפא^2,3. המטופלים הנותרים מטופלים בדרך כלל עם שילוב של סוכני כימותרפיה כי הם יעילים במיעוט של חולים^4,5. כדי לענות על הצרכים הקליניים הדחופים האלה, חוקרים עובדים באופן פעיל על אסטרטגיות גילוי מוקדם ופיתוח של טיפולים יעילים יותר. כדי להאיץ את התרגום הקליני של תגליות חשובות, מדענים מהונדסים גנטית מודלים העכבר, החולה נגזר xenografts תלי, מונאולייר תאים קווים, ו, לאחרונה, מודלים אורגאיד⁶.

תרבות תלת ממדית האפיתל אורגאיד באמצעות גורם הצמיחה ו-Wnt-ligand התנאים עשיר כדי לעורר התפשטות של תאים מחולל שינוי לראשונה תוארו על מעיים העכבר⁷ והותאמו במהירות לרקמת הלבלב האנושי נורמלי⁸. בנוסף רקמת דוטל רגילה, מתודולוגיה ארגונית מאפשרת בידוד, התרחבות, ולימוד של האדם PDAC⁸. חשוב לעשות זאת, השיטה תומכת בהקמת אורגנואידים מדגימות כירורגי, כמו גם ביופסיות מחט בסדר הליבה, המאפשר לחוקרים ללמוד את כל שלבי המחלה^9,10. מעניין, מטופל נגזר החולה לכידה היטב מתוארים הגידול תת-ממדי והוא עשוי לאפשר פיתוח של פלטפורמות רפואה מדויקת^9,11.

הפרוטוקולים הנוכחיים של הארגון עבור PDAC מאפשרים הרחבה מוצלחת של יותר מ-70% מדגימות המטופלים ממטופלים תמימים מכימותרפיה⁹. כאן אנו מציגים את האמצעים הסטנדרטיים המועסקים על ידי המעבדה שלנו כדי לבודד, להרחיב, ולאפיין את החולה הנגזרות PDAC אורגנואידים. מתודולוגיות משנה נוספות של pdac מתוארות^12,13 אך לא השוואה של שיטה זו בוצעה ביסודיות. כאשר טכנולוגיה זו היא חדשה יחסית ומתקדמת מהר, אנו מצפים כי פרוטוקולים אלה ימשיכו להתפתח ולשפר; עם זאת, העקרונות של הטיפול ברקמה ותרבות אורגאידית ימשיכו להיות שימושיים.

Protocol

כל אוסף רקמת האדם לשימוש מחקר נבדק ואושר על ידי לוח הסקירה הפנימי שלנו (IRB). כל הפרוטוקולים הבאים מתבצעים בתנאים אספטי בסביבת המעבדה לתרבות רקמת היונקים.

1. הכנת מדיה

1. הכנה למדיה ממוזגת.
   הערה: התקשורת האנושית אורגאיד הלבלב דורש גורמים צמיחה שופע חומרים מזינים, כמו גם תוספת מדיה ממוזג כדי לספק גירוי גדילה מספיק עבור התרחבות אורגאיד. שני המדיומים הממוזגים המתוארים להלן מוכנים מקווי תאים זמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים). עבור פרוטוקולים וחומרים מלאים, עיין באתרי האינטרנט של היצרנים.
   1. הפקת מדיה ממוזגת R-spondin1 בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      1. ראשית, להרחיב את התאים 293T להביע R-spondin1 באמצעות אנטיביוטי המתאים (Zeocin) שיטות בחירה בנוכחות של סרום שופע (10%). כאשר מייצרים מדיה ממוזג, לסגת ולשטוף את בחירת אנטיביוטיקה סרום כך לא אנטיביוטיקה ונסיוב נמצאים במדיה הממוזג הסופי. חשוב מכך, המדיה הממוזגת חייב להיות סינון מחוטא לאחר האוסף (0.2 μm) כדי למנוע זיהום צולב.
      2. אחסון מדיה ממוזגת בגרשיים ב-4 ° צ' לשימוש לטווח קצר (בתוך 6 חודשים) או ב-20 ° c לאכסון לטווח ארוך (למעלה מ -6 חודשים). יש להימנע ממחזורים של הפשרת ההקפאה.
   2. הפקת מדיה ממוזגת של L-Wnt-3A בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      1. ראשית, להרחיב את ה-L-M (TK-) תאים המבטא L-Wnt-3A באמצעות אנטיביוטי מתאים (G-418) שיטות בחירה בנוכחות של סרום שופע (10%). בעת הפקת מדיה ממוזגת, לסגת ולשטוף את בחירת אנטיביוטי כך שאין אנטיביוטיקה קיים במדיה הממוזג הסופי; עם זאת, לשמור על סרום לאורך כל culturing ומיזוג. חשוב מדיה ממוזג שנאסף חייב להיות מסנן עיקור (0.2 μm) כדי למנוע זיהום צולב.
      2. אחסן את המדיה הממוזגת המצוטטת ב-4 ° צ' לשימוש לטווח קצר, או 20 ° צ' לאחסון לטווח ארוך. יש להימנע ממחזורים של הפשרת ההקפאה.
   3. עבור בקרת איכות, בצע בדיקת TOPFLASH כדי לבדוק את הפעילות של Wnt של R-spondin1 והמדיה הממוזגת של L-Wnt-3A בלבד ובשילוב בהתאם לפרוטוקול שפורסם לפני כן¹⁴.
2. הכנת המדיה הבזליים: השתמש במדיה הבזליים להכנת מדיה ארגונית מלאה, כמו גם שטיפת שלבים לעבודה ארגונית. מוסף מתקדם DMEM/F-12 עם גלוטמין בריכוז סופי של 1x, HEPES (10 מ"מ), ו פניצילין/סטרפטומיצין (100 U/mL). אחסן את המדיה הבזליים ב-4 ° c.
3. הכנת מדיה להשלים אורגנואיד: תוספת המדיה הבזליים עם מדיה ממוזגת R-spondin1 בריכוז הסופי של 10% v/v, L-Wnt-3A התקשורת הממוזגת בריכוז הסופי של 50% v/v, האדם EGF (50 ng/mL), האדם FGF (100 ng/mL), אדם גסטרין I (10 ננומטר), עכבר הראש (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), תוספת B27 (1x), ניטינאמיד (10 מ"מ), N-acetylcysteine (1.25 mM), ו Primocin (100 μg/mL).
   1. עבור מבודדים ארגונית מרכזית, תרבויות מופמות ותרבויות שמתחילות בתאים בודדים, כוללות את מעכב Rho קינאז Y-27632 בריכוז סופי של 10.5 μM.
   2. הכינו את המדיה המלאה של האדם בקרח והחנות ב -4 ° c לשימוש בתוך חודש אחד. מסיבה זו, אנו ממליצים על הכנת מדיה שבועית טרייה.

2. בידוד אורגנואידים של PDAC

הערה: הפשרת התמיסה (BME) (גורם הגדילה מופחת; ראו טבלת חומרים) על קרח בסביבה של 4 ° c (מקרר או חדר קר) לפחות 12 שעות לפני השימוש. מודטת לוחיות התרבות של הרקמה לתרבות האורגאידית בחממה 37 ° c לפחות 12 שעות לפני השימוש.

1. לאסוף ולהעביר דגימה בניתוח הסרת הגידול למחקר בפתרון אחסון באגירה כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. השתמש במדיה בבזליים או בפתרון אחסון מסחרי של רקמות.
2. המשך לבודד אורגנואידים בהקדם האפשרי לאחר קבלת הדגימה. ניתן לאחסן את הרקמה בתמיסה של עד 24 שעות לאחר הניתוח ועדיין להניב את ארגון האחסון.
3. פעם אחת במעבדה, להעביר גידול לצלחת 10 ס מ רקמות רקמה להסיר פתרון אחסון.
4. בזמן הטיפול ברקמה עם מלקחיים מתכתיים, המחגון את הגידול עם אזמל מ#10 לרסיסים קטנים של 1 מ"מ³ או קטן יותר. שברי גדול יותר ייקח זמן רב יותר לעכל; לכן, המטרה ליצור מידות של רקמה הומוגנית. אם הרקמה כבר מצטברת או קטנה יותר מ-1 מ"מ³ קטעים, דלג על שלב זה.
5. העבר את שברי הרקמה לצינור בצורת 15 מ ל המכיל 10 מ ל של אמצעי התקשורת הבזליים. מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 5 דקות. לאחר ספין, להסיר את התקשורת בסיס בקפידה כדי למנוע אובדן שברי הרקמה.
6. לצינור המכיל את שברי רקמות להוסיף 9 מ ל של מדיה בסיס 1 מ ל של 10x עדין הקולגן התמיסה/Hyaluronidase פתרון. כדי להימנע מהשיא של תאים במהלך העיכול, מוסף פתרון זה עם 20 μL של 10 מ"ג/mL DNAse I פתרון. מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
7. מודיית את העיכול האנזימטי ב-37 ° c על מסובבי או מסובב. לערבוב הולם במהלך העיכול, שברי הרקמה חייבים כל הזמן לנוע דרך הפתרון.
   הערה: התזמון לדיסוציאציה האנזימטית של הגידול חייב להיקבע בהתאם לכל דגימה. מידת העיכול המוצלחת של הגידול מתאפיינת בירידה בגודל שברי הרקמה עד שאינם מסומנים בבירור לעין העירומה. במקביל, האטימות של התמיסה תגדיל כמו שברי רקמה מיקרוסקופיים משתחררים.
8. לאחר 30 דקות, הסירו את צינורית החרוט מהאינקובטור 37 ° c והתבוננו. אם שברי הרקמה עדיין גלויים בבירור, המשיכו את הדיסוציאציה ב-37 ° צ' עם ערבוב קבוע. חזור על התבוננות זו כל 30 דקות עד שרוב או כל שברי הרקמה השתכבו. בהתאם לחריפות של ערבוב, כמו גם את גודל וכמות של שברי הגידול, שלב זה יכול לקחת מעט כמו 30 דקות עבור דגימות קטנות או כל עוד 12 h עבור דגימות גידול גדול יותר.
9. לאחר שדיסוציאציה האנזימטית תושלם, צנטריפוגה את הצינור ב-200 x g עבור 5 דקות. לאחר ספין, כדורית התא צריך להיות גלוי, supernatant צריך להיות ברור, המציין כי כל התאים כבר יצא מהפתרון. , אם זה לא המקרה. חזור על הספין
10. הסר בזהירות את הסופרנטאנט כדי להימנע מאיבוד הגלולה הסלולרית. מיד לשטוף את התאים עם 10 מ"ל מדיה בסיס על ידי ערבוב בעדינות את הצינורות עם היפוך. צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 5 דקות. בזהירות להסיר את המדיה הבזליים כדי למנוע אובדן תאים ולחזור על שלב זה כביסה פעם נוספת עבור סך של שני שטיפת.
11. לאחר השטיפה השנייה, להסיר את כל המדיה בסיס בזהירות למקם את הצינור על הקרח עבור 5 דקות.
12. בשלב זה, מניחים מדיה מלאה אורגנואיד באמבט מים 37 ° c כדי לחמם מראש.
13. מערבבים את הגלולה התא עם קרח קר BME בזמן שמירה על הצינור על הקרח. . צפיפות הזריעה צריכה להיות גבוהה לבידוד אורגאיד עבור גלולה קטנה (~ 50 μL) השתמש 200 μL של BME, בעוד עבור גלולה גדולה (~ מ200 μL) השתמש 800 μL של BME. מערבבים את התאים ואת BME על הקרח באמצעות מp200 הצינורות עד הפתרון מופיע הומוגנית תוך הימנעות יצירת בועות בפתרון.
14. ספוט כיפת 100 μL במרכזו של באר של צלחת טרום מחומם 12 היטב באמצעות מp200. חזור על כך עד שכל פתרון BME הושם. העבר בזהירות את הצלחת לחממה 37 ° c כדי לאפשר ג'ל BME כדי לגבש.
15. לאחר 10 דקות, לאחזר את הצלחת ולהוסיף 1 מ ל של מדיה להשלים טרום מחומם ארגונית מלאה לכל טוב. מחלק את התקשורת בצד הבאר כדי למנוע הפרעה של כיפת BME.
16. שימו לב לקטעי התאים בעזרת מיקרוסקופ הפוך לתרבות הרקמה באמצעות עדשת 4x בברייטפילד.
    הערה: תאים בודדים ושברי רקמה מיקרוסקופיים צריכים להיות גלויים בבירור. בידוד מוצלח מאופיין במראה של יותר מ 10 אורגנואידים לאחר 24 – 48 h; התרבות צריכה להיות מדוברת בתוך שבוע אחד. כמו דגימות הגידול הם הטרוסוגני, כמה בדלאידים מסוימים הם מאתגרת יותר כמו רק אורגנואידים כמה לגדול לכל טוב, כפי שמוצג באיור 1. במקרה זה, אפשר לתרבות להימשך עד שבועיים כדי למקסם את מספר התאים הזמינים לצורך הזדקנות. כדי להסביר את צריכת המדיה והאידוי במהלך התרבות, למעלה את התרבויות עם 200 μL של התקשורת המלאה מחומם מראש המלא כל 5 ימים.

3. הפסג ' אורגנואידים של PDAC

1. להחזיר את הצלחת. מחממה לתרבות הרקמה עם מרים תא סטרילי, להרים בעדינות את הכיפה BME כך הוא צף במדיה המלאה. הימנע מגרד את החלק התחתון של הבאר כדי לא להסיר את כל התאים המונאולייר המצורפת פלסטיק, כמו אלה הם בדרך כלל פיברופיצוצים.
2. עם פיפטה p1000, העבר בזהירות את כיפת BME ואת אמצעי התקשורת ל-15 מ"ל שפופרת חרוט. חזור על שלב זה עבור כל מתאים המכילים היטב אורגנואיד.
3. לשטוף בעדינות כל טוב שנקצרו עם 1 מ ל של המדיה הבזליים קר, ולהעביר את הצינור 15 מ"ל המכיל את האורגנואידים.
4. ביסודיות לערבב את הפתרון ואת אורגנואידים עם p1000 tte ו ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות. לאחר ספינינג, שכבת BME המכילה אורגנואידים בהשעיה וגלולה אורגאידית יופיע בתחתית הצינור. הסר בזהירות את הסופרנטאנט, הימנעות מאובדן השכבה BME/אורגנואיד. . שים את השפופרת על הקרח
5. הוסף 10 מ ל של הקרח קר פתרון שחזור התא (CRS) לצינור ולערבב ביסודיות על ידי היפוך. הדבר יכווץ את מטריצות החלבון של ה-BME ב-4 ° c. דגירה על קרח 30 דקות תוך ערבוב כל 3 דקות על ידי היפוך. אם הוא זמין, הניחו את הצינורית על מערבל מסתובב בחדר קר או במקרר בגודל 4 ° c במשך 30 דקות.
6. לאחר הדגירה 30 דקות, ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות. הגלולה הארגונית צריכה להיות ברורה בעוד שכבת BME צריך להיעלם. אם שכבת BME מוקטן בגודל אך עדיין גלוי, מודמת עבור 30 דקות נוספות ב 4 ° c עם ערבוב וחוזר ספין.
7. הסירו את הCRS מאחורי. הגלולה האורגאידית שטוף את האורגנואידים עם מדיה בבסיס של 10 מ ל על ידי ערבוב עם היפוך. ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant. מניחים את הצינור עם הגלולה האורגאידית על הקרח לפחות 5 דקות.
8. באופן אופציונלי, אם הכנה תא בודד רצוי, מארג את האורגנואידים עם 3 מ ל טריפסין שיושלם עם 30 μL של 10 מ"ג/mL DNAse הפתרון כדי למנוע הכנת תאים במהלך העיכול.
   1. מודיית את התגובה אנזימטית ב 37 ° c עם היפוך עדין ערבוב כל 2 דקות עד 10 דקות. מוניטור ולאשר מוצלחת הדיסוציאציה תא בודד תחת מיקרוסקופ שדה ברייטאני.
   2. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, להוסיף 10 מ ל של התקשורת הבזטית קר קרח ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות.
   3. שטוף תאים עם 10 מ"ל מדיה בסיס על ידי ערבוב עם היפוך עדין. מסתובבים ב200 x g עבור 5 דקות ומסירים את הסופרנטאנט וחוזרים על הכביסה עוד פעם אחת. מניחים את הצינור עם הגלולה תא על הקרח לפחות 5 דקות.
      הערה: אנו ממליצים לבצע שלב זה כל 3-5 מעברים במהלך תחזוקה סדירה של האורגנואידים כדי ליצור תרבות הומוגנית עם מספר רב של אורגנואידים.
9. הוסף קרח קר BME אל הגלולה תא ולערבב בעדינות על הקרח עד הפתרון הוא הומוגנית באמצעות מp200. בעוד הימנעות לייצר בועות בתערובת, פיפטה למעלה ולמטה לפחות 5-10x, הצבת קצה של הפיפטה קרוב לתחתית הצינור כדי לעזור מכנית לשבור את האורגנואידים. כמדריך, להשתמש 4 – 6x את הנפח של BME/כדורית תא כגון יחס פיצול הוא לא יותר מ 1:2 מעבר אחד לשני.
10. ספוט כיפת 100 μL במרכזו של באר של צלחת טרום מחומם 12 היטב באמצעות פיפטה p200; חזור על הפעולה עד שכל פתרון BME הגיע לפעולה. העבר בזהירות את הצלחת לחממה 37 ° c כדי לאפשר ג'ל BME כדי לגבש. לאחר 10 דקות, לאחזר את הצלחת ולהוסיף 1 מ ל של מדיה להשלים טרום מחומם ארגונית מלאה לכל טוב. מחלק את התקשורת בצד הבאר כדי למנוע הפרעה של כיפת BME.
11. אורגנואידים צריך לבצע רפורמה ולהתחיל לצמוח בתוך 24 h. תרבויות אורגנואיד הם בדרך כלל מעבר לגיל 7-10 ימים בהתאם לצפיפות התרבות והפצת התאים. במקרה הצורך, למעלה את התרבויות עם 200 μL של מדיה מראש מחומם מלאה אורגנואיד כל 5 ימים כדי לפצות על גורם הגדילה והתאיידות.

4. הקפאה והפשרה של אורגנואידים PDAC

1. כדי להקפיא את האורגנואידים, המשך לקצור את האורגנואידים ולהארת את ה-BME כפי שמתואר בשלבים 3.1 – 3.7.
2. לתוך הגלולה תא, להוסיף 1 מ ל של הקפאת מדיה, לערבב בעדינות, ולהעביר את התערובת לקריובקבוקון מראש המסומן.
3. מניחים את הקריובקבוקון במיכל קפוא כדי לשמור על ירידה בטמפרטורה מתמדת ובמקום במקפיא של 80 ° c. לאחר 24 עד 48 h, להעביר את הבקבוקונים קפוא לאחסון חנקן נוזלי. אורגנואידים יכול להיות הקפאה במשך חודשים באמצעות שיטה זו.
4. כדי להפשיר את האורגנואידים, להחזיר. את הקריובקבוקון הקפוא מאחסון חנקן נוזלי להעביר את הבקבוקון הקפוא על. קרח יבש לחדר התרבות של הרקמה
5. מניחים את ההקפאה הקפואה באמבט המים 37 ° c כדי להפשיר במהירות את האורגנואידים ולהעביר את התכולה של הבקבוקון ל-15 מ ל שפופרת חרוטי המכילה 9 מ ל של אמצעי התקשורת הבזליים התחממו לטמפרטורת החדר.
6. ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant. מניחים את הצינור עם הגלולה האורגאידית על הקרח לפחות 5 דקות.
7. המשך להשעות מחדש ב-BME ובצלחת האורגנואידים כמתואר בשלבים 3.9 – 3.11.
   הערה: תרבויות אורגנואיד להתאושש לאט לאחר מחזור הקפאה/הפשרה, ולכן תרבויות יכול להיות גדל עד שבועיים לפני שאתה מקבל הזדקנות.

5. איפיון אורגנואידים של PDAC

הערה: האפיון של האורגנואידים צריך להתבצע על תרבות מבוססת לאחר מספר מעברים כדי לצמצם את הסיכון לזיהום מסוגי תאים שאינם אפיתל כגון פיברותקיעות ותאים חיסוניים.

1. מיצוי חומצת גרעין מאורגנואידים של PDAC
   1. מארגני צלחות על לוח 12 היטב המוקדש החילוץ חומצה גרעין. צלחת לא יותר מ-100 μL של BME לכל טוב. לתשואה מספקת של דנ א/RNA, צלחת לפחות 2 – 4 בארות לכל תרבות. לגדל אורגנואידים עבור עד 5 ימים עד התרבויות קרובות confluent אך נטול פסולת התא מוגזמת המצטבר בתרבויות לטווח ארוך.
   2. להחזיר את הצלחת מהאינקובטור 37 ° c ולהסיר לחלוטין את כל העקבות של המדיה המלאה אורגאיד, משאיר רק את כיפת BME המכילה את האורגנואידים על הצלחת.
   3. הוסף 900 μL של חומצה פנול מגיב ( לראות את הטבלה של חומרים) לכל טוב ולערבב ביסודיות באמצעות p1000 tte עד הפתרון הופך הומוגנית. BME יהיה לחלוטין מומס חומצה פנול מגיב ואורגנואידים יהיה lyse לאחר 5 דקות הדגירה הקטנה.
      התראה: חומצה פנול היא כימיה מסוכנת שיכולה לגרום לכוויות כימיות. טפל בזהירות בעזרת הגנות וטכניקה מתאימים.
   4. העבר את הפתרון האחיד לשפופרת של 2 מ"ל והוסף 200 μL של כלורופורם. דגירה 5 דקות ו צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
   5. המשך לחילוץ RNA ו-DNA בהתאם לפרוטוקול של היצרן. RNA יכול להיות מופק מן השלב מימית בעוד DNA ניתן להפיק מן השלב הבין ואורגני. פעם מטוהר וכימות, RNA ו-DNA מבודדים מבארות שונות של אותה תרבות ניתן למאגר כדי להגדיל את התשואה.
      הערה: (1) בעוד אנו ממליצים בחום על שימוש זה חומצות גרעין שיטת החילוץ עבור RNA, יש הרבה שיטות טובות לבידוד DNA מתאים מתורבתים. (2) כדי לוודא את הנוכחות של תאים סרטניים בתוך התרבות ארגונית, אנו ממליצים על רצפי ה-DNA באמצעות שיטת הדור הבא המועדף שלך רצף כדי לזהות מוטציות בתוך הגנים המכילים PDAC (קראס, TP53, SMAD4, CDKN2A).
2. פרמקוקינהקלדה של מארגני PDAC
   1. בידוד תאים בודדים מאורגנואידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1 – 3.8. כדי למקסם את מספר התא, לקצור לפחות 10 בארות שוטפת של צלחת 12 היטב
   2. השעיה מחדש של תאים בודדים ב 1 mL מדיה להשלים אורגאיד. הנוכחות של גושי תאים קטנים (~ 2-10 תאים) הוא מקובל, עם זאת הגושים הגדולים התאים יהיה שלילי להשפיע על ניתוח במורד הזרם.
   3. ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ויכולת הקלט של תא. לחשב את המספר הכולל של תאים ותאים קיימא נוכח ההשעיה 1 mL.
   4. עבור בדיקות טיפוליות, צלחת 1,000 תאים קיימא לכל טוב של 384 צלחת הבאר. עבור צלחת הבאר 384 אנו מעריכים שנשתמש 400,000 תאים קיימא (מחושב עבור 400 בארות).
   5. הכנת תאים עבור ציפוי על ידי ערבוב על קרח 800 μL של BME עם 7.2 mL של מדיה מלאה אורגאיד המכיל את התאים. שמור על התערובת על קרח ועל צלחת 20 μL לכל טוב של 384 צלחת היטב. השתמש בפיפטה בן 12 ערוצים ובמאגר שנשמר על הקרח כדי להתאים את התאים ביעילות. כדי למנוע אידוי מוגזם מן הצלחת, הבארות החיצוניות יכול לשמש כמאגר (60 μL PBS או מים לכל טוב), אבל זה יוביל לאובדן של 76 בארות ניסיוני.
   6. לסובב את הצלחת למטה ב 100 x g עבור 1 דקות בדלי הנדנדה. זה מאפשר את הנפח 20 μL קטן ו אורגנואידים להתיישב בתחתית הצלחת.
   7. מניחים צלחת בחממה 37 מעלות צלזיוס של הרקמה כדי לאפשר לאורגנואידים להיווצר. לאחר 24 שעות, לבדוק נוכחות של אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד.
   8. המשך מינון תרכובות טיפוליות מומס DMSO אל הצלחת באמצעות מדפסת סמים או מכשיר שווה ערך. בדוק כל מינון של סמים. בבארות של שלישיה כדי לבצע ניתוח מינון אפקטיבי התגובה, לקבוע את טווח המינון עבור כל תרופה באופן אמפירי, החל עם נמוך, לא יעיל, מינון וסיום עם מינון גבוה שבו ההשפעה המקסימלית היא נצפתה. דוגמאות של טווחי מינון עבור תרכובות כימותרפיות פורסמו לאחרונה⁹.
   9. לחשוף את התאים לתרכובות הטיפוליות במשך 3 – 5 ימים.
   10. באופן אופציונלי, בסוף הטיפול, התמונה הצלחת להעריך את ההשפעה הטיפולית על גודל, מספר, מורפולוגיה.
   11. העריכו את הכדאיות באמצעות 20 μL לכל היותר של היכולת לאור היכולת הממוצעת של תא (ראה טבלת חומרים) לפי פרוטוקול היצרן. ליומטר יהיה צורך ברכישת נתונים ובתוכנה גראפית לניתוח נתונים.

תוצאות

כדי להמחיש את האתגרים הקשורים עם בידוד אורגנואידים מ PDAC, אנו מראים את הקמתה של החולה מטופל התרבות האורגאידית מדגימה קטנה hypocellular הגידול. לאחר ציפוי ראשוני, רק כמה אורגנואידים היו גלויים לעין, כפי שמוצג באיור 1. לאורגנואידים הורשו לגדול במשך השבוע השני והיו מעבר בהתאם לפרוטו?...

Discussion

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הנוכחיים לבידוד, הרחבה ואפיון של מטופלים שמקורם בארגון PDAC. שיעור ההצלחה הנוכחי שלנו של הקמת תרבות ארגונית הוא מעל 70%; לכן, שיטות אלה עדיין לא שלמות וצפויים לשפר ולהתפתח עם הזמן. יש להתחשב בגודל המדגם, בדומה ל-PDAC בעל cellularity-הנאופלסטית נמוכה. כתוצאה מכך, דגימות קט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates	Olympus	25-106
15 ml LoBind conical tubes	Eppendorf	EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates	Corning	4588	Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01	TOCRIS	2939
ADV DMEM	ThermoFisher	12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow	Promega	G7570	Luminescence cell viability reagent
Chloroform	Sigma	C2432
Computer
CryoStor CS10	StemCELL Tech	07930	Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells	Trevigen	3710-001-K
DMEM	ATCC	30-2002
DNase I	Sigma	D5025
Drug printer	Tecan	D300e	This is the drug printer we use in our laboratory
Excel			For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
FBS	ThermoFisher	16000044
G-418	ThermoFisher	10131035
Gastrin I (human)	TOCRIS	3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase	STEMCELL Tech	7919
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061	Glutamine solution
GraphPad Prism			For data analysis
HEPES	ThermoFisher	15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells	ATCC	CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi biotec	130-100-008
Matrigel Matrix	Corning	356230	Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS	ThermoFisher	10010049
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher	15630080
primocin	InvivoGen	ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm)	ThermoFisher	121-0020
Recombinant Human FGF-10	Peprotech	100-26
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade	VWR	89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm	Olympus	25-202
TRIZol	ThermoFisher	15596018	Acid Phenol solution
TrypLE Express	ThermoFisher	12605010
Y-27632	Sigma	Y0503
Zeocin	ThermoFisher	R25001