זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

Summary

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

Abstract

חלבון s-אכלציה, המכונה גם S-palmitoylation, הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה של שאריות ציסטאין עם חומצות שומן ארוכות בשרשרת באמצעות בונד לבנה thioester. S-אכלציה, המתעוררים כמנגנון הרגולציה הנרחב, יכול לווסת כמעט את כל ההיבטים של הפעילות הביולוגית של חלבונים, מפני היווצרות מורכבים לסחר בחלבונים ויציבות חלבונים. ההתקדמות האחרונה להבנת התפקוד הביולוגי של חלבון S-אכלציה הושגה בעיקר בשל התפתחות הכלים הביוכימיים החדשניים המאפשרים גילוי חזק ורגיש של חלבון S-אכלציה במגוון דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מתארים לכידה בסיוע של acyl שרף (Acyl-מירוץ), שיטה שפותחה לאחרונה מבוסס על לכידת סלקטיבי של חלבונים S-acylated על ידי החרוזים הספרדית thiol-תגובתי. לעומת הגישות הקיימות, Acyl-מירוץ דורש פחות שלבים והוא יכול להניב תוצאות אמינות יותר כאשר ביחד עם ספקטרומטר המסה לזיהוי מטרות הרומן S-אכלציה. מגבלה מרכזית בטכניקה זו היא חוסר יכולת להפלות בין מינים של חומצת שומן המחוברים לציסטרינס באמצעות אותו קשר.

Introduction

S-אכלציה הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה מעורבים תוספת של שרשרת acylation שומן לשאריות ציסטאין פנימי על חלבון היעד באמצעות בונד לבנה thioester¹. הוא דווח לראשונה כשינוי של חלבונים עם palmitate, חומצה שומן רווי 16 פחמן², ולכן שינוי זה מכונה לעתים קרובות S-palmitoyלציה. בנוסף palmitate, חלבונים יכולים להיות שונה למדי על ידי מגוון רחב יותר וקצר יותר רווי (myristate ו stearate), חד (oleate) ו רב בלתי רווי (ארכאידיט ו eאיסאופנטאנואט) חומצות שומן^3,4,5,6,7. בתאי איקריוטית, S-אכלציה הוא מזרז על ידי משפחה של אנזימים המכונה acyltransferחלבונים החלבון ואת התגובה הפוכה של ציסטאין דאכלציה הוא מזרז על ידי חלבון החלבונים, שרובם עדיין להישאר המסתורית⁸.

היכולת של הקשר thioester עושה את זה שינוי השומנים הפיך, המאפשר לו להסדיר באופן דינאמי באשכולות חלבון, פלזמה ממברנה לוקליזציה, סחר תאיים, אינטראקציות חלבונים חלבון ויציבות חלבון^9,10. כתוצאה מכך, S-אכלציה נקשר להפרעות מספר כולל מחלת הנטינגטון, מחלת אלצהיימר ומספר סוגים של סרטן (ערמונית, קיבה, שלפוחית השתן, ריאות, המעי הגס), אשר מחייב פיתוח של שיטות אמינות לזהות את שינוי החלבון הפוסט-טרנסלסטי¹¹.

מטבולית תיוג עם רדיואקטיבי ([³H],^[14ג] או [¹²⁵אני]) palmitate היתה אחת הגישות הראשונות שפותחו כדי לשנות את החלבון S-אכלציה^12,13,14. עם זאת, שיטות מבוססות רדיואולבלינג מציגים חששות בריאותיים, הם לא רגישים מאוד, זמן רב, ורק לגלות lipidation של חלבונים שופע מאוד¹⁵. חלופה מהירה ולא רדיואקטיבית radiolabeling היא תיוג מטבולית עם בדיקה חומצות שומן bioorthogonal, אשר משמש באופן שגרתי כדי שיטת הדינמיקה של חלבון S-אכלציה¹⁶. בשיטה זו, חומצת שומן עם כתב כימי (הקבוצה האלבית או עזידה) משולבים בחלבון S-acylated על ידי חלבון acyltransferase. התגובה של עזידה-אלקין (לחץ על כימיה) יכולה לשמש לחיבור קבוצה פונקציונליזציה, כגון fluorophore או biotin, לחומצת השומן המשולבת המאפשרת זיהוי של חלבון ה-S-acylated^17,18,19.

Acyl-ביוטין החליפין (אייב) היא אחת השיטות הביוכימי בשימוש נרחב לכידה וזיהוי של חלבונים S-acylated העוקף כמה חסרונות של תיוג מטבולית כגון חוסר התאמה לדגימות רקמות¹⁵. ניתן ליישם שיטה זו לניתוח S-acylation במגוון מגוון של דגימות ביולוגיות, כולל רקמות ודגימות תאים קפואים^20,21. שיטה זו מבוססת על מחשוף סלקטיבי של הקשר בין הקבוצה acyl ושאריות ציסטאין על ידי הידרוקסילאמין נייטרלי. הקבוצות המשוחררות שוחררו לאחר מכן באמצעות הנגזרת הביוטין התגובתית. חלבונים biotinylated שנוצר לאחר מכן מטוהרים אהדה באמצעות streptavidin agarose ונותחו על ידי החיסונית.

גישה חלופית הנקראת acyl שרף בסיוע לכידת (acyl מירוץ) הוצגה מאוחר יותר להחליף את הצעד biotinylation עם בניינים ישירים של cysteines חינם על ידי שרף thiol-תגובתי^22,23. שיטה זו יש פחות צעדים לעומת אייב ובאופן דומה ניתן להשתמש כדי לזהות חלבון S-אכלציה במגוון רחב של דגימות¹.

Acyl-מירוץ מורכב 4 צעדים עיקריים (איור 1),
1. חסימת קבוצות תיול חינם;
2. מחשוף סלקטיבי של בונד של ציסטאין thioester עם הידרוקסילין נייטרלי (HAM) לחשוף את הקבוצות ציסטאין.
3. לכידת cysteines הליפינס עם שרף מגיב thiol;
4. העשרה סלקטיבית של חלבוני S-acylated לאחר הימנעות עם הפחתת מאגר.

את החלבונים שנתפסו ניתן לנתח על ידי חיסוני או נתון המסה ספקטרומטריה (MS) מבוסס פרוטאומניקס להעריך את S-acylated פרוטדום במגוון מגוון של מינים ורקמות^22,24,25. אתרים בודדים S-אכלציה ניתן גם לזהות על ידי טריפסין העיכול של חלבונים שנתפסו ניתוח של פפטידים הנובעים על ידי LC-MS/MS²². כאן, אנו מדגימים כיצד acyl מירוץ יכול לשמש זיהוי סימולטני של S-האכלציה של חלבונים מרובים הן בקו התא וגם דגימת רקמה.

Protocol

עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הורדמים על פי הנחיות NIH. הוועדה לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת טקסס מדעי הבריאות המרכז ביוסטון אישר את כל העבודה בעלי חיים.

1. הכנת ליקוטים סלולריים

1. הכן את מאגר הליזה כמתואר בטבלה 1. כדי 10 mL של PBS, להוסיף 0.1 g של n-dodecyl β-D-מלטוסייד אבקת כביסה (DDM) ולסובב להתמוסס. הוסף 100 μL של קוקטייל פוספאטאז מעכבי 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 מ"מ) ו מעכב פרוטאז קוקטייל (1x) ולצנן את המאגר על הקרח לפני השימוש.
2. העברת מדיה נדרש המכיל תאים מהאינקובטור לתוך 15 מ"ל או 50 mL מצינורות ותאי ספין ב 350 x g עבור 5 דקות ו-מדלל כדי להיפטר כל פסולת תא.
   הערה: השתמשנו 1 x 10⁷ תאים עבור כל תגובה מירוץ acyl להתבצע.
3. לשטוף את הגלולה על ידי השעיית מחדש ב 5 מ ל של PBS ו ספינינג ב 350 x g עבור 5 דקות.
   הערה: בצע את השלב 1.3 במהירות כדי להימנע מפירוק תאים עקב הדגירה המורחבת ב-PBS.
4. הוסף 600 μL של מאגר הליזה שהוכן בשלב 1.1 לגלולה ו lyse אותו על ידי טלטול ב 1500 rpm ב שייקר תרמית עבור 30 דקות ב 4 ° c.
5. ברור lysates על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g ב 4 ° צ' עבור 30 דקות כדי כדור ניקוי-חומרים לא מסיסים. לאסוף נקי ליפוסט בקירור טרום מקורר 1.5 מ"ל microfuge mL ולשמור אותם על קרח.
6. בצע ברדפורד/BCA שיטת הערכת ריכוז החלבון. זה קריטי להבטיח את אותה כמות של חלבון על פני דגימות שונות לפני ביצוע הניסוי. אנו ממליצים להשתמש לפחות 500 μg של חלבון לכל תגובה.
   הערה: בניסויים המתוארים, השתמשנו בתאי השימוש בתרבית (ג'ורקאט) והטחול הראשוני מרקמת העכברים. שיטת הליזה שתוארה לעיל יכולה להיות מאומצת גם לסוגי תאים אחרים. ריכוז החלבון הממוצע המתקבל עבור סוגי תאים הנ ל הוא כ 500 μg לכל 1 x 10⁷ תאים. תאים ג'ורקאט היו שמרו ב-RPMI-1640 בינוני שונה להכיל 2 מ"מ L-גלוטמין, 10 מ"מ HEPES, 1 mM נתרן פירובט, 4,500 mg/L גלוקוז, ו 1,500 mg/L נתרן ביקרבונט יושלם עם 10% FBS ב 37 ° צ' עם 5% CO₂. השתמשנו ב-1 x 10⁷ . בתאי ג'ורקאט לכל תגובה הטחול הראשי מבודדים מרקמת הטחול של העכבר כמתואר²⁶. בקצרה, רקמת הטחול היה מיצה על קרח, ואחריו הליזה של אריתרופוציטים בפתרון היפוטון והפרדה מ לימפוציטים על ידי צנטריפוגה. השתמשנו 1 x 10⁷ תאים ראשוניים לכל תגובה.

2. acyl מירוץ: חסימת של הקבוצות תיול חינם

הערה: ניתן לבצע את כל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר (RT).

1. העברת ליפוסט לתוך שפופרת טריים 1.5 mL microfuge ולבצע כלורופורם-מתנול (CM) משקעים כמתואר להלן.
   1. הוסף מתנול (MeOH) ו כלורופורם (CHCl₃) אל הליפוסט ביחס הסופי של Lysate: Meoh: chcl₃ של 2:2:1 ולנער במרץ כדי ליצור השעיה הומוגנית.
   2. ספין ב 10,000 x g עבור 5 דקות כדי ליצור גלולה ("פנקייק") בשלב בין שלבים מימית ואורגני.
   3. להטות את הצינור ומכה ממיסים ככל האפשר באמצעות מחט או טיפ טעינת ג'ל.
   4. האוויר יבש את הגלולה חלבון במשך כמה דקות בעדינות לשטוף אותו על ידי הוספת 600 μL של MeOH ו ערבוב בעדינות כדי להימנע מפירוק הגלולה
   5. הסר בזהירות את הנותרים MeOH ויבש את הגלולה חלבון על הספסל במשך כ 5 דקות.
   6. אופציונלי לבצע צעד צנטריפוגה נוסף כדי לסובב את כל הגלולה שבורה לאחר שטיפת MeOH כדי למנוע אובדן של דגימת.
      הערה: ניתן לעצור את הניסוי לאחר משקעים של CM. לאחר הגלולה מושגת, זה יכול להיות מאוחסן ב 500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע.
      1. מפזר את החלבון גלולה ב 200 μL של מאגר 2SHB על ידי vortexing ב 42 ° צ'/1500 סל ד ב שייקר תרמית עד התחתית התפרקה.
   7. אופציונלי דגירה של 5 – 10 דקות באמבט מים sonicating כדי לפזר את הגלולה.
      הערה: אורך הsonication משתנה בהתאם לסיסות החומר. עם זאת, sonication ממושכת עלולה לגרום לירידה בחלבון.
2. הכינו 0.2%% מתיל מתיונין (v/v) ב-2SHB על-ידי הוספת 2 μL של MMTS ל 998 μL של מאגר 2SHB.
   הערה: השימוש הטרי 0.2% MMTS עבור כל ניסוי.
3. הוסף 200 μL של 0.2% MMTS ב 2SHB לכל צינור לריכוז סופי של 0.1% MTS. מודטה עבור 15 דקות ב 42 ° c עם טלטול ב 1500 סל ד ב שייקר תרמית.

3. מירוץ מפוספס: הידרוקסילמין (בשר חזיר) מחשוף ולכידת חלבונים של S-acylated

1. חזור על הקפיצות של 4 x ס"מ כמתואר לעיל כדי להסיר MMTS. הסרת MMTS יכול להיות מוערך על ידי חוסר ריח ברור של MMTS. אחרי כל משקעים, לפזר את הגלולה ב 100 μL של מאגר 2SHB ידי vortexing ב 42 ° צ'/1500 סל ד ב שייקר תרמית עד הגלולה מתמוסס, ולאחר מכן לדלל עם 300 μL של מאגר A.
2. לאחר משקעים סופיים, התמוססות דגימות ב-200 μL של מאגר 2SHB כמתואר לעיל ולדלל עם 240 μL של מאגר A.
3. במקרה של השוואת שינויים ב-S-acylation בתגובה לתנאי טיפול מספר, למדוד ריכוז חלבון שוב ולהמשיך עם כמות שווה של חלבון עבור כל תנאי.
4. שמור על 40 μL מכל אחת מהדוגמאות כבקרת קלט.
5. פיצול דגימות לשני חלקים שווים של 200 μL ו לסמן צינורות כמו "+ HAM" ו "-HAM". הוסף 50 μL של מוכן טרי 2 עם נקניק (pH 7.0-7.5) לריכוז הסופי של 400 מ"מ לאחד הצינורות (+ HAM) ו 50 μL של נייטרלי 2 M הנאל השני (-HAM), אשר ישמש כפקד שלילי. המשך לתוספת חרוזי thiopropyl-ספרד (TS).
   הערה: ניתן לעצור את הניסוי לאחר כל אחד מצעדי המשקעים של ס מ. לאחר הגלולה מושגת, זה יכול להיות מאוחסן ב 500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע. החומציות הנייטרלית של 2 M HAM מבטיחה את הסלקטיביות שלה לקשר של האקאיל-cysteine, ויש להתאימו בקפידה. יש לנקוט טיפול בעת טיפול בדגימות במאגר 2SHB כדי למנוע אובדן של מדגם עקב קצף מוגזם. כל השלבים הבאים הם זהים עבור-HAM ו + HAM דגימות.
6. הוסף 30 μL של TS חרוז-ליטר כל צינור לסובב את הצינורות עבור 1-2 h ב RT.
7. שוטפים את החרוזים 4x עם 1% SDS במאגר A כדי להסיר שיורית HAM.
   1. בעדינות לסובב את כל דגימות חרוז באמצעות microfuge עבור 1 דקות ובזהירות מזהם את supernatant.
   2. השהה מחדש את החרוזים ב-500 μL של 1% SDS במאגר A.
   3. חזור על שלב 3.7.1 – 3.7.2 שלוש פעמים.
      הערה: מופעל thiopropyl-ספרד (TS) מסופק להקפיא מיובש בנוכחות תוספים שיש לשטוף בתוך pH נייטרלי לפני צימוד. מים מזוקקים מומלץ לנפיחות ולכביסה. שוקלים 0.1 גרם של חרוזים ולהשעות מחדש 1 מ ל של מים מזוקקים ולאפשר לו להתנפח תוך כדי סיבוב עבור 30 דקות-1 h ב RT. לשטוף חרוזים 1x עם מאגר A ולהכין משקה עם מאגר A, ביחס של 50% בינונית התיישבו על 50% מאגר. TS נפוחות ניתן לאחסן ב-pH נייטרלי בנוכחות של 20% אתנול ב 4 ° c עד שבוע. אין להשתמש בנתרן עזידה כסוכן בקטאוסטטי, מאחר שאזידה יונים מגיבים עם הקבוצות הדיסולטיות בשתי הפירידיל. ליעילות גבוהה יותר, הכינו חרוזים טריים. בזמן הטיפול החרוזים, קצה של טיפ P200 tte ניתן לגזור מעט כדי למנוע נזק כלשהו.
      הערה: ניתן לעצור את הניסוי בכל שלב לאחר משקעים בעלי ס מ. הגלולה עשויה להיות חנות ב-500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע.

4. הימנעות מגילוי חלבונים של S-acylated

1. לאחר השטיפה האחרונה, בעדינות לסובב את החרוזים כפי שמתואר לעיל ומכה את הסופר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע את החרוזים.
2. לשחזר את החלבונים מחרוזים עם 4 x SDS מאגר לדוגמה עם DTT.
   1. הוסף 50 μL של 4 x SDS מאגר לדוגמה חרוזים ו-הדגירה ב 80 ° צ', 1500 rpm עבור 15 דקות ב שייקר תרמית. . תן לחצוצרות להתקרר
   2. צנטריפוגה את החרוזים ב 5,000 x g עבור 3 דקות כדי לחלוטין הגלולה החרוזים ולהעביר את החלבונים משחרל שפופרת טריים 1.5 mL באמצעות עצה טעינת ג'ל.
3. הפעל SDS-עמוד ולנתח S-אכלציה של החלבון (של) של העניין על ידי בלוק המערבי.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו הראשון acyl-מירוץ כדי לזהות בו S-אכלציה של כמה חלבונים בתאים ורנל, קו תא T הונצח במקור נגזר דם היקפי של חולה לוקמיה של תא T²⁷. החלבונים של תא T הרגולציה שזוהו בעבר כ-S-acylated^9,28,29 נבחרו כדי להדגים את...

Discussion

כאן, אנו מנוצל בהצלחה את הבחינה מירוץ acyl כדי לזהות S-אכלציה של חלבונים שנבחרו בתאי האדם התרבותי הן התאים הראשוניים הנגזרים מרקמת העכבר. שיטה זו היא פשוטה, רגישה, ניתן לבצע בקלות עם דרישות ציוד מינימלי באמצעות טכניקות ביוכימיה סטנדרטית. שיטה זו הוצגה בהצלחה לזהות חלבונים S-acylated הרומן כגון β-su...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R