הגברה איזותרמית בתיווך לולאה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות

Kelly J. Domesle; Shenia R. Young; Qianru Yang; Beilei Ge

doi:10.3791/61239

Summary

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין (iNAAT) אשר משך עניין נרחב בתחום זיהוי הפתוגן. כאן, אנו מציגים פרוטוקולסלמונלה LAMP מרובה מעבדות כשיטה מהירה, אמינה וחזקה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ולאימות סלמונלה חזקה מבידוד תרבותי.

Abstract

הגברה איסותרמית בתיווך לולאה (LAMP) התגלתה כבדיקת הגברה עוצמתית של חומצת גרעין לגילוי מהיר של סוכנים חיידקיים, פטרייתיים, טפיליים ויראליים רבים. סלמונלה היא פתוגן חיידקי של דאגה עולמית לבטיחות מזון, כולל מזון לבעלי חיים. מוצג כאן הוא פרוטוקול רב מעבדה מאומת סלמונלה LAMP שניתן להשתמש בהם כדי לסנן במהירות מזון מן החי לנוכחות של זיהום סלמונלה והוא יכול לשמש גם כדי לאשר סלמונלה המשוער מבודד התאושש מכל קטגוריות המזון. מבחני LAMP מכוונים באופן ספציפי לגן הפלישה לסלמונלה (invA) והוא מהיר, רגיש וספציפי מאוד. DNAs תבנית מוכנים מרקים העשרה של מזון מן החי או תרבויות טהורות של סלמונלה המשוערת מבודדת. תערובת ריאגנט מנורה מוכנה על ידי שילוב של תערובת הורים isothermal, פרייומרים, תבנית DNA, ומים. בדיקת LAMP פועלת בטמפרטורה קבועה של 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. תוצאות חיוביות מנוטרות באמצעות פלואורסצנטיות בזמן אמת וניתן לזהותן כבר 5 דקות. בדיקת LAMP מפגינה עמידות גבוהה כלפי מעכבים במדיום מזון או תרבות מן החי, ומשמשת כשיטה מהירה, אמינה, איתנה, חסכונית וידידותית למשתמש לסינון ולאישור סלמונלה. שיטת LAMP שולבה לאחרונה במדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של מינהל המזון והתרופות האמריקאי (BAM) פרק 5.

Introduction

הגברה איסותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין איסותרמית חדשנית (iNAAT) שהומצא בשנת 2000 על ידי קבוצה של מדענים יפנים¹. באמצעות היווצרות מבנה DNA ספציפי לגזע-לולאת במהלך השלבים הראשונים, LAMP משתמשת פולימראז DNA עקירת גדילים כדי להגביר ביעילות את החומר ההתחלתי הזה מעין אקספוננציאלית, וכתוצאה מכך 10⁹ עותקים של היעד בפחות מ 1 שעות¹. בהשוואה לתגובת שרשרת פולימראז (PCR), NAAT בשימוש נרחב, LAMP יש מספר יתרונות. ראשית, תגובות LAMP מתבצעות בתנאים איסותרמיים. זה מייתר את הצורך במכשיר רכיבה תרמי מתוחכם. שנית, LAMP סובלנית מאוד למדיית תרבות וחומרים ביולוגיים² עם חוסן שהוכח עבור יישומים קליניים ומזון³^,⁴. פעולה זו מפשטת את ההכנה לדוגמה וממזערת תוצאות שליליות כוזבות⁵. שלישית, LAMP נוח לפלטפורמות זיהוי מרובות, כגון מערבולת, צבעים, ביולומינציה, פלואורסצנטיות ומיקרופלואידיקה⁶. רביעית, LAMP הוא מאוד ספציפי כפי שהוא משתמש ארבעה עד שישה פרייומרים שתוכננו במיוחד כדי למקד שישה עד שמונה אזורים ספציפיים¹^,⁷. החמישית, LAMP הוא רגיש במיוחד ומחקרים רבים דיווחו על רגישות מעולה שלה PCR או PCR בזמן אמת⁸. לבסוף, LAMP הוא מהיר יותר עם מבחנים רבים עכשיו לאמץ זמן ריצה סטנדרטי 30 דקות בעוד PCR סוג מבחנים בדרך כלל לקחת 1-2 שעות⁸.

תכונות אטרקטיביות אלה תדלקו את היישום של LAMP באזורים רחבים לגילוי פתוגן, כולל^אבחון במבחנה 9 , אבחון מחלות בעלי^{חיים 10}, ובדיקות מזון וסביבה¹¹. יש לציין, TB-LAMP (מנורה עבור שחפת Mycobacterium) הומלץ על ידי WHO כמבחן חלופי תקף עבור מיקרוסקופיה מריחת כיח עבור אבחונים שחפת ריאות בהגדרות היקפיות¹². יישום LAMP מתרחב גם מעבר לזיהוי מיקרוביאלי כדי לכלול גילוי של אלרגנים, מיני בעלי חיים, עמידות לסמים, אורגניזמים מהונדסים גנטית וחומרי הדברה¹³.

סלמונלה לא הטיפוסית היא פתוגן זואונוטי של בטיחות מזון משמעותית ודאגה לבריאות הציבור ברחבי העולם¹⁴. הוא זוהה גם כמפגע מיקרוביאלי חשוב במזון לבעלי חיים (כלומר, מזון לבעלי^{חיים) 15}^,¹⁶. כדי למנוע מחלות/התפרצויות סלמונלה ממזון אנושי מזוהם ומזון לבעלי חיים, חובה על שיטות מהירות, אמינות וחזקות לבדיקת סלמונלה במגוון מטריצות. בעשור האחרון נעשו מאמצים ניכרים ברחבי העולם בפיתוח ויישום של מבחני סלמונלה LAMP במגוון רחב של מטריצות מזון, כפי שסוכם לאחרונה בסקירה מקיפה⁸. מספר מבחני מנורת סלמונלה, כולל זה המוצג כאן, השלימו בהצלחה אימות רב מעבדה בעקבות הנחיות בינלאומיות מבוססות היטב¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

מבחני מנורת הסלמונלה שלנו מתמקדים במיוחד בגן הפלישה לסלמונלה invA (מספר הצטרפות GenBank M90846)²¹ והוא מהיר, אמין וחזק במספר מטריצות מזון^4,^22,^23,^24,^25,²⁶. השיטה קיבלה תוקף בשש מטריצות מזון מן החי במחקר טרום קולבוריטיבי²⁶ ובמזון לכלבים יבשים במחקר רב מעבדתי^{משותף 19}. כתוצאה מכך, שיטת סלמונלה LAMP המוצגת כאן שולבה לאחרונה במינהל המזון והתרופות האמריקאי (המדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של ה-FDA פרק 5 סלמונלה²⁷ לשרת שתי מטרות, אחת כשיטת סינון מהירה לנוכחות סלמונלה במזון מן החי ושתיים כשיטת אישור אמינה לסלמונלה חזקה מבודדת מכל המזונות.

Protocol

הערה: תערובת תגובת LAMP מכילה פולימראז DNA, חיץ, MgSO₄, dNTPs, פריימרים, תבנית DNA ומים. ארבעת הריאגנטים הראשונים כלולים בתמהיל מאסטר איסותרמי(טבלת חומרים). פריימרים הם premixed בתוך הבית כדי להפוך תערובת פריימר (10x). תבניות DNA ניתן להכין מרקים העשרה של דגימות מזון מן החי לצורך ההקרנה או מתרבויות של סלמונלה המשוערת מבודדת לצורך אישור. בנוסף, שליטה חיובית (DNA המופק מכל זני התייחסות סלמונלה, למשל, סלמונלה enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) ו אין בקרת תבנית (NTC; מים מולקולריים סטריליים) כלולים בכל ריצת LAMP.

1. הכנת תבניות DNA

כדי להכין תבניות דנ"א מהעשרת מזון מן החי, בצע את השלבים הבאים.
1. שוקלים 25 גרם של דגימת מזון מן החי (למשל, מזון לחתולים יבשים, מזון יבש לכלבים, מזון בקר, הזנת סוסים, הזנת עופות ו החזירים) לשקית סינון סטרילית(שולחן החומרים),או שווה ערך. מניחים את התיק לתוך מיכל גדול או ארון תקשורת לתמיכה במהלך הדגירה.
2. הוסף 225 מ"ל של מי פפטון סטריליים (BPW). מערבבים היטב על ידי מערבולת ועיסוי ידיים קצר. תן לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 60 ± 5 דקות.
3. מערבבים היטב על ידי מערבולת ולקבוע pH עם נייר מבחן. התאם את ה- pH, במידת הצורך, ל- 6.8 ± 0.2 עם דגירה סטרילית 1 N NaOH או 1 N HCl. דגירה ב- 35 ± 2 °C (70 °F) עבור 24 ± 2 שעות.
4. מערבבים היטב על ידי מערבולת את השקית המכילה מרקים העשרת מזון מן החי. מעבירים 1 מ"ל מהצד המסונן של התיק לצינור מיקרוצנטריפוגה. וורטקס לזמן קצר.
5. לחלץ DNA באמצעות מגיב הכנה מדגם (טבלה של חומרים) כדלקמן.
  1. צנטריפוגה ב 900 x g במשך 1 דקות כדי להסיר חלקיקים גדולים ולהעביר supernatant לצינור microcentrifuge חדש.
  2. צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 2 דקות ולהשליך supernatant.
  3. להשעות את גלולה ב 100 μL של ריאגנט הכנת מדגם וחום ב 100 ± 1 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בגוש חום יבש.
  4. מצננים לטמפרטורת החדר ומאחסנים תמציות דנ"א לדוגמה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
כדי להכין תבניות DNA מתרבויות סלמונלה המשוערות, בצע את השלבים הבאים.
1. קבל סלמונלה המשוערת מבודדת מבידוד תרבות בכל המזונות בעקבות BAM פרק 5 סלמונלה של ה-FDA סעיף D: בידוד סלמונלה²⁷.
2. סלמונלה מחסן בהנחה מבודד על צלחת אגר לא בחירה (למשל, אגר דם, אגר מיזים, ואגר סויה trypticase) ו הדגירה ב 35 ± 2 °C (60 °F) עבור 24 ± 2 שעות.
3. העבר מספר מושבות בודדות ל 5 מ"ל של מרק סויה טריפטיקס (TSB) או עירוי לב המוח (BHI) מרק דגירה ב 35 ± 2 מעלות צלזיוס עבור 16 ± 2 שעות.
  הערה: שלב זה יכול להיות אופציונלי אם תרבות הסלמונלה המשוערת טהורה. במקרה זה, תבניות DNA ניתן להכין על ידי השעיית מספר מושבות בודדות ב 5 מ"ל של TSB וחום 500 μL של ההשעיה ב 100 ± 1 °C (70 °F) במשך 10 דקות בגוש חום יבש. המשך עם שלב 5 להלן.
4. העבר 500 μL של תרבות הלילה לצינור microcentrifuge וחום ב 100 ± 1 °C (60 °F) במשך 10 דקות בגוש חום יבש.
5. מצננים לטמפרטורת החדר ומאחסנים תמציות דנ"א מבודדות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
כדי להכין DNA שליטה חיובית, בצע צעדים דומים כמו לעיל להכנת תבניות DNA מתרבויות סלמונלה המשוערות עם צעד אחד נוסף דילול.
1. לחסן S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) או כל זני התייחסות סלמונלה על צלחת אגר לא אלקטיבית (למשל, אגר דם, אגר מים מזינים, ו טריפטיקס סויה אגר) ואת הדגירה ב 35 ± 2 מעלות צלזיוס עבור 24 ± 2 שעות.
2. העבר מספר מושבות בודדות ל 5 מ"ל של מרק TSB או BHI ודגרה ב 35 ± 2 מעלות צלזיוס עבור 16 ± 2 שעות כדי להגיע ~ 10⁹ CFU / mL.
3. לדלל באופן סדרתי את תרבות הלילה ב 0.1% מי פפטון כדי להשיג ~ 10⁷ CFU / mL.
4. העבר 500 μL של דילול זה לצינור microcentrifuge וחום ב 100 ± 1 °C (60 °F) במשך 10 דקות בגוש חום יבש.
5. מצננים לטמפרטורת החדר ומאחסנים דנ"א לבקרה חיובית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

2. הכנת תערובת פריימר (10x)

השג פריימרים של LAMP מסונתזים מסחרית (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF ו- Sal4-LB) עם טיהור התפלה סטנדרטי (טבלה 1).

שם פריימר	תיאור	רצף (5'-3')	אורך (bp)
סאל4-F3	פריימר קדמי	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
סאל4-B3	פריימר חיצוני לאחור	CGGCAATAGCGTCCTT	18
סאל4-FIP	פריימר פנימי קדימה	GCGCGGקטקטקאטקהאטה-טיקטגטאגטאגגג'קג	38
סאל4-BIP	פריימר פנימי לאחור	GCגאגגגאגג'יגהקטקטג-TCGCACCTCAAAGGAAC	38
סאל4-LF	לולאה קדימה פריימר	טקאאאטגקטקטקטקה-TCTG	25
סאל4-ליברות	לולאה לאחור פריימר	אאגאגקטקטהג'י (1999)	21

טבלה 1: פרייימריז LAMP להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות. הפריימריז מתוכננים על בסיס רצף סלמונלה invA (מספר הצטרפות GenBank M90846).

הכן פתרונות מלאי של כל פריימר (100 מיקרומטר) על ידי rehydrating פריימר עם כמות מתאימה של מים מולקולריים סטריליים כיתה. מערבבים היטב על ידי מערבולת עבור 10 s ולאחסן ב -20 °C (-80 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך).
הכן את תערובת פריימר (10x) לפי גליון עבודה (טבלה 2). הוסף כמויות מתאימות של פתרונות מלאי פריימר ומים בדרגה מולקולרית סטרילית לצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבבים היטב את כל ריאגנטים על ידי מערבולת במשך 10 s.

רכיב	מניה קונצרן (μM)	קונס תערובת פריימר (μM)	אמצעי אחסון (μL)
פריימר Sal4-F3	100	1	10
פריימר Sal4-B3	100	1	10
פריימר Sal4-FIP	100	18	180
פריימר Sal4-BIP	100	18	180
פריימר סאל4-LF	100	10	100
פריימר סאל4-LB	100	10	100
מים ברמה מולקולרית	מספר N/A	מספר N/A	420
הכולל	מספר N/A	מספר N/A	1000

טבלה 2: גליון עבודה להכנת תערובת פריימר LAMP (10x). הפריימריז מופיעים בטבלה מס' 1.

Aliquot 10x פריימר לערבב ל 500 μL לכל צינור microcentrifuge ולאחסן ב -20 °C (60 °F).

3. הרכבה של תגובת LAMP

הערה: כדי למנוע זיהום צולב, מומלץ מאוד להפריד פיזית את האזורים המשמשים להכנת תערובת הורים LAMP והוספת תבניות DNA. איור 1 הוא דיאגרמת LAMP.

figure-protocol-7381
איור 1: דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה של מנורת סלמונלה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הכנה והפעלה של תוכנית ההתקנה
1. ספסל נקי עם isopropanol ופתרון DNA- ו- DNase משפיל(שולחן החומרים). פיפטות נקיות ומחזיקי רצועת צינור (שולחן החומרים) עם הפתרון המשפיל DNA ו- DNase.
2. להפשיר את תערובת הורים isothermal, תערובת פריימר (10x), מים ברמה מולקולרית, DNA שליטה חיובית, ותבניות DNA בטמפרטורת החדר.
3. הפעל את מכשיר LAMP(טבלת החומרים)והקש על מסך הפתיחה כדי לגשת למסך הבית. בצע שלבים אלה כדי ליצור הפעלה.
  הערה: דגם אחד של מכשיר LAMP יש 2 בלוקים (A ו- B) עם 8 דגימות בכל בלוק ודגם אחר יש בלוק אחד המכיל 8 דגימות(שולחן החומרים).
  1. הקש על LAMP+Anneal ובחר ערוך כדי להזין מידע לדוגמה.
    הערה: פרופיל ההפעלה של LAMP המוגדר כברירת מחדל מורכב מהגברה ב-65 °C (65 °F) למשך 30 דקות ושלב anneal מ- 98 °C (70 °F) עד 80 °C (70 °F) עם 0°C decrement לשניה.
  2. הקש על כל שורה לדוגמה כדי להפעיל את הסמן והזן מידע לדוגמה רלוונטי, תוך שימוש בסמל בלוק AB כדי לעבור בין שני בלוקי כלי LAMP.
  3. הקש על סמל בדוק כאשר כל המידע לדוגמה הוזן.
    הערה: באופן אופציונלי, הגדרת ההפעלה (נקראת "פרופיל", המכילה מידע לדוגמה יחד עם פרופיל ההפעלה של LAMP המוגדר כברירת מחדל) עשויה להישמר לשימוש מאוחר יותר. הקש על סמל שמור והעניק לפרופיל שם ייחודי. בעת בדיקת אותה קבוצת דוגמאות בפעם הבאה, ניתן לאתחל הפעלה חדשה באמצעות הפרופיל שנשמר. הקש על סמל תיקיה בפינה הימנית התחתונה של מסך הבית ובחר פרופיל כדי לטעון פרופילים שמורים.
הרכבת תגובת LAMP
הערה: בעת שימוש בשני בלוקי מכשיר LAMP (A ו- B, סך של 16 דגימות), להכין את תערובת הורים LAMP עבור 18 דגימות. אם אתה משתמש בבלוק מכשיר LAMP אחד בלבד (8 דגימות בסך הכל), הכן את תערובת תבנית הבסיס של LAMP עבור 10 דגימות. עבור מספרים לדוגמה אחרים, התאם את עוצמת הקול בהתאם כדי להתאים לאובדן pipetting. כלול תמיד פקד חיובי ו- NTC בכל הפעלת LAMP. מומלץ לבצע בדיקה כפולה של כל דגימה בהפעלות LAMP עצמאיות.
1. הכן את שילוב תבנית הבסיס של LAMP בהתאם לגליון עבודה (טבלה 3). הוסף כמויות מתאימות של תערובת הורים isothermal, תערובת פריימר, ומים בדרגה מולקולרית לתוך צינור microcentrifuge ומערבולת בעדינות במשך 3 s. צנטריפוגה בקצרה.
2. מניחים את רצועת הצינור במחזיק הרצועה ומפיצים 23 μL של תערובת הורים LAMP לכל באר.
3. וורטקס כל תבניות ה-DNA וצנטריפוגה בקצרה. הוסף 2 μL של תבנית DNA לבאר המתאימה מכסה בחוזקה.
4. הסר את רצועת הצינור מהמחזיק והזז את פרק כף היד כדי להבטיח שכל ריאגנטים יתאחדו בתחתית הצינור.
5. טען את רצועת הצינור לתוך בלוקים מכשיר LAMP,להבטיח כובעים מאובטחים לפני סגירת המכסה.

רכיב	לווינק עובד.	תגובה סופית.	נפח לדגימה (μL)	נפח עבור 18 דגימות (μL)	נפח עבור 10 דגימות (μL)
ערבוב ראשי איסותרמי ISO-001	1.67x	פי 1	15	270	150
תערובת פריימר	10x	פי 1	2.5	45	25
מים ברמה מולקולרית	מספר N/A	מספר N/A	5.5	99	55
סכום ביניים של ערבוב ראשי	מספר N/A	מספר N/A	23	414	230
תבנית DNA	מספר N/A	מספר N/A	2	מספר N/A	מספר N/A

טבלה 3: גליון עבודה להכנת תערובת תגובת LAMP. תמהיל פריימר (10x) מוכן על פי טבלה 2 באמצעות פתרונות מלאי של פריימרים הרשומים בטבלה 1.

4. מנורה לרוץ

הערה: במהלך הפעלת LAMP, קריאות פלואורסצנטיות נרכשות באמצעות ערוץ FAM. ערכי הזמן-לשיא (T_max; min) נקבעים באופן אוטומטי על-ידי הכלי עבור נקודת הזמן כאשר יחס הפלואורסצנטיות מגיע לערך המרבי של עקומת קצב ההגברה. T_m (°C) הוא טמפרטורת ההיתוך/חישול של המוצר המוגבר הסופי.

לחץ על סמל הפעלה בפינה השמאלית העליונה של המסך ובחר את הבלוקים המכילים רצועות צינור כדי להתחיל את ריצת LAMP.
לחלופין, בזמן שהתגובה מתבצעת, הקש על הכרטיסיות טמפרטורה, הגברה ואנאל כדי לראות שינויים דינמיים של פרמטרים שונים במהלך הפעלת LAMP.
לאחר השלמת הריצה, הקש על הכרטיסיות הגברה ואנל כדי לראות הגברה מלאה ועקומות anneal והקש על הכרטיסיה תוצאות כדי להציג את התוצאות.
באופן אופציונלי, לשמירת רשומות, רשום את מספר ההפעלה הממוקם בפינה הימנית העליונה של המסך, תוך שימוש בתבנית של "מספר number_run טורי של כלי נגינה", לדוגמה, "GEN2-2209_0030".

5. פרשנות של תוצאות LAMP

הערה: ניתן להציג את תוצאות LAMP בלוח המכשירים של LAMP ישירות ו/או באמצעות תוכנת LAMP(טבלת חומרים).

כדי לפרש תוצאות LAMP בלוח המכשירים, בצע את השלבים הבאים.
1. הקש על סמל תיקיה בפינה הימנית התחתונה של מסך הבית ובחר יומן כדי לנווט למיקום הקובץ כדי לטעון את הפעלת LAMP של עניין.
  הערה: ריצות LAMP מאורגנות לפי תאריך, החל מהשנה.
2. שים לב לחמש הכרטיסיות המשויכות לכל הפעלה: פרופיל, טמפרטורה, הגברה, אנאלי, ותוצאות.
  הערה: הכרטיסיות פרופיל וטמפרטורה מציגות טמפרטורות מתוכנתות וטמפרטורות בפועל, בהתאמה, בבארות המדגם כאשר תגובת LAMP מתקדמת. הכרטיסיות הגברה ואנאל מציגות קריאות פלואורסצנטיות ושינויים בפלואורסצנטיות במהלך שלבי ההגברה והאנאל, בהתאמה. הכרטיסיה תוצאות מציגה תצוגה טבלאית של תוצאות LAMP.
3. הקש על הכרטיסיה תוצאות כדי להתבונן בתוצאות LAMP עבור כל באר.
  הערה: יש שלושה טורים (טוב, הגברה, ואנאל). העמודה "הגברה" מציגה את ערכי הזמן-לשיא (T_max; min:sec) עבור כל מדגם ("ובכן") והעמודה "Anneal" מציגה את טמפרטורות ההיתוך/חישול (T_m; °C) עבור כל מוצר מוגבר בבאר זו.
4. לפרש את תוצאות LAMP ולדווח על תוצאות מנורה סופית כדלקמן.
  1. בדוק את בארות הבקרה תחילה. באר NTC צריך להיות T_max ריק בעוד T_m יכול להיות גם ריק (שני דגמי מכשיר LAMP) או < 83 °C (רק עבור דגם המכשיר LAMP עם שני בלוקים). באר השליטה החיובית צריכה להיות T_{מקסימום} בין 5 ל 10 דקות ו T_m סביב 90 מעלות צלזיוס.
  2. בדוק את בארות המדגם. כל הדגימות עם T_m הנכון (כ 90 מעלות צלזיוס) ו T_{מקסימום} (בין 5-30 דקות) נחשבים חיוביים עבור סלמונלה.
  3. דווח על תוצאות LAMP סופיות בהתבסס על תוצאות של ריצות כפולות. אם להפעלות הכפולות יש תוצאות עקביות, ניתן לדווח על תוצאות LAMP סופיות. אם הפעלות כפולות אינן עקביות, חזור על שתי הריצות באופן עצמאי. אם התוצאות עדיין לא עקביות, המדגם צריך להיחשב חיובי חזק עבור סלמונלה ויהיה צורך לעבור אישור תרבות.
כדי לפרש את תוצאות LAMP באמצעות התוכנה, בצע את הפעולות הבאות.
1. לחץ על סמל המחשב בלוח השמאלי ולנווט למיקום הקובץ כדי לטעון את ריצת LAMP של עניין.
  הערה: המחשב שבו מותקנת התוכנה אינו צריך להיות מחובר למכשיר LAMP כדי לנתח את תוצאות LAMP, כלומר, גישה מרחוק זמינה. ריצות LAMP מאורגנות לפי תאריך.
2. שים לב לשבע הכרטיסיות המשויכות לכל ריצה: פרופיל, טמפרטורה, הגברה, קצב הגברה, Anneal, נגזרת Anneal, ותוצאה.
  הערה: בדומה לתצוגת לוח המכשירים, הכרטיסיות פרופיל וטמפרטורה מציגות טמפרטורות מתוכנתות וטמפרטורות בפועל, בהתאמה, בבארות המדגם עם המשך תגובת LAMP. הכרטיסיות הגברה/הגברה ו- Anneal/Anneal Derivative מציגות קריאות פלואורסצנטיות או שינויים בפלואורסצנטיות במהלך שלבי ההגברה וה anneal, בהתאמה. הכרטיסיה 'תוצאות' מציגה תצוגה טבלאית של תוצאות LAMP השונות במקצת מתצוגת לוח המכשירים.
3. הקש על הכרטיסיה קצב הגברה כדי להציג תצוגה גרפית של יחסי הפלואורסצנטיות לפי זמן. לחץ על סמל ההגדרה בחלק השמאלי העליון של המסך והתאם את "יחס סף זיהוי שיא" מ- 0.020 עד 0.010.
  הערה: ההתאמה נחוצה כדי להבטיח שכל הפסגות החוקיות יזוהו, והתוצאות המתקבלות באמצעות התוכנה תואמות לאלה המוצגות בלוח המכשירים.
4. הקש על הכרטיסיה תוצאה כדי לראות את תוצאות LAMP עבור כל באר.
  הערה: קיימות ארבע עמודות (שם גרף, מספר באר, שם טוב וערך שיא). החלק העליון של העמודה "ערך שיא" מציג "זמן מגבר"(T_max; min:sec) עבור כל מדגם ("שם טוב") בעוד החלק התחתון מציג "נגזרת Anneal" (T_m; °C) עבור כל מוצר מוגבר בבאר זו.
5. לפרש את תוצאות LAMP ולדווח על תוצאות LAMP הסופיות בעקבות צעדים דומים כמו בעת שימוש בלוח המכשיר עם חריג אחד כי NTC גם ודגימות שליליות אחרות צריך T_m ריק כמו הגדרות התוכנה LAMP לחסל אלה T_m < 83 °C תוצאות. באופן דומה, כל הדגימות עם T_m הנכון (כ 90 מעלות צלזיוס) ו T_max (בין 5-30 דקות) נחשבים חיוביים עבור סלמונלה.

תוצאות

איור 2 ואיור 3 מציגים גרפים/טבלאות LAMP מייצגים המוצגים בשתי הפלטפורמות. בהפעלת LAMP זו, דגימות S1 עד S6 הן דילול סדרתי פי 10 של S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 החל מ- 1.1 x 10⁶ CFU עד 11 CFU לכל תגובה. שליטה חיובית היא S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) ב 1.7 x 10 4 CFU לכל^תגובה NTC הוא מים כיתה מולקולרית.

כפי שמוצג באיור 2E ובאיור 3G, הן בארות NTC והן בארות מחשב הן פקדים חוקיים. באר NTC יש T_max ריק בעוד T_m הוא < 83 °C (70 °F) על לוח מכשיר LAMP וריק בתוכנת LAMP, מה שמרמז על תוצאה שלילית. המחשב גם יש T_{מקסימום} של 7 דקות 45 שניות ו T_m של ~ 90 °C (60 °F) על שתי הפלטפורמות, מה שמרמז על תוצאה חיובית. דגימות S1 כדי S6 יש T_{מקסימום} בין 6 דקות 30 שניות ו 12 דקות 15 שניות, כל להיות סלמונלה-חיובי.

לאחר ריצות כפולות של אותה קבוצת דגימות, תוצאות LAMP הסופיות מדווחות עבור דגימות אלה. ריצת LAMP מייצגת זו מראה כי LAMP מזהה בהצלחה סלמונלה עם מגוון רחב של ריכוזים בדגימות.

figure-results-1314
איור 2: תוצאות LAMP מייצגות המוצגות בלוח המכשירים של LAMP. (A)הכרטיסיה פרופיל מציגה את פרופיל הטמפרטורה מתוכנת. (B) הכרטיסיה טמפרטורה מציגה טמפרטורות בפועל בבארות המדגם כאשר תגובת LAMP ממשיכה. (C)הכרטיסייה הגברה מציגה קריאות פלואורסצנטיות במהלך הגברה של LAMP. (ד)הכרטיסייה Anneal מציגה שינויים בפלואורסצנטיות (נגזרת) במהלך שלב האנאל. (ה)הכרטיסיה תוצאות מציגה תצוגה טבלאית של תוצאות LAMP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2178
איור 3: תוצאות LAMP מייצגות המוצגות בתוכנת LAMP. (A)הכרטיסיה פרופיל מציגה את פרופיל הטמפרטורה מתוכנת. (B) הכרטיסיה טמפרטורה מציגה טמפרטורות בפועל בבארות המדגם כאשר תגובת LAMP ממשיכה. (C)הכרטיסייה הגברה מציגה קריאות פלואורסצנטיות במהלך הגברה של LAMP. (D)הכרטיסיה קצב הגברה מציגה שינויים בפלואורסצנטיות (יחס פלואורסצנטיות) במהלך הגברה של LAMP. (E)הכרטיסייה Anneal מציגה קריאות פלואורסצנטיות בשלב האנאל. (ו)הכרטיסייה נגזרת Anneal מציגה שינויים בפלואורסצנטיות (נגזרת) במהלך שלב anneal. (G) הכרטיסיה 'תוצאה' מציגה תצוגה טבלאית של תוצאות LAMP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הצגנו כאן שיטת LAMP פשוטה, מהירה, ספציפית ורגישה להקרנה ואישור סלמונלה במזון מן החי ובתרבות הטהורה, בהתאמה. עם הנוחות של תערובת מאסטר איזותרמית המכילה ארבעה מגיבים מרכזיים, ותמהיל פריימר מוכן לשימוש, שהוכן בתוך הבית, הרכבת תגובת LAMP דורשת רק כמה שלבי צנרת (איור 1). זמן הריצה הכולל, כולל שלבי הגברה ואנאל, הוא פחות מ-38 דקות(איור 2A, B ואיור 3אמפר,B). תוצאות חיוביות מנוטרות באמצעות פלואורסצנטיות בזמן אמת (איור 2C ואיור 3C,D)וניתן לזהות אותן כבר ב-5 דקות^{ו-26 דקות}. שלב האנאל משמש כאישור נוסף לספציפיות LAMP מכיוון שרק דגימות עם T_m נכון (בסביבות 90 °C (בסביבות 90 °C)) מדווחות כחיוביות(איור 2D,E ואיור 3E-G). רגישויות של 1 תא סלמונלה בתרבות טהורה < 1 CFU/25 גרם במזון לבעלי חיים דווחו בעבר²⁶.

כמו LAMP הוא יעיל למדי ומייצר כמות גדולה של DNA¹, זה קריטי כי שיטות העבודה הטובות ביותר במעבדה משמשים למניעת זיהום צולב, אשר עשויים לכלול פיזית הפרדה בין האזורים להכנת תערובת הורים LAMP והוספת תבניות DNA, הימנעות יצירת אירוסולים, באמצעות טיפים פיפט מסנן, החלפת כפפות לעתים קרובות, והימנעות מפתיחת צינורות תגובה LAMP לאחר הגברה.

הספציפיות של שיטת סלמונלה LAMP זו נבדקה בעבר באמצעות 300 זנים חיידקיים (247 סלמונלה של 185 סרוברים ו 53 שאינםסלמונלה) והוכח להיות 100% ספציפי²⁶. יש לציין כי הבדלים משמעותיים ב- T_max נצפו בין שני מיני הסלמונלה, S. enterica וסלמונלה בונגורי, ובין תת המין S. enterica, במיוחד subsp. arizonae (IIIa)²⁶. עם זאת, אלה היו עדיין תוצאות חיוביות תקפות לפי הכללים לפרש תוצאות LAMP. במחקר הרב-מעבדתי שלנו במזון לכלבים יבשים שכלל 14 אנליסטים¹⁹, נצפו מדי פעם דגימות עם תוצאות לא עקביות בריצות LAMP כפולות. אלה בדרך כלל מעורבים דגימות עם תוצאות חיוביות מעוכבות (T_max > 15 דקות). חזרה על שתי ההפעלות באופן עצמאי פתרה בדרך כלל את הבעיה. לעתים רחוקות יותר, ראינו דגימות עם ערכי T_m נכונים אך לא או לא סדירים T_max (< 5 דקות). זה נגרם בדרך כלל על ידי בועות אוויר בצינור התגובה.

לאורך מחזור החיים של פיתוח שיטת LAMP, הערכה, מחקר precollaborative, אימות רב מעבדה, ראינו סובלנות גבוהה של LAMP למעכבים במזון מן החי שונים או מטריצות מזון ומדיה תרבות⁴^,¹⁹^,²²^,²³^,²⁴, הדגשת החוסן של השיטה ושיתוף מחקרים רבים אחרים בקנה מידה עולמי⁸. זה עדיף בהשוואה PCR או PCR בזמן אמת, אשר בדרך כלל דורש בקרת הגברה פנימית כדי להבטיח כי תוצאות שליליות אינן בשל עיכוב מטריקס²⁸. יתר על כן, LAMP הפגינה ספציפיות ורגישות דומות (או מעולות) בהשוואה ל- PCR או PCR בזמן אמת ברוב המכריע של מחקרים⁸. העלות של ריאגנטים LAMP הוא על $1 לכל תגובה. מכשירי LAMP המשמשים בפרוטוקול זה הם קטנים, בעלי תחזוקה נמוכה וניידים. הם יכולים להתמודד עם כל שיטת הגברה isothermal המעסיקה זיהוי היעד על ידי מדידת פלואורסצנטיות, LAMP כלול. באמצעות תוכנת LAMP, ניתן ליצור דוחות מקיפים בפורמט מרובה (pdf, טקסט ותמונה).

אימות פעולת שירות הוא שלב קריטי לפני שניתן יהיה לאמץ שיטה חדשה לשימוש שגרתי. ראוי לציין כי פרוטוקול LAMP שדווח כאן השלים בהצלחה אימות מרובה מעבדות¹⁹. עם השילוב האחרון של פרוטוקול LAMP זה לתוך ארה"ב. ה-FDA של BAM פרק 5 סלמונלה²⁷, צפוי כי השיטה תרוויח שימוש רחב הרבה יותר, הן כשיטת סינון מהירה במזון מן החי והן כשיטת אישור אמינה לסלמונלה המשוערת מבודדת מכל קטגוריות המזון.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. הדעות המובעות בכתב יד זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את המדיניות הרשמית של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, מינהל המזון והתרופות האמריקאי או ממשלת ארה"ב. התייחסות לחומרים מסחריים, ציוד או תהליך כלשהו אינה מהווה בשום אופן אישור, אישור או המלצה של מינהל המזון והתרופות האמריקאי.

Acknowledgements

המחברים מודים לחברי ועדת המשנה לאימות שיטות מיקרוביולוגיה (MMVS) ומועצת המדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של ה-FDA על סקירה ביקורתית של מחקרי אימות שיטת סלמונלה LAMP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion (BHI) broth	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	299070	Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Buffered peptone water (BPW)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218105	Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.
DNA AWAY	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	7010	Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.
Genie Explorer software	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	Version 2.0.6.3	Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.
Genie II or Genie III (LAMP instrument)	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	GEN2-02 or GEN3-02	A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.
Genie strip	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	OP-0008	8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl.
Genie strip holder	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	GBLOCK	Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SA48-500	Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Heat block	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	88-860-022	Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction.
Incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	3960	Standard laboratory incubator.
ISO-001 isothermal master mix	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	ISO-001	An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	A416	Disinfects work surfaces.
LAMP primers	Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA	Custom	LAMP primers with detailed information in Table 1.
Microcentrifuge	Eppendorf North America, Hauppauge, NY	22620207	MiniSpin plus personal microcentrifuge.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	05-408-129	Standard microcentrifuge tubes.
Molecular grade water	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AM9938	Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SS266-1	Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R01202	Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Peptone water	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218071	Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.
Pipettes and tips	Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA	Pipet Lite LTS series	Standard laboratory pipettes and tips.
PrepMan Ultra sample preparation reagent	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4318930	A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.
Salmonella reference strain LT2	ATCC, Manassas, VA	700720	Salmonella reference strain used as positive control.
Trypticase soy broth (TSB)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	211768	Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Vortex mixer	Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY	SI-0236	Standard laboratory vortex mixer.
Whirl-pak filter bag	Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI	B01318	Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.

References

Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).
Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110(2016).
WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).
D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).
Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: