בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

Summary

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

Abstract

אנו מתארים את ההליך שלב אחר שלב לפולחן והבחנה של תאי גזע עובריים של עכברים לשושלות עצביות, ואחריו סדרה של גישות לאפיון התאים המובחנים. תאי הגזע העובריים של עכבר E14 שימשו ליצירת גופים עובריים באמצעות שיטת טיפת התלוי, ולאחר מכן הושרו כדי להבדיל לתאי אב עצביים על ידי חומצה רטינואית, ולבסוף נבדלו לנוירונים. תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי (RT-qPCR) וניסויים אימונופלואורסצנטיים גילו כי האבות העצביים והנוירונים מציגים סמנים מתאימים (קטין לאבות עצביים ו neurofilament עבור נוירונים) ביום 8 ו -12 לאחר בידול, בהתאמה. ניסויי ציטומטריית זרימה על קו E14 המבטאים כתב GFP מונחה מקדם Sox1 הראו כי כ -60% מהתאים ביום 8 הם חיוביים GFP, המציין את ההבחנה המוצלחת של תאי אב עצביים בשלב זה. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח RNA-seq כדי לפרופיל השינויים התמלוליים הכלליים. שיטות אלה שימושיות לניתוח מעורבותם של גנים ומסלולים ספציפיים בוויסות המעבר לזהות התא במהלך בידול עצבי.

Introduction

מאז ההפקה הראשונה שלהם מן מסת התא הפנימי של blastocysts העכבר המתפתח^1,2, תאי גזע עובריים עכבר (mESC) שימשו ככלים רבי עוצמה כדי ללמוד התחדשות עצמית של תאי גזע ובידול³. יתר על כן, לימוד בידול mESC מוביל להבנה עצומה של מנגנונים מולקולריים שעשויים לשפר את היעילות והבטיחות בטיפול מבוסס תאי גזע בטיפול במחלות כגון הפרעות ניווניות⁴. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, מערכת במבחנה זו מספקת יתרונות רבים, כולל פשטות בפועל והערכה, עלות נמוכה בשמירה על קווי תאים בניגוד לבעלי חיים, וקלות יחסית במניפולציות גנטיות. עם זאת, היעילות והאיכות של סוגי תאים מובחנים מושפעים לעתים קרובות מקווים שונים של mESCs, כמו גם משיטות הבידול^5,6. כמו כן, הבדיקות המסורתיות להערכת יעילות הבידול מסתמכות על בדיקה איכותית של גנים נבחרים של סמן חסרי חוסן ולכן הם אינם מצליחים לתפוס שינויים גלובליים בביטוי הגנים.

כאן אנו שואפים להשתמש בסוללה של התקפות להערכה שיטתית של ההבחנה העצבית. באמצעות ניתוחי הפריה במבחנה מסורתיים על סמנים נבחרים ו- RNA-seq, אנו מקימים פלטפורמה למדידת יעילות הבידול, כמו גם את השינויים התמלוליים במהלך תהליך זה. בהתבסס על פרוטוקול שהוקם בעבר⁷, יצרנו גופים עובריים (EBs) באמצעות טכניקת טיפה תלויה, ואחריו אינדוקציה באמצעות כמות על-פיזיולוגית של חומצה רטינואית (RA) כדי ליצור תאי אב עצביים (NPCs), אשר לאחר מכן הובדלו נוירונים עם מדיום אינדוקציה עצבית. כדי לבחון את היעילות של הבידול, בנוסף לבדיקות RT-qPCR ואימונופלואורסצנטיות (IF) מסורתיות, ביצענו רנ"א-סק וציטומטריית זרימה. ניתוחים אלה מספקים מדידה מקיפה של התקדמות הבידול הספציפי לשלב.

Protocol

1. תרבות mESC

1. יש לצפות צלחת 10 ס"מ שטופלו בתרבית הרקמות עם 0.1% ג'לטין ולאפשר לג'לטין להתקבע לפחות 15-30 דקות לפני שהוא שואף החוצה.
2. זרע γ עכבר עוברי (MEFs) יום אחד לפני פולחן mESCs במדיום mESC מחומם מראש (המדיום הנשר (DMEM) של Dulbecco עם 15% סרום בקר עוברי (FBS), חומצות אמינו לא חיוניות, β-mercaptoethanol, L-גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, נתרן פירובט, LIF, PD0325901 (PD) ו Chir99021 (CH)).
3. אפשרו ל-MEFs המוקרנים γ להתיישב ולהצמיד למשטח הלוח לפני שאתם פולחים תאי E14.
4. להפשיר E14 ESCs באמבט מים 37 °C ולהעביר במהירות את התאים בצינור חרוט 15 ס"מ עם בינוני mESC חם. גלולה את התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
5. resuspend התאים ב 10 מ"ל של בינוני mESC צלחת התאים על צלחת התרבות המכילה את MEFs המוקרן γ זרע קודם לכן. לדגור על תרבית התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO₂.
6. עבור תרבות passaging, לשאוף e המדיום לשטוף את הצלחת עם PBS סטרילי 1x. מוסיפים מספיק 0.05% טריפסין כדי לכסות את משטח הצלחת ודגור ב 37 °C (3 דקות).
7. לנטרל את טריפסין עם בינוני mESC ו pipette כדי ליצור השעיה של תא יחיד. צנטריפוגות התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
8. לספור את התאים עם hemocytometer או מונה התא ולזרוע על 5.0 x 10⁵ תאים בצלחת תרבית 10 ס"מ.
9. Resuspend התאים ב 10 מ"ל של בינוני mESC, צלחת התאים על צלחת תרבית רקמות מצופה ג'לטין ותרביות דגירה כפי שתואר קודם לכן.
   הערה: מומלץ להעביר mESCs כל יומיים כדי למנוע מהתאים להבדיל במושבות שלהם. פנול אדום בפונקציות בינוניות אך ורק כמו מחוון pH ובהתאם לצפיפות התא, זה יכול להפוך צהבהב (חומצי יותר), מוקדם יותר מ 2 ימים. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המדיום כל יום. ה-MEFs המוקרנים γ בסופו של דבר ימותו אחרי כמה קטעים.

2. EB, NPC, ובידול נוירונים

1. בצע פרוטוקול העברת תרבית שהוזכר קודם לכן וספור את התאים (שלבים 1.7-1.10).
2. שיטת טיפה תלויה (יום 0)
   1. עבור צלחת תרבית תאים 10 ס"מ, לספור בערך 2.5 x 10⁴ תאים שבהם 5.0 x 10² תאים יושעו 20 μL הבחנה בינונית (DMEM עם 15% FBS, חומצות אמינו לא חיוניות, β-mercaptoethanol, L-גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, ונתרן pyruvate). בערך חמישים 20 טיפות μL המכילות את התאים ניתן צלחת אחת 10 ס"מ.
   2. Aliquot המספר המתאים של תאים, ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
   3. resuspend התאים בנפח המתאים של מדיום בידול עבור צפיפות תא של 5.0 x 10² תאים לכל 20 μL (למשל, 2.5 x 10⁴ תאים ב 1 מ"ל של בינוני בידול).
   4. באמצעות מיקרופיפט או פיפטה מהדרת, מניחים 20 טיפות μL של השעיית התא על המכסה של צלחת תרבית הרקמות. ודא כי טיפות אינן קרובות מדי זה לזה כדי למנוע מהם להתמזג.
      הערה: הטיפות יכולות להיות מצופות על צלחת קובץ מצורף שטופלו בתרבית הרקמות או צלחת השעיה מכיוון שהן יונחו על המכסה ולא על הצלחת עצמה. לקבלת גישה ריאלית וסטרילית יותר, צלחת את הטיפות על צלחת תרבית רקמות מצורף ולהעביר אותם לצלחת השעיה כמתואר להלן.
   5. ממלאים את הצלחת ב-5-10 מ"ל של 1x PBS ומחזירים בזהירות את המכסה לצלחת. לדגור על התרבות באינקובטור 37 °C (37 °F).
      הערה: PBS מתווסף לצלחת התרבות כדי למנוע את הטיפות להתייבש.
3. ביום 2, להשתמש micropipette כדי לאסוף את הטיפות מהמכסה ומניחים אותם בצלחת השעיה תרבית תא 10 ס"מ מלא 10 מ"ל של מדיום בידול. לדגור את התרבות על שייקר מסלולי רועד במהירות נמוכה באינקובטור.
4. ביום 4, כדי לקצור את EBs, לאסוף את התאים, צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant.
   הערה: EBs ניתן גם לשטוף עם 1x PBS בהתאם לדרישות של ניסויים הבאים.
5. כדי להמשיך את ההליך ולעורר את בידול EB לתאי אב עצביים (NPCs), להכין את מדיום הבידול עם 5 מיקרומטר חומצה רטינואית (RA).
6. הסר את המדיום הישן על ידי גלולה EBs ב 100 x g במשך 3 דקות או לאפשר EBs להתיישב לפני שאיפה את המדיום הישן. הוסף 10 מ"ל של מדיום הבידול המכיל 5 μM RA ללוח התרבות.
7. ביום 6, להחליף לפחות מחצית המדיום עם מדיום טרי המכיל 5 μM RA על ידי הטיית הצלחת וצינור החוצה המדיום כמתואר לעיל.
   הערה: מומלץ להחליף לפחות מחצית מהמדיום במדיום רענן המכיל RA בימים 5 ו -7. שימו לב למדד האדום פנול; אם זה הופך צהבהב, עדיף להחליף את כל המדיום.
8. ביום 8, לקצור את NPCs על ידי איסוף התאים, centrifuging ב 200 x g במשך 3 דקות, והסרת supernatant.
   הערה: NPCs ניתן גם לשטוף עם PBS 1x בהתאם לצרכים של ניסויים הבאים. במידת הצורך, NPC יכול להיות קפוא ולהפשיר שוב לתרבות וניתוח מאוחרים יותר. אם NPC הם להיות תרבותי, accutase יכול לשמש גם כחלופה טריפסין.
9. כדי להמשיך את ההליך ולהבדיל NPCs לנוירונים, לאסוף NPCs בצינור חרוט 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה, לנתק אותם עם טריפסין ולדגירה אותם ב 37 °C (3 דקות). Pipette NPCs כדי להבטיח כי כל אגרגטים NPC מנותקים ולנטרל את טריפסין עם המדיום.
10. לסנן את התאים עם מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר ולספור את התאים לפני ציפוי אותם בצפיפות של 1.5 x 10⁵/cm² בינוני N2 (DMEM / F12 בינוני + 3 מ"ג / מ"ל גלוקוז + 3 מ"ג / מ"ל שור עשיר בשומנים אלבומין בסרום (LBSA) + תוספת 1:100 N2 + 10 ננוגרם / מ"ל bFGF + 50 U / mL עט / סטרפטוקומין + 1 mM L-גלוטמין) על צלחת שטופלו תרבית רקמות לניסויי PCR וכתם מערביים הבאים; או על תא תרבית רקמות לניסויים אימונופלואורסצנטיים.
11. ביום 9, להחליף את המדיום הישן עם מדיום N2 טרי.
12. ביום 10, לעבור את N2 בינוני עם N2/B27 בינוני (50% DMEM / F12 ו 50% בזלת עצבית, 3 מ"ג / מ"ל LBA, 1:200 תוספת N2, תוספת 1:100 B27, 50 U / mL עט / סטרפטופון, ו 1 מ"מ L-גלוטמין).
13. בימים 11-12, לקצור את הנוירונים כדלקמן. לשטוף את התאים עם 1x PBS, להוסיף טריפסין, ודגרה את התרבות באינקובטור 37 °C במשך 3 דקות לפני נטרול טריפסין עם בינוני צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות.

3. אפיון של mESCs ותאים מובחנים

1. אלקליין פוספטאז (AP) אסייד
   1. השתמש בערכה להערכת פעילות הפוספטאז האלקליין (ראה טבלת החומרים).
   2. הסר את המדיום מצלחת התרבות ושטוף את ה- ESCs עם PBS 1x.
   3. הוסף 1 מ"ל של פתרון התיקון (מורכב פורמלדהיד ומתנול) המסופק עם הערכה לצלחת ודגר אותה בטמפרטורת החדר במשך 2-5 דקות.
      הערה: דגירה יתר בפתרון התיקון עלולה לסכן את פעילות AP.
   4. הסר את פתרון התיקון, לשטוף את ESCs עם 1x PBS ולהשאיר כמות מסוימת של PBS בצלחת.
      הערה: שמור על ה- ESCs לחים ב- PBS כדי לא לסכן את פעילות AP.
   5. הכן את פתרון AP על-ידי ערבוב פתרונות המצע A, B ו- C ביחס של 1:1:1. מערבבים תחילה את הפתרונות A ו- B ודגרים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות לפני הוספת תמיסה C.
   6. הסר את PBS 1x והוסף את פתרון AP שהוכן קודם לכן.
   7. לדגור על ESCs במשך כ 15 דקות בחושך על ידי עטיפת צלחת התרבות עם רדיד אלומיניום או ביצוע שלב 3.5 בחדר חשוך.
   8. נטר את התגובה והסר את פתרון התגובה כאשר הפתרון הופך בהיר כדי למנוע כתמים לא ספציפיים.
   9. לשטוף את ESCs פעמיים עם PBS 1x.
   10. מנעו את הייבוש של הדגימה על-ידי כיסוי ה-ESCs באמצעות PBS 1x או הרכבה בינונית.
       הערה: כתם אדום או סגול יופיע עבור ביטוי AP. ניתן לאחסן את הצלחת במקרר של 4 מעלות צלזיוס.
2. RT-qPCR
   1. לאסוף תאים בשלבים שונים על-ידי ביצוע שלבים 1.6-1.7 ו- 2.4 עבור ESCs ו- EBs ו- NPC, בהתאמה.
   2. לבודד RNA באמצעות RNA, DNA, פתרון מיצוי חלבון (ראה טבלה של חומרים).
   3. צור cDNA עם ערכת תמלול הפוכה (ראה טבלת החומרים) ופעל לפי מדריך היצרן.
3. קיבוע והטבעה
   1. קציר EBs ו- NPCs כמתואר לעיל (שלב 2.6) ולתקן אותם עם 4% פתרון paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הסר PFA ולשטוף את המדגם עם 1x PBS במשך 5 דקות.
   3. מקם את המדגם בדילול טורי של 1x PBS, 10%-, 20%-, ו 30%-סוכרוז פתרונות ב 25\u201228 °C שבו המדגם מועבר לפתרון הבא לאחר 30 דקות של דגירה.
      הערה: ניתן לאחסן את המדגם בתמיסת סוכרוז 30% ב- 4 °C (70 °F) לפני שתמשיך בשלב ההטבעה.
   4. מרטיבים את קצה הפיפטה עם תמיסת סוכרוז לפני שמניחים את המדגם (מבלי לערום אותם) במרכז תבנית הקריו ומכניסים את הנוזל העודף.
      הערה: נייר סינון יכול לשמש גם כדי להסיר את הפתרון העודף. הרטבת קצה הפיפטה עם פתרון סוכרוז חשובה כדי למנוע את EBs ו- NPCs מלהידבק לקירות הקצה.
   5. בזהירות להוסיף טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) פתרון לתבנית מבלי resuspending הדגימות ולהסיר בועות עודף עם pipette.
   6. מניחים את התבנית עם המדגם על מערבל מעבדה במהירות נמוכה כדי להתסיס קלות את המדגם במשך 15 דקות. פעולה זו מסייעת ליישב את ה- EBs וה- NPC לתחתית אם הם תלויים מחדש בפתרון OCT.
   7. להקפיא במהירות את המדגם על ידי הצבת התבנית בחנקן נוזלי או על קרח יבש.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות במקפיא של -70 °C לפני שתמשיך לשלב הבא.
4. קריוזקציה
   1. הגדר את cryostat להתקרר -20 כדי -18 °C (50 °F) לפני העברת המדגם למכשיר.
   2. לנתק את בלוק OCT קפוא מן התבנית ולאבטח אותו על המחזיק עם פתרון OCT קטן הניח על פני השטח של המחזיק.
   3. ישר את בלוק OCT כך שה- EBs וה- NPC יהיה הקרוב ביותר ללהב כדי להבטיח שהדגימה לא תאבד במהלך ניתוח.
   4. בזהירות סעיף 10 מיקרומטר של הבלוק ולשים לב לפרוסות המכילות את המדגם.
   5. הניחו במהירות את פרוסת OCT המכילה את הדגימה על מגלשת הזכוכית המטביעה רקמות ואפשרו לפרוסות OCT להתייבש באוויר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב- -70 °C (70 °F) לשימוש מאוחר יותר.
5. אימונופלואורסצנטיות (IF)
   1. בלוק מקטעי OCT או תאי תרבות המכילים נוירונים בסרום חמור רגיל 10% / 0.1% Triton X-100 ב 1x PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
   2. לדגור את הדגימות בנוגדן ראשוני מדולל בסרום חמור רגיל 5% / 0.05% Triton X-100 ב 1x PBS לילה ב 4 °C (5 °F).
   3. לשטוף דגימות ב 1x PBS / 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים במשך 5 דקות כל לשטוף.
   4. לדגור על הדגימות עם נוגדן משני מדולל בסרום חמור רגיל 5% / 0.05% טריטון X-100 ב 1x PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
   5. לשטוף דגימות 1x PBS / 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים במשך 5 דקות כל לשטוף ואז לדגור על הדגימות 1 מיקרוגרם / mL DAPI.
   6. הר את הדגימות עם כיסוי וכמה בינוני הרכבה ולאפשר לו להתייבש.
   7. שימו לב לדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
6. ניתוח RNA-seq
   1. לאסוף את התאים בשלבים שונים ולבצע מיצוי RNA (ראה שלב 3.2).
   2. הכן את ספריות cDNA, בצע רצף עמוק וניתוח נתונים בהתאם לפרוטוקול המתואר בוונג ואח^'8.
   3. בצע את ניתוח אונטולוגיה גנטית (GO) באמצעות חבילת R, clusterProfiler.
7. ציטומטריית זרימה
   1. אסוף ESCs על-ידי ביצוע השלבים 1.6-1.7 וקבע מחדש את התאים במצב בינוני. אסוף את ה- EBs וה- NPC על-ידי ביצוע השלב 2.4 והידוק מחדש של התאים במצב בינוני.
   2. לסנן את השעיית התא באמצעות מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
   3. מדוד את אות GFP של הדגימות באמצעות cytometer הזרימה (מבוצע על ידי מתקן הליבה של המוסד).

תוצאות

כייצוג של השיטה שלנו, ביצענו ניסוי בידול EB, NPC, נוירונים על תאי E14. תאי E14 היו בתרבית על MEFs המוקרנים γ (איור 1A) עד שאוכלוסיית MEF המוקרנת γ מדוללת. אישרנו את הפלוריפוטנס של תאי E14 על ידי ביצוע כתמי פוספטאז אלקליין (AP)(איור 1B)ומאוחר יותר RT-qPCR (ראה להלן) עבור סמני ננו...

Discussion

השיטה לבידול עצבי של תאי גזע עובריים של עכבר הוקמה במשך עשרות שנים והחוקרים המשיכו לשנות את הפרוטוקולים הקודמים או ליצור חדשים למטרות שונות^7,10,11. השתמשנו בסדרה של בדיקות כדי לנתח באופן מקיף את היעילות וההתקדמות של שלבי הבידול של mESCs לנויר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0.1% Gelatin	Sigma	G1890-100G	Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	28908	Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer	Falcon	352340
Albumax	Thermo Fisher Scientific	11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11001	Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II	Stemgent	00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox	Azura Genomics	AZ-2105
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSCanto	BD	657338
bFGF	Sigma	11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Chir99021	Cayman Chemicals	13122
Chloroform	C298-500	Fisher Chemical
DAPI	Invitrogen	R37606
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB buffer	Qiagen	19086
Ethanol	111000200	Pharmco	Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY-401-2501
Isopropanol	BDH1133-4LG	BDH VWR Analytical	Diluted in de-ionized water
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/A	Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers	IDTDNA	N/A	5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
mNanog primers	IDTDNA	N/A	5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers	IDTDNA	N/A	5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers	IDTDNA	N/A	5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers	IDTDNA	N/A	5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers	IDTDNA	N/A	5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin primary antibody	Millipore	MAB5326	Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament primary antibody	DSHB	2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit	BioO Scientific	NOVA-5138-07
PD0325901	Cayman Chemicals	13034
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	Prepared in de-ionized water
- Potassium chloride	P217-500G	VWR
- Potassium phosphate monobasic anhydrous	0781-500G	VWR
- Sodium chloride	BP358-10	Fisher Bioreagents
- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate	SX0715-1	Milipore
Random hexamer primer	Thermo Scientific	SO142
Retinoic acid	Sigma	R2625	Prepared in DMSO
Sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
Sucrose	Sigma	84097	Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583
TriPure Isolation Reagent	Sigma-Aldrich	11667165001
TruSeq Rapid	Illumina	20020616
β-mercaptoethanol	Fisher BioReagents	BP176-100