* These authors contributed equally
הפרוטוקול המוצג כאן מספק מידע על אלקטרואנצפלוגרפיה בו זמנית (EEG) והערכה התנהגותית בזמן אמת. דנו בכל השלבים הכרוכים בפרוטוקול זה כפתרון אטרקטיבי לחוקרים בתחומים רבים של מדעי המוח, במיוחד בתחומי למידה וזיכרון.
משרעת גלי המוח המתקבלת מאלקטרואנצפלוגרפיה (EEG) מוכרת היטב כבסיס ליכולת קוגניטיבית, זיכרון ולמידה על בעלי חיים ובני אדם. מנגנון נוירוגנזה למבוגרים קשור גם לשיפור הזיכרון והלמידה. באופן מסורתי, חוקרים נהגו להעריך פרמטרים של למידה וזיכרון במודלים של מכרסמים לפי משימות התנהגותיות. לכן, ניטור סימולטני של שינויים התנהגותיים ו- EEG מעניין במיוחד בקורלציה בין נתונים בין פעילות מוחית והתנהגויות הקשורות למשימה. עם זאת, רוב הציוד הנדרש לביצוע שני המחקרים הוא מורכב, יקר, או משתמש ברשת התקנה קווית המעכבת את תנועת בעלי החיים הטבעיים. במחקר זה, EEG נרשם באמצעות מכשיר אלקטרופיזיולוגיה אלחוטי יחד עם ביצוע משימת זיהוי אובייקטים חדשה (NORT). התנהגות החיה נוטרה בו זמנית על ידי מערכת מעקב וידאו. שתי ההקלטות נותחו באופן לא מקוון על ידי חותמות הזמן שלהן, שסונכרו כדי לקשר בין אותות EEG לבין פעולות החיה. הנבדקים מורכבים מחולדות וויסטאר בוגרות לאחר טיפול העשרה סביבתי לטווח בינוני. שש אלקטרודות בורג גולגולת היו קבועות בזוגות על שתי ההמיספרות מעל האזור המצחי, המרכזי והקודקודי והופנו לאלקטרודה הממוקמת בחלק האחורי של עצם האף. פרוטוקול NORT מורכב מחשיפת בעל החיים לשני חפצים זהים למשך 10 דקות. לאחר שעתיים ו -24 שעות, אחד החפצים הוחלף בחדש. זמן החיפוש של כל אובייקט נוטר על ידי תוכנת מעקב התנהגותית (BTS) ורישום נתוני EEG. ניתוח ה-EEG המסונכרן עם נתונים התנהגותיים מורכב מהערכות של עוצמת פס אלפא ובטא יחסית והשוואות בין זיהוי עצמים חדשים לעומת חקר עצמים מוכרים, בין שלושה שלבי ניסוי. בכתב יד זה דנו בתהליך ייצור אלקטרודות, ניתוח השתלת אלקטרודות אפידורליות, פרוטוקול העשרה סביבתית, פרוטוקול NORT, הגדרת BTS, צימוד EEG – BTS לניטור סימולטני בזמן אמת, וניתוח נתוני EEG המבוסס על זיהוי אירועים אוטומטי.
מבחן התנהגותי הוא חיוני במחקר מדעי המוח עבור כמות גדולה של מידע שנוצר בהקשר in vivo. בהקשר זה, חוקרים השתמשו באופן נרחב במבחנים התנהגותיים שונים כדי לנתח תפקוד סנסורי-מוטורי, אינטראקציות חברתיות, התנהגות דמוית חרדה ודיכאון, תלות בחומרים וצורות שונות של תפקודים קוגניטיביים1. הקלטה ידנית של מבחנים התנהגותיים עשויה להיות קשה, מתישה ולא מדויקת אפילו עבור רוב הצופים המומחים. למרות שנעשו מאמצים מסוימים לפתח תוכנה חופשית וקוד פתוח לרישום התנהגות (למשל, אפליקציית sexrat male2 להתנהגות מינית), מספר חלופות מאפשרות רישום התנהגותי אוטומטי ובזמן אמת של מיני בעלי חיים שונים מדגים3 ועד מכרסמים 4,5,6. מעקב וידאו הוא שיטה חשובה להקלטת התנהגות מהירה ומדויקת המשמשת במגוון רחב של יישומים7. תכונה פוטנציאלית יותר באזור ההקלטה ההתנהגותית היא לחקור את הפעילות העצבית במהלך הביטוי ההתנהגותי. רישום סימולטני של פעילות עצבית (מתאים בודדים לאזורי המוח העיקריים) ומשימות התנהגותיות יכול להראות לנו כיצד המוח מייצר דפוסי התנהגות ספציפיים8. התנהגויות הן רצף של מרכיבים מינוריים שיכולים לחשוף קורלציה בין הפעילות העצבית לבין תנועות או פעולות. אם פעילות עצבית ודפוסים התנהגותיים יכולים להיות מתועדים בו זמנית באמצעות טווחי זמן מרובים, הם יכולים להסביר כיצד כל מצב מוחי מתואם עם כל התנהגות מסוימת (לבחינה מעמיקה יותר של רישום התנהגותי, ראו Datta et al., 2019 review8). לכן, רישום מסונכרן של פעילות התנהגותית ועצבית בקנה מידה רצוי (מנוירונים לאזורים גדולים במוח) נחשב ככלי שימושי ביותר. ישנן מספר מערכות המיועדות לשלב הקלטות התנהגותיות עם מדידות אחרות כפעילות עצבית 4,5.
למרות שאלקטרואנצפלוגרפיה נחשבת לאחת הטכניקות הנפוצות ביותר בתחום מדעי המוח הקליניים והמחקריים, הניידות הגבוהה יחסית, כמו גם גודלו של מכשיר ההקלטה EEG, הופכת טכניקה זו לייחודית ומאתגרת לזיהוי במקרה של דגמי in vivo9. כמה פתרונות לבעיה זו פותחו, למשל, שימוש בכבלים ובמכשירים מסתובבים המאפשרים לבעלי חיים לנוע בחופשיות בזירה. עם זאת, מערכות מבוססות כבלים מטילות לעתים קרובות בעיות לביצוע מחקרים, למשל, במהלך העברת בעל חיים מכלוב אחד למשנהו, נצפית הפרעה או הסתבכות של בעל החיים עם הכבלים. מכשירים טלמטריים פותחו עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אלחוטיות כדי להגדיל את הגמישות של מצב ההקלטה10,11. עם זאת, מערכות אלה הראו מגבלות ניכרות בשל מספרן הנמוך של ערוצי הקלטה ושיעורי דגימה נמוכים11. במחקר זה השתמשנו במערכת אלחוטית מסחרית השולחת אותות EEG מהחיה דרך חיבור Wi-Fi עם מערכת מכרסמים הנעה בחופשיות12. המכשיר שוקל 6 גרם ועומד עד 16 ערוצים שהוקלטו ב 1 kSps. מערכת זו מאפשרת רישום EEG או ספייק בסביבת בעלי החיים, עם הפרעה מופחתת, ומהווה פתרון חסכוני בהשוואה למערכות האלקטרופיזיולוגיות המסורתיות בשוק. בנוסף, סנכרנו נתונים אלה באמצעות תוכנת מעקב וידאו כדי לספק מתאם בין EEG לבין דפוסי התנהגות. סנכרון זה נעשה באופן לא מקוון על ידי יישור ואינטרפולציה של נתונים ואירועים בהתבסס על חותמות זמן שנוצרו על ידי שתי המערכות ומעובד ב- MATLAB.
נוירוגנזה בוגרת מוגדרת כהתפשטות, הישרדות והתמיינות בתאי עצב של תאים חדשים שנוצרו בבליטה המשוננת של בעלי חיים13,14. תהליך זה ידוע כקשור לשיפור הזיכרון והלמידה אשר מגביר נוירוגנזה של מבוגרים במכרסמים באמצעות תנאי סביבה מועשרת (EE)15. EE מורכב משיכון מכרסמים בקבוצות קטנות בתוך כלוב גדול המסופק עם צעצועים וצינורות, שבו לבעלי חיים יש חידושים ומורכבים אך ללא רלוונטיות ביולוגית15. למרות ש- EE מגרה נוירוגנזה בהיפוקמפוס, הוא משתנה גם בגורמים רבים כגון גיל, זן בעלי חיים, תנאי גירוי ספציפיים או הליך זיהוי נוירוגנזה. בעכברים בגיל העמידה שנחשפו לדיור EE במשך שבעה ימים, דווח על לידת תאים גרגיריים חדשים (GC) בבליטה המשוננת בהיפוקמפוס (DG)16. מחקרים המנסים לעבד נוירוגנזה בוגרת בחולדות בוגרות באופן סלקטיבי הציעו כי תאים גרגיריים חדשים בני שבוע עד שבועיים נדרשים בתגובה הנלמדת17. בסביבות 2 או 3 שבועות לאחר GC נולדים במבוגרים DG, כמה תכונות אופייניות כגון קוצים דנדריטיים, אשר חיוניים עבור שידור סינפטי מעורר18, מתחילים להופיע. Zhao et al. ביצעו ניתוח כמותי כדי להראות כי שיא צמיחת עמוד השדרה מתרחש במהלך 3 - 4 השבועות הראשונים19. מספר מחקרים אלקטרופיזיולוגיים in vivo מצביעים על כך שרק שלושה שבועות של תנאי דיור EE מייצרים שינויים בשידור הסינפטי של DG ומגבירים את עוררות התאים20. כמו כן, דווח כי חשיפה לסביבה מועשרת 1-4 שבועות לאחר זריקות BrdU הגדילה באופן משמעותי את צפיפות תאי BrdU/NeuN בשכבה הגרגירית DG בעכברים21. מחברים אלה מציעים כי תקופה קריטית קיימת בין שבוע לשלושה שבועות לאחר החשיפה ל- EE מאז נצפתה עלייה משמעותית במספר נוירונים חדשים21. מחקרים על נוירוגנזה של ההיפוקמפוס הבוגר (AHN) בבני אדם היו שנויים במחלוקת מכיוון שלא היו ראיות ישירות. עם זאת, דו"ח שפורסם לאחרונה תיאר את שלבי ההתפתחות של AHN במוח הבוגר האנושי, זיהה אלפי נוירונים לא בשלים ב- DG, ובכך הדגים את החשיבות של AHN במהלך ההזדקנות בבני אדם22. בהתבסס על הראיות שהוזכרו קודם לכן, המחקר של AHN במודלים של בעלי חיים חשוב יותר מאי פעם (לבחינה מעמיקה יותר של AHN, ראו Leal-Galicia et al., 2019 review15).
כאמור, ההיפוקמפוס נקשר לפונקציה בסיסית ביכולות למידה וזיכרון. היווצרות זיכרונות עוברת שלושה תהליכים נפרדים: קידוד (רכישת זיכרון), קונסולידציה (אחסון זיכרון) ושליפה (זיהוי זיכרון)23. זיכרון זיהוי בבני אדם נבדק באמצעות משימת השוואות חזותיות24. היסודות של מודלים אנושיים וחייתיים של זיכרון ואמנזיה הם המבחנים ההתנהגותיים המעריכים את היכולת לזהות גירויים שהוצגו קודם לכן25,26, כפי שעושה משימת ההשוואה הזוגית החזותית בבני אדם. לכן, אחד המבחנים ההתנהגותיים הנפוצים ביותר להערכת יכולתו של מכרסם לזהות גירוי שהוצג בעבר, כלומר, יכולת הלמידה והזיכרון הוא משימת זיהוי אובייקט ספונטנית חדשה (NORT)23,27. פרוטוקול NORT מורכב משני אובייקטים חדשניים זהים בזירה מוכרת למשך 10 דקות במשפט הרכישה. לאחר זמן מסוים בין 0 28 ל48 שעות29 (זמן משתנה על פי כל פרוטוקול), החיה מוחזרת לאותה זירה המכילה אחד מאותם חפצים מוכרים, ואובייקט חדש אחד. החיה חוקרת באופן ספונטני את האובייקט החדש אם האובייקט המוכר היה בעל פה26 . יחס ההעדפה משמש בדרך כלל להערכת ביצועי חיפוש. היא נקבעת על ידי חלוקת זמן חקר האובייקט הכולל מזמן החקירה של הרומן או האובייקט המוכר. ל- NORT יש כמה יתרונות על פני מבחני זיכרון זיהוי אחרים. והכי חשוב, זה לא דורש מוטיבציה חיצונית, תגמול או עונש. זה לא יוצר תנאים מלחיצים. לבסוף, אין צורך באימון כדי לעורר את ההתנהגות של חקירת האובייקטים (לבחינה מעמיקה יותר של NORT, ראה ref.23).
לכן, רישום סימולטני של אופני נתונים מרובים ושילובם בחקר הלמידה והזיכרון, כהשפעה של נוירוגנזה בהיפוקמפוס בוגר, אטרקטיבי ביותר ומספק פתרון משכנע לחוקרים בתחום. העבודה הנוכחית תחשוף את כל התהליכים המעורבים בהערכת מעקב וידאו התנהגותית בו זמנית (משימת זיהוי אובייקטים חדשנית) והקלטת אלקטרואנצפלוגרפיה אלחוטית. כאן סקרנו את תהליך ייצור האלקטרודות, ניתוח השתלת אלקטרודות אפידורליות (בורג גולגולת), פרוטוקול העשרה סביבתית (להשראת נוירוגנזה בהיפוקמפוס), פרוטוקול NORT, הגדרת BTS, צימוד EEG – BTS לניטור סימולטני בזמן אמת, וניתוח נתוני EEG והתנהגות המבוצע בסביבת מחשוב MATLAB.
ד"ר סילביה אורטגה-מרטינז עובדת כעובדת של Stoelting Co., חברה שסיפקה ומימנה את ההפקה וגישה פתוחה למאמר זה.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved