הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

Summary

בנייר שיטה זה, אנו מציגים אסטרטגיית סינון בתפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות, כגון אוסמוליטים, שיש להן השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.

Abstract

מתמידי חיידקים מוגדרים כתת-אוכלוסיות קטנות של גרסאות פנוטיפיות עם היכולת לסבול ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה. הם דאגה בריאותית חשובה כפי שהם קושרו עם זיהומים כרוניים חוזרים ונשנים. למרות הדינמיקה סטוכסטי ודטרמיניסטי של מנגנונים הקשורים ללחץ ידועים לשחק תפקיד משמעותי בהתמדה, מנגנונים שבבסיס המעבר פנוטיפי אל / ממצב ההתמדה אינם מובנים לחלוטין. בעוד גורמי התמדה המופעלים על ידי אותות סביבתיים (למשל, דלדול של מקורות פחמן, חנקן וחמצן) נחקרו בהרחבה, ההשפעות של osmolytes על התמדה עדיין לא נקבעו. באמצעות microarrays (כלומר, 96 לוחות באר המכילים כימיקלים שונים), עיצבנו גישה כדי להבהיר את ההשפעות של osmolytes שונים על Escherichia coli התמדה באופן תפוקה גבוהה. גישה זו היא טרנספורמטיבית כפי שהוא יכול להיות מותאם בקלות עבור מערכי הקרנה אחרים, כגון לוחות סמים וספריות נוקאאוט גנים.

Introduction

תרביות חיידקים מכילות תת-אוכלוסיות קטנות של תאים מתמידים הסובלניים באופן זמני לרמות גבוהות במיוחד של אנטיביוטיקה. תאים מתמידים זהים גנטית לקינס הרגישים לאנטיביוטיקה שלהם, והישרדותם יוחסה לעיכוב גדילה חולף¹. תאים מתמידים התגלו לראשונה על ידי גלדיס^{תחביב 2} אבל המונח שימש לראשונה על ידי ג'וזף ביגר כאשר הוא זיהה אותם בתרבויות פיוגנס סטפילוקוקוס שטופלו פניצילין³. מחקר מכונן שפורסם על ידי Balaban et al.⁴ גילה שני סוגים מתמידים: גרסאות מסוג I הנוצרות בעיקר על ידי מעבר דרך השלב הנייח, וגרסאות סוג II הנוצרות ברציפות במהלך הצמיחה המעריכית. מתמידים מזוהים על ידי מבחני הישרדות קלונוגניים, שבהם דגימות תרבות נלקחות במרווחי זמן שונים במהלך טיפולים אנטיביוטיים, שטופים, מצופים על מדיום צמיחה טיפוסי לספור את התאים ששרדו שיכולים להתיישב בהעדר אנטיביוטיקה. קיומם של מתמידים בתרבית התא מוערך על ידי עקומת להרוג biphasic^4,5 שבו הריקבון המעריכי הראשוני מציין את מותם של תאים רגישים לאנטיביוטיקה. עם זאת, מגמת ההרג פוחתת עם הזמן, ובסופו של דבר מובילה לאזור מישור המייצג את התאים המתמשכים ששרדו.

תאים מתמידים קושרו עם מחלות שונות כגון שחפת⁶, סיסטיק פיברוזיס⁷, קנדידה⁸ ודלקות בדרכי השתן⁹. כמעט כל המיקרואורגניזמים שנבדקו עד כה נמצאו כדי ליצור פנוטיפים מתמידים, כולל שחפת מיקובקטריוםפתוגנית מאוד⁶, סטפילוקוקוס אוראוס¹⁰, פסאודומונס aeruginosa⁷ ו קנדידה אלביקנס⁸. מחקרים אחרונים מספקים גם ראיות לעלייתם של מוטנטים עמידים multidrug מתת-אוכלוסיות מתמידות^11,12. מאמצים ניכרים בתחום זה גילו כי מנגנוני ההתמדה מורכבים ומגוונים ביותר; הן גורמים סטוכסטיים ודטרמיניסטיים הקשורים לתגובת SOS^13,14, מיני חמצן תגובתי (ROS)¹⁵, מערכות רעלן/אנטיטוקסין (ת"א)¹⁶, אוטופגיה או עיכול עצמי¹⁷ ותגובה מחמירה הקשורה ל- ppGpp¹⁸ ידועים כמקלים על היווצרות מתמשכת.

למרות התקדמות משמעותית בהבנת פנוטיפ ההתמדה, ההשפעות של אוסמוליטים על התמדה חיידקית לא הובנו במלואן. מאז השמירה על לחץ אוסמוטי אופטימלי הוא הכרח לצמיחה של התאים, תפקוד תקין והישרדות, מחקר מעמיק של osmolytes יכול להוביל מטרות פוטנציאליות עבור אסטרטגיות אנטי מתמיד. למרות מייגע, סינון תפוקה גבוהה היא גישה יעילה מאוד לזיהוי מטבוליטים וכימיקלים אחרים הממלאים תפקיד מכריע בפנוטיפ התמדה^19,20. בעבודה זו, נדון בשיטה שפורסמה^{שלנו 19}, שם השתמשנו microarrays, כלומר, 96 לוחות באר המכילים osmolytes שונים (למשל, נתרן כלורי, אוריאה, נתרן חנקתי, נתרן חנקתי, אשלגן כלורי), כדי לזהות osmolytes המשפיעים באופן משמעותי E. coli התמדה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת מדיום צמיחה, פתרון אולוקסאצין ומניות תאי E. coli

1. מדיום לוריא-ברטני רגיל (LB): הוסף 10 גרם/ליטר של טריפטון, 10 גרם/ליטר של נתרן כלורי (NaCl) ו-5 גרם/ליטר של תמצית שמרים במים שעברו דה-יון (DI). לעקר את המדיום על ידי autoclaving.
2. צלחות אגר LB: להוסיף 10 גרם / ליטר של טריפטון, 10 גרם / L של NaCl, 5 גרם / L של תמצית שמרים ו 15 גרם / L אגר במים DI לעקר את המדיום על ידי autoclaving. בטמפרטורה הרצויה (~ 55 מעלות צלזיוס), יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר בינוני לתוך צלחות מרובעות (10 x 10 ס"מ). יבש את הצלחות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
3. בינוני LB שונה: להוסיף 10 גרם / ליטר של טריפטון ו 5 g / L של תמצית שמרים במים DI. לעקר את המדיום על ידי autoclaving.
4. מדיום LB שונה כולל אוסמוליט: מערבבים מדיום LB שונה 2x עם פתרון osmolyte 2x בכמויות שוות. כדי להכין 2x שונה LB בינוני, להוסיף 20 גרם / ליטר של טריפטון ו 10 g / L של תמצית שמרים במים DI לעקר על ידי autoclaving. כדי להכין את הפתרון osmolyte 2x, להמיס את osmolyte של עניין (כמות 2x) במים DI, ולאחר מכן לסנן לעקר את הפתרון.
   הערה: ניתן לקבוע את אוסמוליט העניין וריכוזיו ממאמרי ההקרנה של פנוטיפ מיקרו-ארי (ראה פרוטוקול 4). עם זאת, osmolyte נבדק ואת הריכוז 2x הקשורים ניתן להתאים בהתאם לאופי המחקר. לדוגמה, כדי ללמוד את ההשפעה של 1 mM נתרן כלורי, פתרון osmolyte 2x יהיה פתרון נתרן כלורי 2m.
5. פתרון מלאי Ofloxacin (5 מ"ג / מ"ל): להוסיף 5 מ"ג של מלח ofloxacin (OFX) ב 1 מ"ל של מים DI. הוסף 10 μL של 10 M נתרן הידרוקסידי כדי להגדיל את המסיסות של OFX במים, ולאחר מכן לסנן לעקר את הפתרון. הכינו aliquots ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
   הערה: Ofloxacin היא אנטיביוטיקה quinolone כי כבר בשימוש נרחב עבור תאים חיידקיים גדל ולא גדל^14,21. הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של OFX לתאי E. coli MG1655 נמצא בטווח של 0.039-0.078 מיקרוגרם / מ"ל^19,20. כמו כן שים לב כי אנטיביוטיקה אחרים כגון אמפיצילין ו kanamycin משמשים בדרך כלל במחקר מתמיד. הבחירה באנטיביוטיקה תלויה באופי המחקר.
6. אי קולי מניות תא MG1655: לחסן 2 מ"ל של מדיום LB רגיל עם מושבה אחת במבחנה 14 מ"ל (snap-capped) ותרבות התאים בשייקר מסלולית ב 250 סל"ד ו 37 °C (67 °F). כאשר התאים מגיעים לשלב הנייח, מערבבים 500 μL של תרבות התא עם 500 μL של 50% גליצרול (סטרילי) בבקבוקון קריוגני ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

2. הפצת תאים כדי לחסל מתמידים קיימים

1. כדי להכין תרבות לילה, לגרד כמות קטנה של תאים ממלאי תא קפוא עם קצה פיפטה סטרילי (לא להפשיר את מלאי תא גליצרול), ולחסן את התאים ב 2 מ"ל של מדיום LB שונה במבחנה 14 מ"ל snap-capped. תרבות התאים בשייקר מסלולית ב 250 סל"ד ו 37 °C (69 °F) עבור 12 שעות.
2. הפצה ראשונה
   1. לאחר 12 שעות, להעביר 250 μL של תרבות הלילה ל 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל מכוסה רדיד אלומיניום סטרילי.
   2. הגדל את תרבית התאים בשייקר מסלולי במהירות של 250 סל"ד ו- 37 °C (600 סל"ד) עד שהתאים יגיעו לשלב המעריכי האמצעי (OD₆₀₀ = 0.5).
   3. למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD₆₀₀) באמצעות קורא microplate כל 30 דקות.
3. הפצה שנייה
   1. ב OD₆₀₀ = 0.5, לדלל 250 μL של תרבות התא מן הבקבוק הראשון לתוך 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל.
   2. הגדל את תרבות התאים השנייה בשייקר מסלולי במהירות של 250 סל"ד ו- 37 °C (600 אובדנית) עד_{OD 600}=0.5.
   3. למדוד את הצפיפות האופטית כל 30 דקות.
      הערה: תרבות לילה עשויה להיות כמות משמעותית של תאים מתמידים^4,5,22. שיטת מחזור דילול / צמיחה⁵ המתואר לעיל ניתן להשתמש כדי לחסל אלה מתמידים קיימים לפני העברת התאים microarrays. ניתן לאמת את חיסולם על ידי כימות רמות מתמשכות של תרבויות לילה עם ההסתעפות המתוארת בפרוטוקול 3. שיטה זו כבר אומתה במחקר קודם¹⁹.

3. אימות חיסול של תאים מתמידים קיימים

1. לאחר ההפצה השנייה (ראה שלב 2.3), לדלל 250 μL של תרבות התא (OD₆₀₀ = 0.5) ב 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל.
   הערה: עבור פקדים, לדלל 250 μL של תרבות הלילה (ראה שלב 2.1) ב 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל. לפני העברת התאים לבקבוקון, יש להתאים את צפיפות התאים של תרבות הלילה במדיום LB שונה טרי כדי להשיג OD₆₀₀ = 0.5.
2. הוסף 25 μL של פתרון מניית OFX (5 מ"ג / מ"ל) לתוך ההשעיה התא ולנער את הבקבוק בעדינות כדי להפוך את תרבות התספורת הומוגנית. הריכוז הסופי של OFX הוא 5 מיקרוגרם / מ"ל בתרבות ההסתעפות.
3. דגירה את תרבות מבחני במסלול שייקר ב 250 סל"ד ו 37 °C (69 °F).
4. בכל שעה במהלך הטיפול (כולל 0 שעות, נקודת הזמן לפני הוספת OFX לתרבות ההסתעפות), להעביר 1 מ"ל של תרבות ההסתעפות מהבקבוק לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
5. צנטריפוגה תרבות ההסתעפות בצינור microcentrifuge ב 17,000 x g במשך 3 דקות.
6. בזהירות להסיר 950 μL של supernatant מבלי להפריע גלולה התא.
7. הוסף 950 μL של תמיסת מלח אגירה פוספט (PBS) לתוך הצינור microcentrifuge.
8. חזור על שלבי הכביסה 3.5-3.7 עבור 3x בסך הכל עד ריכוז אנטיביוטי הוא מתחת לריכוז המעכב המינימלי (MIC).
9. לאחר הכביסה הסופית, resuspend גלולת התא ב 100 μL של פתרון PBS, וכתוצאה מכך מדגם מרוכז 10x.
10. קח 10 μL של השעיית התא באופן סדרתי לדלל שש פעמים ב 90 μL של פתרון PBS באמצעות צלחת 96 גם עגול התחתון.
11. ספוט 10 μL של השעיות תא מדולל על צלחות אגר טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי להגדיל את מגבלת הגילוי, צלחת 90 μL הנותרים של השעיית תא על צלחת אגר טרי.
12. דגירה צלחות אגר ב 37 °C (60 °F) עבור 16 שעות, ולאחר מכן לספור את יחידות יוצרות המושבה (CFUs). חשבון עבור שיעורי הדילול בעת חישוב המספר הכולל של CFUs ב 1 מ"ל של תרבות assay. עקומות להרוג נוצרים על ידי התוויית ערכי CFU לוגריתמי ביחס למשך הטיפול האנטיביוטי.
    הערה: טיפול OFX 6 שעות מספיק כדי להשיג עקומת להרוג biphasic עבור E. coli תאים^19,20. הרמה המתמשכת של תאים מופצים (כפי שנמדד על ידי ספירת CFU ב 6 שעות) צריך להיות נמוך משמעותית מזה של תרבות הלילה. ניתן לבצע את ההליכים המתוארים בפרוטוקול 2 ו- 3 עם LB רגיל בהתאם לעיצוב המחקר.

4. הקרנות צלחת Microarray

1. הכנת תרביות מיקרו-תאיות
   1. העבר 250 μL של תאים אקספוננציאליים פאזה ל 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. מערבבים בעדינות את השעיית התא כדי להפוך אותו הומוגני.
      הערה: תאי השלב המעריכי (OD₆₀₀ = 0.5) מתקבלים משלב ההפצה השני (ראה שלב 2.3).
   2. להעביר את המתלה תא מדולל לתוך מאגר סטרילי 50 מ"ל.
   3. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 150 μL של השעיית התא לכל באר של microarray, כלומר, צלחת 96 גם המכיל osmolytes שונים.
      הערה: בארות שאין להן אוסמוליטים משמשות כפקדים.
   4. כסו את המיקרו-ראי בקרום איטום חדיר לגז.
   5. דגירה את הצלחת בשייקר מסלולי ב 37 °C (69 °F) ו 250 סל"ד עבור 24 שעות.
      הערה: בניסויים אלה נעשה שימוש בלוחות מסחריים זמינים, כגון Phenotype Microarrays (PM-9 ו- PM-10) הכוללים מגוון רחב של אוסמוליטים, מאגרי pH וכימיקלים אחרים במצב מיובש בריכוזים שונים. microarrays אלה נמצאים במחצית שטח 96 פורמטים צלחת היטב. יש להתאים את נפחי התרבות בהתאם לסוג הלוחות הנמצאים בשימוש. Microarrays יכול גם להיווצר באופן ידני (ראה להלן).
2. הכנה ידנית של צלחות מיקרו-ראי
   1. העבר 75 μL של פתרונות osmolyte 2x לתוך בארות של חצי שטח 96 צלחת היטב.
   2. העבר 500 μL של תאים אקספוננציאליים פאזה ל 25 מ"ל של 2x שונה LB בינוני בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. מערבבים בעדינות את השעיית התא כדי להפוך אותו הומוגני.
      הערה: קצב החיסון הותאם כך שיהיה עקבי עם פרוטוקול המיון של המיקרו-קרינה המתואר ב- 4.1.
   3. הוסף 75 μL של השעיית התא לתוך כל באר של חצי אזור 96 צלחת היטב המכילה פתרונות osmolyte 2x.
   4. דגירה את הצלחת בשייקר מסלולי ב 37 °C (69 °F) ו 250 סל"ד עבור 24 שעות.
3. הכנת לוחות מבחנים מתמידים
   1. הכן 25 מ"ל של מדיום LB שונה המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל של OFX בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולהעביר מדיום זה למאגר סטרילי.
   2. העבר 190 μL של מדיום LB שונה עם OFX מהמאגר לתוך כל באר של צלחת גנרית שטוחה תחתון 96 היטב (צלחת מתמיד-assay) באמצעות פיפטה רב ערוצית.
   3. הסר את microarray מן שייקר (לאחר culturing עבור 24 שעות) ולהעביר 10 μL של תרביות התא מן microarray אל בארות של צלחת מתמיד-assay, המכיל מדיום LB שונה עם OFX.
   4. קח 10 μL של השעיות תאים מלוח ההשעיה-assay באופן סדרתי לדלל שלוש פעמים ב 290 μL של פתרון PBS באמצעות צלחת עגולה למטה 96 גם פיפטה רב ערוצית.
   5. בעקבות הדילול הסדרתי, ספוט 10 μL של כל השעיות תאים בדילול סדרתי על צלחות אגר טרי ללא אנטיביוטיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית.
   6. דגירה צלחת מתמיד-assay (מוכן בשלב 4.3.3) בשייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד עבור 6 שעות לאחר כיסוי הצלחת עם קרום איטום חדיר גז.
   7. לאחר 6 שעות דגירה בשייקר, לקחת את צלחת מתמיד-assay החוצה ולחזור על השלבים 4.3.4-4.3.5.
   8. דגירה צלחות אגר עבור 16 שעות ב 37 °C (69 °F), ולאחר מכן לספור CFUs. רמות CFU לפני ו 6 שעות לאחר הטיפול האנטיביוטי לאפשר לחשב את השבר מתמיד בכל באר. CFU נחשב לפני הטיפול OFX גם לעזור להעריך את ההשפעות של osmolytes ועל הכדאיות E. coli.

5. אימות התנאים שזוהו

1. העבר 250 μL של תאי פאזה מעריכיים משלב 2.3 עד 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי המכיל את osmolyte מזוהה מן ההקרנה microarray (ראה פרוטוקול 4).
2. דגירה הבקבוק בשייקר מסלולית ב 250 סל"ד ו 37 °C (69 °F) עבור 24 שעות.
3. לאחר 24 שעות, להסיר את הבקבוק מן שייקר ולהעביר 250 μL של תרבות התא ל 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל.
4. הוסף 25 μL של פתרון מניית OFX (5 מ"ג / מ"ל) בהשעיית התא ולנער את הבקבוק בעדינות כדי להפוך את תרבות התספורת הומוגנית. דגירה את הבקבוק בשייקר ב 37 °C (60 °F) ו 250 סל"ד.
5. בכל שעה במהלך הטיפול, להעביר 1 מ"ל של תרבות התסעפות מן הבקבוק לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
6. צנטריפוגה תרבות ההסתעפות בצינור microcentrifuge ב 17,000 x g במשך 3 דקות.
7. הסר 950 μL של supernatant ולהוסיף 950 μL של PBS.
8. חזור על שלבי הכביסה 5.6 ו- 5.7 עבור 3x.
9. לאחר הכביסה הסופית, resuspend גלולת התא ב 100 μL של פתרון PBS.
10. קח 10 μL של השעיית התא באופן סדרתי לדלל 6x ב 90 μL של פתרון PBS באמצעות צלחת 96 גם עגול התחתון.
11. ספוט 10 μL של השעיות תא מדולל על צלחת אגר טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי להגדיל את מגבלת הגילוי, צלחת 90 μL הנותרים של השעיית תא על צלחת אגר טרי.
12. דגירה צלחת אגר ב 37 °C (60 °F) עבור 16 שעות, ולאחר מכן לספור CFUs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מתאר את הפרוטוקול הניסיוני שלנו. ניסויי מחזור הדילול/צמיחה (ראו פרוטוקול 2) הותאמו ממחקר שערכה קרן ואח'⁵ כדי לחסל את המתמידים שמקורם בתרבויות הלילה. איור 2A הוא תמונה מייצגת של לוחות אגר המשמשים לקביעת רמות CFU של תרביות תאים לפני ואחרי טיפול...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תפוקה גבוהה מתמיד assay המתואר כאן פותחה כדי להבהיר את ההשפעות של כימיקלים שונים על התמדה E. coli. בנוסף ללוחות PM מסחריים, microarrays ניתן לבנות באופן ידני כמתואר בשלב 4.2. יתר על כן, הפרוטוקול המוצג כאן הוא גמיש והוא יכול לשמש כדי לסנן microarrays אחרים, כגון לוחות סמים וספריות תאים, כי הם 96 פורמטים צלח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-ml test tube	Fisher Scientific	14-959-1B
E. coli strain MG1655	Princeton University		Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-5161
Gas permeable sealing membrane	VWR	102097-058	Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate	VWR	82050-062
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Molecular genetics grade
Ofloxacin salt	VWR	103466-232	HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)	Biolog	N/A	PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-0161
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500	Certified ACS grade
Sodium nitrate	Fisher Scientific	AC424345000	ACS reagent grade
Sodium nitrite	Fisher Scientific	AAA186680B	98% purity
Square petri dish	Fisher Scientific	FB0875711A
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-500	Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-100	Molecular genetics grade