צואה (מיקרו) בידוד RNA

Summary

פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

Abstract

זה הולך ומתברר כי RNA קיים לומן המעיים וצואה בבעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול המתואר להלן מבודד את סך הרנ"א כולל מיקרו-רנ"א מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. המטרה היא לבודד RNA כולל עם טוהר וכמות גבוהים עבור ניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. היתרונות של פרוטוקול אופטימלי זה בבידוד miRNA הם היכולות של בידוד מוצרי RNA מטוהרים מאוד עם שלבי שטיפה נוספים שתוארו, כמות מוגברת של RNA המתקבלת בשיטה משופרת בחידוש הדגימה, וטיפים חשובים של פירוק. מגבלה אחת היא חוסר היכולת לעבד ולטהר מדגם גדול יותר של יותר מ -200 מ"ג מכיוון שגודלי דגימה אלה יגרמו לקושי בהיווצרות ברורה של האינטרפאזה. כתוצאה מכך, גודל המדגם הגדול עלול לזהם את הפאזה המימית שיש לחלץ כמתואר בפרוטוקול עם עניינים אורגניים המשפיעים על איכות הרנ"א המבודד בסופו של דבר. עם זאת, רנ"א מבודד מדגימה של עד 200 מ"ג מספיק לרוב הניתוחים במורד הזרם.

Introduction

רנ"א חוץ-תאי מקבל הכרה כגורם משמעותי המתווך תהליכים ביולוגיים רבים¹. RNA חוץ-תאי בצואה דווח לראשונה בשנת 2008 כסמן לסרטן המעי הגס ולקוליטיס כיבית פעילה², והוא התגלה לאחרונה כמרכיב נורמלי של לומן המעיים והצואה ומתווך תקשורת בין חיידקים מארחים ^3,4,5. מטרת פרוטוקול בידוד RNA זה היא לחלץ RNA חוץ-תאי באיכות גבוהה מדגימות צואה שנאספו מנבדקים בעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול הותאם מתוך ערכת בידוד miRNA מסחרית. הרנ"א הנרכש מנוצל לניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. הפרוטוקול כולל מספר טיפים חשובים ושימושיים כדי למקסם את הכמות והאיכות של RNA שנמצא בצואה של בעלי חיים ובני אדם. הסיבה לפתח ולייעל שיטה זו של בידוד RNA (כולל מיקרו-רנ"א) היא להקטין את הרנ"א המיקרוביאלי בצואה, להגביל את המשתנים במחקרים ולנתח את הרכב הרנ"א במעיים מבלי לקחת בחשבון גורמים מבלבלים שונים ומקורות זיהום. יש לציין שבידוד רנ"א זה ממזער את שחרור הרנ"א מתא חי וממיקרובים חיים (רנ"א תאי). הוא מתמקד ב-RNA חוץ-תאי ששוחררו על-ידי תאי מעיים או נרכשו באמצעות צריכת מזון. בעיקרון, שיטה זו אינה מתאימה למחקרים שבהם נחקר התעתיק המיקרוביאלי.

Protocol

כל השיטות המערבות חיות מחקר המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים בריגהם אנד נשים, בית הספר לרפואה של הרווארד.

כל השיטות המערבות את נושאי המחקר בבני אדם המתוארות כאן הן בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת המחקר האנושית של השותפים.

1. איסוף דגימות צואה

1. Autoclave או להכין צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ונטול נוקלאז 2 מ"ל עם מכסה בורג לכל נבדק בעל חיים בניסוי.
   1. עבור נבדקים אנושיים, ספק מכשיר איסוף דגימות צואה מתאים, ללא נוקלאז וסטרילי עבור כל נושא.
2. לאסוף 25-100 מ"ג (כ 1-4 כדורי צואה עבור דגימות צואה עכבר) של דגימות צואה מכל נושא בעל חיים בסביבה סטרילית.
   הערה: שני כדורי צואה או יותר (~ 50 מ"ג או כבד יותר) מועדפים לקבלת RNA בטוהר הגבוה ביותר.
   1. השתמש בכל ציוד המגן האישי (PPE) והחומרים הדרושים, לדוגמה: זוג כפפות מעבדה, תרסיס חיטוי ומגבת נייר סטרילית, כדי לעקר את אזור העבודה, שבו מונח נושא המחקר בבעלי חיים, כדי למנוע זיהום דגימת צואה.
      1. עבור נבדקים אנושיים, הנחו כל נבדק/אספן מחקר לאסוף 100-200 מ"ג של דגימות צואה בסביבה סטרילית ככל האפשר. השתמש בפעולה סטרילית סטנדרטית והימנע מזיהום דגימת הצואה.
3. אסוף דגימות צואה מכל נושא בעל חיים ישירות לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מכסה בורג מבלי לגעת במשטחים אחרים כדי למנוע זיהום.
   1. עבור נבדקים אנושיים, הנחו כל נבדק לעשות את צרכיו ישירות לתוך מכשיר איסוף ישים המסופק (למשל, ערכת איסוף דגימות צואה סטרילית) כדי למנוע זיהום.
      הערה: יש להנחות את הנושא להימנע מזיהום על ידי משטחי אסלה, מים, שתן או כל משטח/חפץ אחר שאינו סטרילי.
4. הקפיאו דגימות צואה שנאספו בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל באופן מיידי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או הניחו בדלי של קרח יבש לקבלת הכמות והאיכות הטובות יותר של RNA לפני חידוש הצואה כמתואר בשלבים הבאים.
   1. עבור דגימות צואה אנושיות, aliquot כל דגימה טרייה של 200 מ"ג לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל עם כובעי בורג ולהקפיא אותם ב -80 מעלות צלזיוס לפני צואה resuspension כמתואר להלן.
      1. לאחסון דגימות צואה שאינן בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל עם מכסי בורג, שוקלים ומעבירים 100-200 מ"ג כל אחת מהדגימות הקפואות לצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים של 2 מ"ל עם מכסי בורג לפני חידוש הצואה כמתואר להלן.
         הערה: עבור דגימות צואה אנושיות, הימנע מנטילת יותר מ-200 מ"ג של דגימות צואה לבידוד RNA, שכן הדבר עלול לגרום לקשיים בשלבים הבאים. עם דגימה עמוסה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, ייתכן שהפאזה המיימית, הפאזה האורגנית והאינטרפאזה לא ייווצרו ויופרדו בבירור. ניתן להשהות את ההליך כאן.

2. הכנות של פתרונות לשטוף

1. הוסף 21 מ"ל של אתנול בדרגה 100% אתנול של האגודה האמריקאית לכימיה כימית (ACS) לתמיסת הכביסה 1 המסופקת בערכת הבידוד miRNA (ראו טבלת חומרים) כדי להגיע לנפח הסופי של 30 מ"ל, כפי שמוצג על הבקבוק. מערבולת עד שהכל מתמוסס בבקבוק.
2. הוסף 40 מ"ל של אתנול בדרגה ACS 100% לתמיסת הכביסה 2/3 שסופקה כדי להגיע לנפח הסופי של 50 מ"ל, כפי שמוצג בבקבוק. מערבולת במשך 5 שניות או עד שהתערובת הסופית מעורבבת היטב.

3. הכנת ציוד וחומרים

1. רססו את אזור העבודה והציוד, לדוגמה: ספסל המעבדה, אזור העבודה במכסה האדים הכימיים ומדפי צינורות המיקרו-צנטריפוגה, עם תמיסת פירוק ריבונוקלאז (RNase) (לדוגמה, תמיסת פירוק RNase הזמינה מסחרית). כדי למנוע זיהום, יש למרוח עם תמיסת הפירוק RNase על המשטחים בכל מקום ובכל זמן שיימצא לנכון.
2. יש לעטות מעיל מעבדה נקי, לעטות מסכת פנים וללבוש כפפות מעבדה מתאימות כדי להגן על הרנ"א בדגימות הצואה מפני נוקלאזות הנמצאות על עור האדם. יש לרסס כפפות עם תמיסת RNase deontamination ולהחליף כפפות לעתים קרובות כדי למנוע זיהום.
3. הכינו דלי קרח יבש לדגימות צואה המאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע הפשרה לפני ההפשרה מחדש של הצואה ודלי קרח לחומרים, לדוגמה: חומצה-פנול: כלורופורם, להארכת חיי המדף.
   הערה: ודא שהחומרים כולל המדיה המשמשת בפרוטוקול הם סטריליים ללא זיהום של נוקלאים.

4. החייאת צואה

1. יש לשלול 25-100 מ"ג של דגימות צואה ב-600 מיקרו-ליטר של תמיסת מלח סטרילית 1x Dulbecco (DPBS).
   אזהרה: דגימות צואה צריכות להיות מעובדות באופן מיידי כאשר הן מופשרות מ-80°C- ללא הפשרה חלקית אפילו כדי למזער את שחרורם של RNases ו-RNA תאי, שכן גבישי קרח קורעים תאים פנימיים וחיצוניים כאשר תאים בדגימה מפשירים.
   1. הוסף 600 μL של 1x DPBS לצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מכסה בורג המכיל דגימות צואה בטמפרטורת החדר (RT).
   2. דגירה של תערובת של דגימות צואה שקועה ב 600 μL של 1x DPBS בצינור microcentrifuge 2 מ"ל מכוסה במשך 30 דקות ב RT.
   3. השהה את התערובת על ידי מחית עם קצה פיפטה של 1 מ"ל ומערבולת היטב עם צינור microcentrifuge 2 מ"ל מכוסה. כדי לייעל ולהגדיל את הכמות והאיכות של RNA, להשעות את התערובת עם homogenizer עם ההגדרה עבור מחזור אחד ב S4000 (או 4000 סל"ד) ו 45 שניות.

5. מיצוי אורגני

אזהרה: השתמש במכסה האדים הכימי המסוכן לשלבים הבאים עד שלב 6 עם שימוש בחומצה-פנול: כלורופורם ואתנול בדרגה ACS 100% בשל רעילותם ודליקותם. שנה PPE לפי הצורך ופעל לפי אמצעי זהירות סטנדרטיים נאותים בעת טיפול בחומרים מסוכנים.

1. חלץ RNA עם 600 μL של חומצה-פנול: כלורופורם (נפח חומצה-פנול: כלורופורם נדרש שווה לנפח הראשוני של 1x DPBS נוסף בשלב 4.1).
   1. הוסף 600 μL של חומצה-פנול: כלורופורם לתרחיף משלב 4.1.
      הערה: למשוך חומצה-פנול: כלורופורם מהשלב התחתון בבקבוק כאשר השלב העליון מעורבב עם חיץ מימי. אם האינטרפאזה בין שני השלבים האלה מופרעת, אז לחכות ולסגת חומצה-פנול: כלורופורם רק כאשר interphase מחדש מבסס את עצמו כדי למנוע זיהום.
2. מערבבים את התערובת במשך 60 שניות כדי לערבב היטב. לחלופין, כדי לייעל ולהגדיל את כמות הרנ"א בתפוקה, ערבבו באמצעות הומוגנייזר עם ההגדרה למחזור אחד ב-S4000 וב-45 שניות.
3. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10,000 x גרם ב-RT כדי להפריד בין הפאזות המימיות והאורגניות באמצעות מיקרוצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, האינטרפאזה צריכה להיות קומפקטית. אם לא, חזור על הצנטריפוגה.
   הערה: אם האינטרפאזה לא יכולה להיות קומפקטית כפי הרצוי, אולי בגלל יחס לא אחיד של הנפח הראשוני לנפח של חומצה-פנול נוסף: כלורופורם לאחר מספר חזרות של צנטריפוגה, המשך לשחזר את השלב מימי בזהירות רבה יותר כדי למנוע זיהום.
4. לשחזר את הפאזה המימית ולהעביר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מ"ל עם מכסה ציר (לא מסופק על ידי ערכת בידוד miRNA).
   1. הסר את הפאזה המימית (או העליונה) בזהירות מבלי להפריע לפאזה התחתונה והעבר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בגודל 2 מ"ל עם מכסה ציר. שים לב לנפח שהועבר (לדוגמה, ~ 500 μL).
      הערה: כאשר האינטרפאזה קומפקטית והפאזה העליונה מופרדת בבירור, ייתכן שיש כמה חלקיקים שיוריים זעירים שצפים בחלק העליון של הפאזה המיימית. פיפטה בזהירות כדי להימנע משאריות אלה ולהתאושש רק בפאזה מימית מופרדת באופן גלוי וברור כדי להבטיח תפוקת RNA איכותית, גם אם ניתן להשיג רק נפח קטן של הפאזה המיימית.

6. בידוד RNA סופי

1. הוסף 1.25 נפחים של 100% אתנול בדרגה RT ACS לפאזה המימית בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל (לדוגמה, הוסף 625 μL של 100% אתנול אם 500 μL של פאזה מימית התאוששו משלב 5.4.). וורטקס 3 שניות.
2. טען את תערובת הפאזה/אתנול המימית דרך מחסנית המסנן המסופקת בערכת הבידוד miRNA.
   1. עבור כל דגימה, הנח את מחסנית המסנן באחת מצינורות האיסוף המסופקים על ידי הערכה.
      1. פיפטה וטעינה של 600 μL של תערובת פאזה/אתנול מימית לתוך מחסנית המסנן.
         הערה: מערבבים את התערובת לזמן קצר כדי לערבב היטב את האתנול עם פאזה מימית לפני הפיפטה. לא ניתן לטעון יותר מ-700 μL של תערובת פאזה/אתנול מימית בכל פעם.
   2. צנטריפוגה בגודל 10,000 x גרם למשך 90 שניות כדי לסנן את התערובת. סיבוב במהירות גבוהה יותר עלול לגרום נזק למסנן.
   3. השליכו את התסנין וחזרו על שלבים 6.2.1 עד 6.2.2 עד שכל התערובת תסונן דרך אותה קרום מסנן ביישומים עוקבים. יש לשמור ולעשות שימוש חוזר באותו צינור איסוף לשטיפה בשלבים הבאים.
   4. שטפו את המסנן עם 700 μL של miRNA Wash Solution 1.
      אזהרה: תמיסת רחצה miRNA 1 מכילה גואנידין תיוציאנט שעלול לגרום לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. ללבוש PPE הכרחי, למשל: כפפות, מגן פנים, מעיל מעבדה מגן. החלף כפפות לעתים קרובות לפי הצורך.
      1. החל 700 μL של miRNA Wash Solution 1, פתרון העבודה שהוכן עם אתנול 100% בדרגה ACS, לתוך מחסנית המסנן.
      2. צנטריפוגה למשך 60 שניות לסינון תמיסת הכביסה miRNA 1 דרך מחסנית המסנן.
      3. השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.
   5. שטפו את המסנן עם Wash Solution 2/3 פעם אחת כל אחד בנפחים של 700 μL, 500 μL ו-250 μL ברציפות.
      1. החל 700 μL של Wash Solution 2/3, פתרון העבודה שהוכן עם אתנול 100% בדרגה ACS, לתוך מחסנית המסנן.
         1. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.
         2. השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.
      2. יש למרוח 500 μL של תמיסת כביסה 2/3 לתוך מחסנית המסנן.
         1. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.
         2. השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.
      3. החל 250 μL של תמיסת כביסה 2/3 לתוך מחסנית המסנן.
         1. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.
         2. השליכו את התסנין מצינור האיסוף.
      4. העבירו את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש וסובבו את המכלול למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות נוזל מהמסנן.

7. רנ"א אלוטי עם 50 μL מים נטולי נוקלאז

1. העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש. פיפטה 50 μL של מים ללא נוקלאז למרכז המסנן ומכסה את צינור האיסוף.
   1. דגירה ב- RT במשך 10 דקות.
   2. סובבו במשך 5 דקות ב-8,000 x g כדי לשחזר RNA לתוך צינור האיסוף החדש.
   3. לקבוע את הריכוז והטוהר של RNA צואה משוחזר באמצעות פלואורומטר. RNA צואה משוחזר יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

תוצאות

רנ"א מייצגים בודדו מדגימות של 50 מ"ג צואת עכברים (2 כדורי צואה של עכברים) ו-100 מ"ג של דגימות צואה אנושית בהתאמה, ונלקחו במים נטולי נוקלאז של 50 μL. מניתוח ספקטרופוטומטר של הריכוז עולה כי כמות כוללת של 49 מיקרוגרם ו-16 מיקרוגרם RNA בודדו בהתאמה (טבלה 1). טוהר הרנ"א היה גבוה כפי שצוין על ידי יחס A2...

Discussion

חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNase כדי למנוע זיהום RNase במהלך הבידוד⁷. לאחר צנטריפוגה והיווצרות אינטרפאזה קומפקטית, חשוב להימנע מהאינטרפאזה, הפאזה התחתונה ומזיהום החלקיקים המרחף על החלק העליון של הפאזה המימית בעת שחזור הפאזה המיימית. בנוסף, מתווספים שני שלבי שטיפה עם 500 μL ו- 250 μL Wash S...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Vortex Shaker