JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במודל אקסיטוטוקסיות של C. elegans , פרוטוקול זה משתמש בהדמיה in vivo כדי לנתח את הוויסות של ניוון עצבי נמק, השפעת גנים המקודדים מתווכים מועמדים ומעורבות של מיטוכונדריה. דיסוציאציה ומיון תאים משמשים להשגת נוירונים בסיכון באופן ספציפי לניתוח טרנסקריפטומי ספציפי לתא של ניוון עצבי ומנגנוני הגנה עצבית.

Abstract

נמק אקסיטוטוקסי הוא צורה מובילה של ניוון עצבי. תהליך זה של נמק מווסת מופעל על ידי הצטברות סינפטית של המוליך העצבי גלוטמט, וגירוי מוגזם של הקולטנים הפוסט-סינפטיים שלו. עם זאת, חסר מידע על האירועים המולקולריים הבאים שמגיעים לשיאם במורפולוגיה המובהקת של נפיחות עצבית מסוג זה של ניוון עצבי. היבטים אחרים, כגון שינויים בתאים תת-תאיים ספציפיים, או הבסיס לפגיעות התאית הדיפרנציאלית של תת-סוגים עצביים מובחנים, נותרו לא נחקרים. יתר על כן, מגוון גורמים שנכנסים לתמונה במחקרים המשתמשים בתכשירים חוץ גופיים או ex vivo עשויים לשנות ולעוות את ההתקדמות הטבעית של צורה זו של ניוון עצבי. לכן חשוב לחקור נמק אקסיטוטוקסי בבעלי חיים על ידי ניטור ההשפעות של התערבויות המווסתות את היקף הנמק העצבי במערכת המודל השקופה והניתנת גנטית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקר נמק אקסיטוטוקסי בתאי עצב של C. elegans , בשילוב ניתוח אופטי, גנטי ומולקולרי. כדי לגרום לתנאים אקסיטוטוקסיים ב - C. elegans, נוקאאוט של גן טרנספורטר גלוטמט (glt-3) משולב עם רקע גנטי רגיש עצבי (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) כדי לייצר גירוי יתר של קולטן גלוטמט וניוון עצבי. ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות של נומרסקי (DIC), מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקונפוקלית בבעלי חיים הן שיטות המשמשות לכימות ניוון עצבי, מעקב אחר לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המסומנים פלואורסצנטית, וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בנוירונים המנוונים. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי עצבי (FACS) משמש למיון מובהק של נוירונים בסיכון לניתוח טרנסקריפטומי ספציפי לסוג התא של ניוון עצבי. שילוב של הדמיה חיה ושיטות FACS כמו גם היתרונות של אורגניזם מודל C. elegans מאפשרים לחוקרים למנף מערכת זו כדי להשיג נתונים הניתנים לשחזור עם גודל מדגם גדול. תובנות ממבחנים אלה יכולות להיות מתורגמות למטרות חדשות להתערבות טיפולית במחלות ניווניות.

Introduction

אקסיטוטוקסיות היא הגורם המוביל למוות עצבי באיסכמיה מוחית וגורם תורם למחלות נוירודגנרטיביות מרובות 1,2,3,4,5,6,7,8,9. הפרעה בזרימת הדם המחומצן למוח (למשל, עקב קריש דם) גורמת לתפקוד לקוי של מובילי גלוטמט, מה שמוביל להצטברות גלוטמט בסינפסה. עודף זה של גלוטמט מפעיל יתר על המידה קולטני גלוטמט פוסט-סינפטיים (GluRs) מה שמוביל לזרימה מוגזמת (קטליטית, לא סטוכיומטרית) של Ca2+ לתאי עצב (איור 1A). זרם מזיק זה מוביל לניוון עצבי פוסט-סינפטי מתקדם שנע מבחינה מורפולוגית ומכניסטית מאפופטוזיס לנמק מווסת 10,11,12. למרות שהם התבססו על התערבויות מוצלחות במודלים של בעלי חיים, ניסויים קליניים מרובים של אנטגוניסטים של GluR שביקשו לחסום את כניסת Ca2+ ולקדם את כדאיות התאים נכשלו בסביבה הקלינית 13,14,15,16. תורם קריטי ככל הנראה לכישלונות אלה הוא העובדה (בניגוד למודלים של בעלי חיים) הטיפול בסביבה הקלינית ניתן שעות לאחר הופעת השבץ, מה שגורם להתערבות לחסום מנגנוני הגנה עצביים מאוחרים, תוך כישלון בהפרעה לאיתות ניווני במורד הזרם של GluRs 14,16,17. גישה חלופית, המבוססת על טרומבוליזה, יכולה להינתן רק בחלון זמן מוגבל מאוד, מה שמשאיר חולים רבים (הסובלים משבץ מוחי בבית עם זמן התחלה לא מזוהה) ללא יכולת להפיק ממנו תועלת17. מכשולים אלה מדגישים את הצורך למקד את מחקר האקסיטוטוקסיות בחקר אירועים המתרחשים לאחר גירוי יתר של GluR ולהבדיל בין מפלים ניווניים עוקבים לבין תהליכים נוירו-פרוטקטיביים בו-זמניים. גישה זו יכולה לסייע במניעת נזק לתאים ולזהות מטרות תרופתיות יעילות שניתן לתת מאוחר יותר לאחר הופעת הנזק.

גישה אחת לזיהוי אירועים עוקבים באקסיטוטוקסיות היא לחקור את מנגנוני איתות המוות התאי במורד הזרם של גירוי יתר של GluR, כגון אלה המובילים לקריסת המיטוכונדריה. תקלה דרסטית בפיזיולוגיה והדינמיקה המיטוכונדריאלית היא סימן היכר של ניוון עצבי, כפי שניתן לראות באקסיטוטוקסיות 18,19,20. בעוד שכל התאים תלויים בתפקוד המיטוכונדריה ובזמינות להישרדות, פעילות ותחזוקה תאית, נוירונים תלויים במיוחד בייצור אנרגיה מיטוכונדריאלית כדי לתמוך בהעברת אותות והתפשטותם. באופן ספציפי, נוירונים מוציאים ~50% מצריכת האנרגיה הקשורה לאיתות שלהם כדי לשחזר את פוטנציאל הממברנה במנוחה לאחר הפעלת קולטנים/תעלות פוסט-סינפטיות21, עם תלות גבוהה בחמצן וגלוקוז. הזמינות המופחתת של גלוקוז וחמצן שנצפתה בשבץ מוחי מובילה לשינויים מיטוכונדריאלים חמורים, מה שגורם להפחתה נוספת בייצור ה-ATP 19,22,23,24. עם זאת, מחקרים לזיהוי רצף האירועים שהובילו לקריסת המיטוכונדריה הניבו תוצאות שנויות במחלוקת וחסרות קונצנזוס. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית יכול לעזור להבין את האירועים הללו המובילים לפתולוגיה מיטוכונדריאלית מכיוון שהוא אינדיקטור טוב לבריאות העצבים 25,26,27,28,29. מיטוכונדריה חוטית מייצגת תא עצב בריא, בעוד שמיטוכונדריה מקוטעת מגלה נזק עצבי משמעותי שעלול להוביל למוות של תאים. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בבעלי חיים חיים בתנאים גנטיים שונים יכול לעזור להתמקד בגנים ובמסלולים ספציפיים המעורבים בניוון עצבי תלוי מיטוכונדריה באקסיטוטוקסיות.

גישה נוספת לזיהוי אירועים עוקבים שעשויים לווסת את היקף הניוון העצבי האקסיטוטוקסי היא לחקור את מנגנוני ההגנה הנוירו-פרוטקטיביים של השעתוק המפחיתים חלק מההשפעות של אקסיטוטוקסיות14,16. עם זאת, היעדר הספציפיות של גורמי שעתוק נוירו-פרוטקטיביים מרכזיים והסטייה של מערכי הניסוי מעכבים את הצלחת המאמצים לזהות בבירור תוכניות ליבה נוירו-פרוטקטיביות (במיוחד בנמק מוסדר).

לכן, הן חקר מסלולי איתות מוות במורד הזרם והן חקר הגנה עצבית שעתוק באקסיטוטוקסיות נתקלו בקשיים גדולים וחילוקי דעות על התוצאות שנצפו. סביר להניח שחלק גדול מהמחלוקת הזו נובע מהשימוש במודלים ex vivo או in vitro של אקסיטוטוקסיות, והשונות המוצגת על ידי הספציפיות של מערכי ניסוי שונים. לכן כדאי מאוד להתמקד בזיהוי מנגנוני ליבה שנשמרו מאוד, ולחקור אותם in vivo. מערכת המודל הפשוטה של הנמטודה C. elegans מציעה אפשרות יעילה במיוחד, בשל השילוב העוצמתי של כלי מחקר חזקים ומגוונים במיוחד, שימור מסלולי הליבה של מוות תאי והמידע העשיר על המבנה והקישוריות של מערכת העצבים שלה 30,31,32,33. ואכן, העבודה המכוננת של מעבדת דריסקול על הניתוח הגנטי של ניוון עצבי נמק בנוירונים מכניים-חושיים היא הדגמה מצוינת לכוחה של גישה זו34. חשוב לניתוח אקסיטוטוקסיות, שימור מסלולי האיתות בנמטודה כולל את כל המרכיבים העיקריים של העברה עצבית גלוטמטרגית35,36.

מודל האקסיטוטוקסיות של הנמטודות מתבסס על מחקרים מכוננים אלה, ומאפשר לחוקר לחקור תהליכים ביוכימיים הדומים לאלה המתרחשים בשבץ מוחי ומחלות ניווניות אחרות המושפעות מרעילות עצבית תלויה בגלוטמט. כדי לגרום לתנאים אקסיטוטוקסיים ב- C. elegans גישה ניסויית זו משתמשת בזן אקסיטוטוקסיות שהוא שילוב של נוקאאוט של גן טרנספורטר גלוטמט (glt-3) ורקע גנטי רגיש עצבי (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) כדי לייצר גירוי יתר של GluR וניוון עצבי37. זן אקסיטוטוקסיות זה חושף 30 נוירונים ספציפיים (מבטאים glr-1) שהם קשרים פוסט-סינפטיים לגלוטמטרגיים לניוון עצבי אקסיטוטוקסי. מבין 30 הנוירונים הללו בסיכון, נוירונים בודדים עוברים נמק ככל שהחיה מתקדמת בהתפתחות (עם סטוכסטיות מעורבת והעדפה חלקית לנוירונים ספציפיים מסוימים38), ובמקביל גם גוויות תאים מוסרות בהדרגה. בשילוב עם הנגישות של זנים מוטנטיים רבים, גישה זו מאפשרת לחקור מסלולים מרובים המשפיעים על ניוון עצבי והגנה עצבית. גישות אלה כבר שימשו לניתוח חלק ממפלי איתות המוות במורד הזרם39 ומווסתי שעתוק של ניוון עצבי אקסיטוטוקסי באקסיטוטוקסיות38,40. כמו מקרים אחרים של ניוון עצבי נמק בתולעת41, הניוון העצבי האקסיטוטוקסי של הנמטודה אינו כרוך באפופטוזיס קלאסי40.

מאמר שיטות זה מתאר את המערכת הבסיסית לגרימה, כימות ומניפולציה של ניוון עצבי נמק אקסיטוטוקסי ב - C. elegans. יתר על כן, הוא מתאר שני פרוטוקולים עיקריים הנמצאים כיום בשימוש לייעול מחקרים של היבטים ספציפיים של אקסיטוטוקסיות נמטודות. על ידי שימוש במדווחים פלואורסצנטיים והדמיה חיה in vivo, החוקר יכול לחקור מעורבות ודינמיקה מיטוכונדריאלית במודל הנמטודה של ניוון עצבי אקסיטוטוקסי. כדי לקבוע את ההשפעה של גורמי שעתוק נוירו-פרוטקטיביים ספציפיים, החוקר יכול להשתמש בביטוי ספציפי לסוג התא של סמנים פלואורסצנטיים, דיסוציאציה של בעלי חיים לתאים בודדים ו-FACS כדי לבודד נוירונים ספציפיים הנמצאים בסיכון לנמק מאקסיטוטוקסיות. לאחר מכן ניתן להשתמש בנוירונים מבודדים ספציפיים מסוג תאים אלה לריצוף RNA בזנים המכילים מוטציות בגורמי שעתוק מרכזיים. יחד, שיטות אלה יכולות לאפשר לחוקרים לבחון את היסודות המולקולריים של ניוון עצבי אקסיטוטוקסי והגנה עצבית in vivo בבהירות ובדיוק רב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. זנים המשמשים לחקירת ניוון עצבי אקסיטוטוקסי והגנה עצבית

  1. השתמש בזן האקסיטוטוקסיות של הנמטודות ZB1102 כנקודת ייחוס לניוון עצבי אקסיטוטוקסי סטנדרטי.
    הערה: אקסיטוטוקסיות תלויה בגלוטמט ב - C. elegans מיוצרת בזן ZB1102 על ידי שילוב נוקאאוט (ko) של טרנספורטר גלוטמט עם טרנסגן הרגיש לנוירונים בבעלי חיים אלה לרעילות עצבית ומתבטא בתת-קבוצה של נוירונים קשרים פוסט-סינפטיים לגלוטמטרגיים37. שילוב גנטי זה מכונה זן אקסיטוטוקסיות של נמטודות, והוא זמין באופן חופשי מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC).
  2. כדי לחקור את ההשפעה של גנים המקודדים מווסתים מועמדים לנמק אקסיטוטוקסי, שלבו מוטציה בגנים כאלה (למשל, dapk-1, או crh-1) עם זן האקסיטוטוקסיות של הנמטודה.
  3. לבצע הכלאות גנטיות על פי שיטות סטנדרטיות של C. elegans 30, כמתואר wormbook.org42,43.
  4. מכיוון שהבסיס המולקולרי של המוטציה מתועד בדרך כלל, עקוב אחר הצאצאים הצולבים על ידי גנוטיפ של הלוקוס הספציפי באמצעות PCR. הבדיל בין WT לעומת מוטציה לפי גודל השבר (עבור מחיקות) או רצף (עבור מוטציות נקודתיות).
    הערה: טבלה 1 מתארת זנים ששימשו לחקר מסלולים שונים של ניוון עצבי והגנה עצבית, במיוחד עבור פרוטוקול זה.
  5. גזור את כל הזנים הקריטיים על ידי שני קווים בלתי תלויים ובדוק אותם בנפרד כדי לאשר את תקפות הפנוטיפ הנצפה.

2. אמצעי גידול וגידול בעלי חיים

  1. גדל תולעים בטמפרטורה של 16-25 מעלות צלזיוס על לוחות NGM סטנדרטיים 30,37,42 או צלחות MYOB 38,44 זרעים עם OP50 E.coli לפי שיטות סטנדרטיות.
    הערה: צלחות MYOB נותנות תוצאות זהות ללוחות NGM אך מעט קלות יותר להכנה.
  2. שמור על זני הניסוי מוזנים היטב באופן עקבי.
    הערה: רעב יכול להשפיע על ניוון עצבי ולהפחית את מספר נוירוני הראש הגוססים. אם תולעים ניזונות בצורה גרועה או מורעבות, הניחו אותן על צלחות טריות והמתינו כמה דורות לפני שתמשיכו בניסויים. ההשפעה הטרנס-דורית של הרעבה תדעך לאחר כמה דורות.

3. כימות נוירוני ראש מנוונים על ידי ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) של נומרסקי וניקוד

  1. השתמש בזן האקסיטוטוקסיות של הנמטודות (ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V) כבקרה הניסיונית לכמות, המייצגת רמות אקסיטוטוקסיות נורמליות. הפרוטוקול אינו עוקב אחר אותה חיה בשלבי התפתחות שונים. במקום זאת, הוא נותן תמונת מצב של אוכלוסייה מעורבת של בעלי חיים, כך שבסך הכל אוספים מידע מבעלי חיים שונים כדי לייצג את כל שלבי ההתפתחות.
    הערה: הטרנסגן nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]45 (המבטא Gαs ו-GFP מופעלים בתאי עצב פוסט-סינפטיים לקשרים גלוטמטרגיים) מייצר רמת ניוון עצבי נמקית בלתי תלויה ב-GluR ברקע של ~1 נוירון/בעל חיים גוסס (בכל זמן נתון במהלך ההתפתחות). התוספת של glt-3 (ko) מגבירה את הניוון העצבי הנמק של תאי העצב המבטאים nuIs5 הפוסט-סינפטיים באופן תלוי ב-GluR, ועולה ל-4-5 נוירוני ראש גוססים/חיה בשלב הזחל השלישי (L3)37.
  2. עבור זני הבדיקה, השתמשו בבעלי חיים מצלב גנטי שהושלם לאחרונה, או הפשירו זנים מעניינים מ-80 מעלות צלזיוס שהוכנו מצלבים טריים. המתן כמה דורות (≥4) לפני שתקבל פנוטיפ וניוון עצבי.
  3. חותכים ומסירים חתיכה קטנה של אגר מצלחת של אוכלוסייה מעורבת של בעלי חיים שניזונו היטב, ומרכיבים אותה על כיסוי על ידי הפיכת גוש האגר, כך שהחיות שזחלו על פני האגר פונות כעת לכיסוי.
    הערה: בעלי חיים עדיין יכולים לנוע, אך כעת הם מרוסנים במידה מסוימת וניתן לצפות בהם ללא הרדמה. ניתן להשתמש בנתח כזה למשך ~ שעה לפני החלפתו בטרי.
  4. באמצעות טווח DIC הפוך עם עין x10 ומטרה x40 או x63, סרוק בעלי חיים באופן אקראי על ידי החלקת הכיסוי באופן ידני. בעוד ששלבי הדמיה אחרים המתוארים להלן יכולים להתבצע במיקרוסקופים הפוכים או זקופים, בדיקת תולעים בגוש האגר דורשת היקף הפוך.
  5. זהה את השלב ההתפתחותי של כל בעל חיים לפי צורת הרחם שלו (עיין בדיאגרמות הרחם wormbook.org).
  6. עבור כל בעל חיים, רשום את שלב ההתפתחות שלו ואת מספר הנוירונים הגוססים (כלומר, שואבים). ספרו ורשמו את המספר הכולל של נוירונים גוססים בראש, את מספר הנוירונים הגוססים בגנגליון הרטרו-שלפוחית (מה שנותן זיהוי קל של תאים ספציפיים), ואת מספר הנוירונים הגוססים בזנב (שאינו מושפע מגלוטמט ומשמש כבקרה פנימית, המאשרת כי הטרנסגן הרגיש nuIs5 פעיל במלואו).
  7. רשום נתונים אלה בטבלה שבה בעלי חיים מזן נתון מקובצים לפי קטגוריות של שלב התפתחותי.
  8. בכל מפגש, לאסוף נתונים באופן אקראי מתולעים במספר שלבי התפתחות; בצע מספר מפגשי ניקוד על פני מספר ימים כדי לאסוף מספיק נתונים לניתוח סטטיסטי. רשמו רמות ניוון עצבי בשלבים מרובים ובנו גרף עמודות בדומה לאיור 1C.
    הערה: שיטה זו תאפשר לקבוע אם טיפול או מוטציה מסוימת מעלים/מורידים את רמות הניוון העצבי בכל השלבים (הזזת ההתפלגות למעלה/מטה) או מעבירים את שיא הניוון העצבי לשלב התפתחותי מוקדם או מאוחר יותר (הזזת ההתפלגות שמאלה/ימינה).
  9. לבצע איסוף נתונים תוך עיוורון לזהות הגנוטיפ. לאשר בשני מבודדים עצמאיים של הקו הגנטי (כדי למזער את הסכנה של השפעות לא מכוונות של הבדלים גנטיים אחרים/בלתי צפויים בין מבודדים), ולאגד נתונים לניתוח.
  10. בכל זן, חישבו את הממוצע ואת ה-SEM של מספר תאי העצב המנוונים בראש (כולל הגנגליון הרטרו-שלפוחית) בכל שלב התפתחותי (איור 1D). בצע ניתוח דומה של גנגליון רטרו-שלפוחית גוסס בלבד ונוירוני זנב, לפי הצורך.

4. זיהוי נוירוני ראש מנוונים ספציפיים

  1. הרכיבו בעלי חיים בודדים (או קבוצות קטנות של) על כרית אגר46, ושיתקו את התולעת בטטרמיסול (ראה להלן, סעיף 5).
  2. עם פלואורסצנטיות משולבת והיקף DIC (זקוף או הפוך) אתר נוירונים ואקוולטים ספציפיים.
  3. קבע את זהות הנוירון הספציפית של תא העצב המוואקם על ידי מעקב אחר התהליכים המסומנים ב-GFP שלו והשוואת מיקום גוף התא וצורת התהליכים לאלו של הנוירונים הידועים כמבטאים glr-1 באמצעות WormAtlas47.
    הערה: לחלופין, ניתן לסייע בזיהוי על ידי שיטות חדשות לזיהוי מהיר של נוירונים על ידי תיוג רב-צבעוני שיגיעו בקרוב ממעבדת הוברט48.

5. הדמיה חיה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית עצבית על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זני מדווח

  1. להדמיה של שינויים מיטוכונדריאלים בנוירונים פוסט-סינפטיים מנוונים (המסומנים ב-GFP ציטופלזמי בזן האקסיטוטוקסיות המקורי) בדוק את הקרינה של מיטו-מ-צ'רי.
  2. חצו את זן האקסיטוטוקסיות של הבדיקה עם זנים המסמנים מיטוכונדריה של נוירונים פוסט-סינפטיים עם פלואורסצנטיות אדומה (על ידי ביטוי היתוך בין החלבון הפלואורסצנטי לבין מסוף ה-N של TOM-20 תחת מקדם glr-1 ; לפרטים על מבנים וזנים, ראה49). כיום ניתן לדמות בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רגיל (זקוף או הפוך) או מיקרוסקופ קונפוקלי.
  3. כדי לשתק את התולעת מבלי להשפיע על ההישרדות העצבית, פיפטה 5 מיקרוליטר של 10 מ"מ טטרמיסול על כרית אגרוז טרייה. ראה Arnold et al.46 לפרוטוקול מפורט על הכנת רפידות.
  4. הנח בעלי חיים על מרכז טיפת הטטרמיסול והרכיב בעזרת כיסוי.
  5. אטמו את דפנות הכיסויהחלקה עם לק והניחו ללק להתייבש.
  6. תוך 20 דקות מטיפול בטטרמיסול ושימוש בסקופ עם DIC והדמיה פלואורסצנטית, אתר תולעים באמצעות עדשת אובייקטיבית פי 20.
  7. ברגע שראש התולעת נמצא (או נוירונים מעניינים) עברו לאובייקט שמן פי 100 והתמקדו בתיוג הקרינה של המיטוכונדריה בסומה.
  8. צלם תמונות Z-stack באמצעות הגדרות המסנן DIC, GFP ו-TxRed.

6. ניקוד וכימות מורפולוגיה של מיטוכונדריה עצבית

  1. לנתח את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית במהלך הדמיה חיה של התולעת או לאחר רכישת תמונה באמצעות ImageJ או תוכנת הדמיה אחרת.
  2. לזיהוי קל וניתוח חוזר של נוירונים ספציפיים, זהה את שלושת הנוירונים בגנגליון הרטרו-שלפוחית, RIGL/R ו-AVG (במקרים מסוימים רק שניים קיימים עקב פינוי גוויות תאים באקסיטוטוקסיות).
  3. סווג את המיטוכונדריה לשלוש קבוצות עיקריות: חוטים, ביניים ומקוטעים 50,51,52.
    הערה: מיטוכונדריה חוטית מופיעים כמבנים דקים רציפים בסומה של נוירונים, בדרך כלל מקיפים את הגרעין. מיטוכונדריות ביניים מופיעות כשילוב של לפחות רשת חוטית אחת לכאורה, אם כי עם שברים, ופיצול מסוים בסומה. מיטוכונדריה מקוטעת מציגה שברים שלמים ברשת המיטוכונדריה, יש להם מראה נפוח והם מפוזרים ברחבי הסומה (איור 2A).
  4. עבור כל תולעת, ציין את אחוז הנוירונים עם מיטוכונדריה חוטית, בינונית או מקוטעת בסך הכל 30 תולעים לפחות.
  5. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו בדיקת טוקי פוסט הוק עבור כל מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בין זנים53.

7. הכנת בופר וריאגנט לדיסוציאציה של תולעים עבור FACS של נוירונים בסיכון לניוון עצבי

  1. הכן את מאגר M9 באופן הבא: 3 גרם של KH2PO4, 6 גרם של Na2HPO4, 5 גרם NaCl, H2O עד 1 L. עיקור על ידי חיטוי. הוסף 1 מ"ל של 1 MMgSO 4 מעוקר בפילטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  2. הכן מאגר ביצים באופן הבא: 118 מ"מ NaCl, 48 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl2, 2 מ"מ MgCl2 ; חיטוי לעיקור. הוסף 2 M של תמיסת מלאי HEPES pH 7.3 (שסוננה בעבר עם מסנן עליון של בקבוק 0.2 מיקרומטר) לריכוז סופי של 25 מ"מ. התאם את ה-pH ל-7.3 עם 1 N NaOH (לא יותר מ-10 מ"ל). השתמש באוסמומטר כדי להבטיח שהאוסמולריות הסופית היא בין 335 -345 mOsm. מסננים את מאגר הביצים לעקר עם מסננים עליונים של בקבוק 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: המלחים מתמוססים בקלות רבה יותר בעת שימוש ב-MgCl2 ·6H2O ו-CaCl2·2H2O כדי ליצור פתרונות מלאי MgCl2 ו-CaCl2 בהתאמה. אתה יכול גם להכין מלאי של מאגר ביצים פי 10 ולדלל אותו בעת הצורך במים סטריליים נטולי יונים.
  3. הכן SDS-DTT באופן הבא: 20 מ"מ HEPES pH 8.0, 0.25% SDS, 200 מ"מ DTT, 3% סוכרוז. במכסה המנוע של תרבית רקמות, יש לעקר SDS-DTT עם מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. אחסן 300 מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
  4. הכן תמיסת פרונאז באופן הבא: הכן את יום הדיסוציאציה 15 מ"ג/מ"ל פרונאז במאגר ביצים. יש לאחסן על קרח.

8. סנכרון גיל עבור FACS ספציפי לנוירונים

  1. השתמש בבעלי חיים המשלבים את גנוטיפ האקסיטוטוקסיות (ומוטציות אחרות, לפי הצורך) עם ביטוי טרנסגני של סמן פלואורסצנטי חזק שניתן להשתמש בו בקלות למיון (למשל, FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54. גדל בעלי חיים על שתיים או שלוש צלחות NGM/MYOB בגודל 100 מ"מ בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהצלחת מלאה בתולעים בעיקר גרבידיות.
  2. שטפו תולעים מהצלחות באמצעות מאגר M9. מעבירים תולעים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית של 10 מ"ל.
  3. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 2.5 דקות ב-250x גרם והסר את הסופרנטנט.
  4. השעו מחדש את כדור התולעת ב-10 מ"ל של תמיסת אקונומיקה (2% 10 N NaOH ו-5% אקונומיקה ביתית טרייה במים סטריליים נטולי יונים).
  5. הניחו צינורות על שייקר אופקית, סלעו במהירות נמוכה. ודא שהתולעים לא ישקעו בתחתית הצינור. האקונומיקה פותחת את הקוטיקולה של התולעת אך אינה משפיעה על העוברים, המוגנים על ידי קליפת הביצה.
    1. שלב הלבנה זה אורך כ -5 דקות, אך זה משתנה. כדי להבטיח שלא תתרחש הלבנת יתר, עקוב אחר התהליך על ידי אחזור דגימה כל דקה: פיפטה בעדינות 10 מיקרוליטר מכל צינור על שקופית מיקרוסקופ זכוכית ובדוק את התולעים באמצעות מיקרוסקופ מנתח.
  6. לאחר שרוב תולעי הגרביד נסדקות אך לא מומסות לחלוטין, עצור את שלב ההלבנה על ידי מילוי הצינורות החרוטיים במאגר ביצים.
  7. כדי לאחזר את הביציות/עוברים, צנטריפוגה את הצינורות ב-250x גרם למשך 2.5 דקות, הסר את הסופרנטנט ושטוף שוב עם מאגר ביצים.
  8. חזור על ארבע כביסות נוספות.
  9. השעו מחדש את הביצים על ידי פיפטינג עדין של הכדור ומרחו על ארבע צלחות NGM/MYOB עם זרעים של 100 מ"מ. תנו לעוברים לבקוע ולגדול בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
    הערה: הצלחות צריכות להיות מלאות כעת בתולעים בעיקר גרבידיות.
  10. חזור על סנכרון הגיל על ידי חזרה על פרוטוקול סנכרון אקונומיקה/גיל זה.
  11. שפכו את הביצים על שמונה צלחות 100 מ"מ NGM/MYOB. תנו לבעל החיים לבקוע ולגדול בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשלב הזחל הרצוי.

9. דיסוציאציה של תאי תולעת שלמים עבור FACS

  1. לגדל תולעים מסונכרנות לשלב ההתפתחותי הרצוי. שטפו בעדינות צלחות 100 מ"מ עם חיץ M9 ופיפטות סרולוגיות מזכוכית והעבירו לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
  2. הוסף M9 קר עד 45 מ"ל. הניחו את הצינורות על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר לתולעים להתיישב בתחתית על ידי כוח הכבידה, בעוד שכל שאריות של פסולת חיידקים מהצלחות יצופו בסופרנטנט.
  3. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התולעים עם M9 טרי.
  4. חזור על כוח הכבידה של 30 דקות כשהוא מתיישב על קרח.
  5. הסר את הסופרנטנט, הוסף M9 עד 45 מ"ל וצנטריפוגה ב -250 x גרם למשך 5 דקות.
  6. העבירו את הגלולה לצינור מיקרו-צנטריפוגה והוסיפו M9 עד 1 מ"ל.
  7. סובב במהירות של 14,000 סל"ד על צנטריפוגה על השולחן למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט.
  8. כדי לשבש את הציפורן, יש להשעות מחדש את כדור התולעת עם SDS-DTT באמצעות (בערך) פי שניים מנפח הגלולה, ולדגור עם נדנוד בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות עבור שלבי L2-בוגרים.
    הערה: אין לחרוג מ-4 דקות דגירה ב-SDS-DTT מכיוון שאות החלבון הפלואורסצנטי יקטן באופן דרסטי עם טיפול ארוך יותר ב-SDS-DTT. מכיוון שה-SDS-DTT רגיש לאור, הוא לא אמור להיות בן יותר מ-3 חודשים מכיוון שהתמיסה עלולה לאבד את עוצמתה עם הזמן; דיסוציאציות פועלות בצורה הטובה ביותר עם פתרון SDS-DTT שהוכן לאחרונה.
  9. הוסף 1x מאגר ביצים (pH 7.3, 335-345 mOsm) עד 1 מ"ל כדי להפסיק את הטיפול ב-SDS-DTT.
  10. סובב במהירות של 14,000 סל"ד על צנטריפוגה על השולחן למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט.
  11. כדי לשבש עוד יותר את הקוטיקולה ולנתק את תאי החיות, השהה מחדש את הגלולה עם תמיסת פרונאז בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בנפח משולש של הגלולה.
  12. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
  13. פיפטה למעלה ולמטה 40 פעמים כל 5 דקות עם פיפטה P-200 או P-1000, נוגעת בתחתית הצינור עם קצה הפיפטה.
    הערה: הלחץ שנוצר על ידי הקצה הנוגע בתחתית הצינור מקל על דיסוציאציה של תולעת. השתמש בקצה מסנן כדי שהתולעים לא ייכנסו בטעות לפיר הפיפטה במהלך פיפטינג מהיר.
  14. לאחר 15 דקות, בדוק את התקדמות דיסוציאציה של התולעת על ידי פיפטינג עדין של 5 מיקרוליטר על שקופית זכוכית והתבוננות בהתקדמות תחת מיקרוסקופ מנתח. כאשר רוב (~90%) התולעים השלמות התפוצצו, התהליך הושלם.
    הערה: ניתן להאריך את הדגירה של הפרונאז אם תולעים רבות נשארות שלמות.
  15. במכסה המנוע של תרבית תאים, הוסף 1x מאגר ביצים עד 1.5 מ"ל כדי להפסיק את הטיפול בפרונאז.
  16. מעבירים לצינורות FACS, מוסיפים מאגר ביצים של 5 מ"ל ומסובבים בחום של 800 x גרם למשך 5 דקות.
  17. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש במאגר ביצים של 3 מ"ל pf.
  18. הנח מכסה מסננת תאים של 70 מיקרומטר על צינורות FACS חדשים, מתלה תאי פיפטה על מסננת וסובב ב-800 x גרם למשך דקה אחת. אסוף את תרחיף תאי הפליטה.
  19. הנח מכסה מסננת תאים של 5 מיקרומטר על צינורות FACS חדשים, מתלה תאי פיפטה על המסננת וסובב בטמפרטורה של 800 x גרם למשך דקה אחת.
  20. הוסף DAPI לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל במאגר ביצים, הניח על קרח עם מכסה/כיסוי להגנה מפני אור.
  21. בצע FACS בהקדם האפשרי. אות החלבון הפלואורסצנטי פוחת עם הזמן והחשיפה לאור, לכן חשוב לבצע פרוטוקול דיסוציאציה במהירות האפשרית ולבצע FACS מיד לאחר השלמת הדיסוציאציה.
    הערה: פרוטוקול דיסוציאציה של תולעים הותאם מפרוטוקולים ממעבדת מילר 55,56,57, מעבדת מרפי58 ומעבדת שחם59.

10. שינויים בתפעול מכונת FACS לזיהוי נוירונים של C. elegans

  1. השתמש ב-4 ליטר של מאגר ביצים צונן (4 מעלות צלזיוס) במקום נוזל נדן רגיל בעת מיון נוירונים של C. elegans .
    הערה: האוסמולריות של תאי C. elegans גבוהה בהרבה מתאי יונקים ונוזל נדן סטנדרטי יפוצץ את הנוירונים. כל הגדרות המכונה והכיולים נעשים לאחר הוספת מאגר הביצים, מכיוון שהצמיגות של מאגר הביצים שונה מזו של נוזל נדן רגיל. טכנאי המיון יעביר את חרוזי האבחון דרך המכונה כדי לוודא שהלייזרים פועלים כראוי.
  2. כאשר יש להשתמש בנוירונים ממוינים במחקרי טרנסקריפטומיקה עוקבים, מיין מינימום של 100,000 תאי GFP+ ישירות ל-800 מיקרוליטר של Trizol-LS + 10 מיקרוליטר של מעכב RNase.
  3. הפוך תאים בטריזול 15 פעמים לערבוב.
  4. יש להקפיא באמבט קרח יבש/אתנול ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שמוכנים לחלץ RNA מכל הדגימות לניסוי ריצוף RNA אחד.
    הערה: בעוד שרוב התאים הממוינים נאספים ישירות לתוך טריזול לניתוח טרנסקריפטום, הקפד לאחזר דגימה קטנה של תאים ממוינים GFP+ (מכל זן) שנאספו למאגר ביציות, לאימות מיקרוסקופיה של יעילות המיון.

11. אסטרטגיית שער FACS

  1. לזיהוי אות חיובי GFP השתמש בלייזר 488 ננומטר עם מסנן 530/30 ומעבר ארוך 502 (LP).
  2. לזיהוי תאים חיוביים ושליליים של DAPI השתמש בלייזר 405 ננומטר עם מסנן 450/50.
  3. לזיהוי תאים פלואורסצנטיים אוטומטיים שעלולים להיחשב בטעות כתאים חיוביים ל-GFP השתמשו בלייזר 488 ננומטר עם מסנן 610/20 ו-595 LP (תקשורת אישית, סטנקה סמובה, מנהלת תפעול, מרכז המשאבים לציטומטריית זרימה, אוניברסיטת רוקפלר).
  4. בצע אסטרטגיית שער סטנדרטית והסר אירועים עם אזור פיזור צדדי גדול (SSC-A) ואזור פיזור קדמי קטן (FSC-A), שעשויים לייצג גושי תאים ופסולת.
  5. בודד סינגלים של פיזור הקדמה ולאחר מכן סינגלים של פיזור צדדי.
  6. בודד תאים עם אות GFP גבוה ואות אוטופלואורסצנטי נמוך.
    הערה: תאים גבוהים לאוטופלואורסצנציה ונמוכים יותר ב-GFP אינם תאים חיוביים ל-GFP אמיתיים.
  7. הסף לשער GFP+ נקבע על ידי השוואת תאי GFP (כלומר N2) לתאי GFP+55,56.
  8. הסר תאים מתים עם שער חי/מת, בהתבסס על החדירות הסלקטיבית של DAPI לתאים מתים: הסף לשער מת חי נקבע על ידי השוואת תאים לא מוכתמים לתאים מוכתמים DAPI.
    הערה: בעת מיון מספר דגימות, שטוף את הזרם בין הדגימות כדי להבטיח שאין זיהום צולב.

12. מיקרוסקופיה של נוירונים ממוינים כדי לאמת את היעילות של אסטרטגיית שער FACS

  1. צייר עיגול על שקופית מיקרוסקופ זכוכית עם עט דוחה נוזלים.
  2. פיפטה 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים ממוינים במאגר הביצים בתוך המעגל. הניחו כיסוי מעל הדגימה ואטמו עם לק סביב היקף החלקה של הכיסוי.
  3. לאחר שהלק התייבש, בדוק במיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף/הפוך שהתאים הממוינים הם אכן בעיקר תאי GFP +.
    הערה: בצע בדיקה זו לאחר כל הפעלת מיון כדי לאמת את אסטרטגיית השער של FACS57.

13. מיצוי RNA וכימות איכות RNA במערכת אלקטרופורזה אוטומטית לבקרת איכות

הערה: כל עבודת ה-RNA צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי למנוע זיהום ב-RNase (כולל הכנה קפדנית של ריאגנטים, חומרים מתכלים ושיטות עבודה מומלצות ל-RNase).

הערה: בצע את כל השלבים שבהם הדגימות מכילות פנול ו/או כלורופורם במכסה אדים.

  1. להפשיר בקבוקונים של תאים בטריזול בטמפרטורת החדר.
  2. בעזרת קצה פילטר P200 קצה פיפטה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להומוגניזציה של הדגימה.
  3. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. הוסף 0.2 מ"ל כלורופורם לכל 1 מ"ל של ריאגנט טריזול המשמש לליזה, ולאחר מכן מכסה היטב את הצינור.
  5. הופכים את הצינורות 15 פעמים, ודוגרים (בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס) למשך 2-3 דקות.
  6. צנטריפוגה של הדגימה למשך 15 דקות ב-12,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. התערובת נפרדת לפנול-כלורופורם אדום תחתון, אינטרפאזה ושלב מימי עליון חסר צבע.
  7. אסוף אך ורק את השלב המימי העליון המכיל את ה-RNA והעביר לצינור חדש של 1.5 מ"ל נקשר DNA/RNA.
    הערה: במקרים מסוימים, אם יחס התאים במאגר הביציות שנשר מממיין התאים לטריזול גדול מיחס דגימה של 1:3: טריזול-LS, תכולת המלח הגבוהה של מאגר הביצים עלולה לגרום להיפוך השכבות; אם זה קורה, הוסף עוד Trizol-LS וחזור על ההיפוך והצנטריפוגה. ניתן להימנע מכך גם אם תשים לב לעלייה בנפח הדגימה לאחר המיון; אם היחס של 1:3 לא נשמר, הוסף מספיק טריזול לפני תחילת מיצוי ה-RNA.
  8. כדי לטהר עוד יותר את ה-RNA השתמש בכימיה של עמודות מיצוי RNA.
  9. השתמש במערכת האלקטרופורזה האוטומטית של בקרת האיכות כדי למדוד את מספר שלמות ה-RNA (RIN) ולאשר RNA RIN של 8.0 ומעלה לקלט לניסויי ריצוף RNA הבאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מודל נמטודה של אקסיטוטוקסיות וזיהוי נוירונים מנוונים בוואקאולציה
הנתונים המוצגים כאן משוכפלים מפרסומים קודמים37,38. כדי לחקות ניוון עצבי המושרה על ידי אקסיטוטוקסי, נוקאאוט של גן טרנספורטר גלוטמט (glt-3) משו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעוד שהמחלוקות והכשלים הרווחים מצביעים על כך שאקסיטוטוקסיות מציגה תהליך קשה במיוחד לפענוח, ניתוח האקסיטוטוקסיות בנמטודה מציע אסטרטגיה אטרקטיבית במיוחד להאיר מסלולי מוות של תאי עצב שמורים בצורה קריטית זו של ניוון עצבי. החוקר יכול להסתמך על האוסף העשיר של כלי המחקר הזמי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי מעבדת מנו ומעבדת לי (הנוכחיים והעדכניים) על עזרתם ותמיכתם. אנו מודים לד"ר מוניקה דריסקול (אוניברסיטת ראטגרס) על החלוצה בניתוח ניוון עצבי נמק בנמטודות ומתן תמיכה מתמשכת; ד"ר כריס לי (CCNY) לתמיכה וייעוץ; ג'פרי ווקר (מתקן CCNY Flow Cytometry Core), ד"ר באו וונג (CCNY) וסטנקה סמובה (ליבת הפקולטה למיון אוניברסיטת רוקפלר) לתמיכה מעשית וייעוץ בנושא מיון תאים; ד"ר כריס רונגו (אוניברסיטת ראטגרס) עבור ריאגנטים; ד"ר דיוויד מילר (אוניברסיטת ונדרבילט), קולין מרפי (אוניברסיטת פרינסטון), שי שחם, מנחם כץ וקתרין ורנדס (שלושתם מאוניברסיטת רוקפלר) עבור פרוטוקולי דיסוציאציה של C. elegans.

מעבדת מנו קיבלה מימון מ-NIH NINDS (NS096687, NS098350, NS116028) ל-I.M., ובאמצעות שותפות NIH U54 CCNY-MSKCC (CA132378/CA137788).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

References

  1. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, 171-182 (1990).
  2. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. The Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  3. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  4. Fisher, M., Saver, J. L. Future directions of acute ischaemic stroke therapy. Lancet Neurology. 14 (7), 758-767 (2015).
  5. Chamorro, A., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurology. 15 (8), 869-881 (2016).
  6. Baron, J. C. Protecting the ischaemic penumbra as an adjunct to thrombectomy for acute stroke. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 325-337 (2018).
  7. GBD Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 18 (5), 459-480 (2019).
  8. Kaji, R. Global burden of neurological diseases highlights stroke. Nature Reviews Neurology. 15, 371-372 (2019).
  9. Chen, R. L., Balami, J. S., Esiri, M. M., Chen, L. K., Buchan, A. M. Ischemic stroke in the elderly: an overview of evidence. Nature Reviews Neurology. 6 (5), 256-265 (2010).
  10. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Research Reviews. 54 (1), 34-66 (2007).
  11. Galluzzi, L., Kepp, O., Krautwald, S., Kroemer, G., Linkermann, A. Molecular mechanisms of regulated necrosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 35, 24-32 (2014).
  12. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (2), 135-147 (2014).
  13. Davis, S. M., et al. Selfotel in Acute Ischemic Stroke : Possible Neurotoxic Effects of an NMDA Antagonist. Stroke. 31 (2), 347-354 (2000).
  14. Ikonomidou, C., Turski, L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury. Lancet Neurology. 1 (6), 383-386 (2002).
  15. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  16. Lai, T. W., Zhang, S., Wang, Y. T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology. 115 (157-188), (2014).
  17. Tymianski, M. Stroke in 2013: Disappointments and advances in acute stroke intervention. Nature Reviews Neurology. 10 (2), 66-68 (2014).
  18. Nicholls, D. G. Mitochondrial calcium function and dysfunction in the central nervous system. Biochimica et Biophysica Acta. 1787 (11), 1416-1424 (2009).
  19. Galluzzi, L., Blomgren, K., Kroemer, G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury. Nature Reviews Neuroscience. 10 (7), 481-494 (2009).
  20. Sharma, N., Pasala, M. S., Prakash, A. Mitochondrial DNA: Epigenetics and environment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 60 (8), 668-682 (2019).
  21. Howarth, C., Gleeson, P., Attwell, D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1222-1232 (2012).
  22. Sims, N. R., Muyderman, H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 80-91 (2010).
  23. Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mitochondrial Mechanisms of Neuronal Cell Death: Potential Therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 437-454 (2017).
  24. Verma, M., Wills, Z., Chu, C. T. Excitatory Dendritic Mitochondrial Calcium Toxicity: Implications for Parkinson's and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, 523(2018).
  25. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death & Differentiation. 10 (8), 870-880 (2003).
  26. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nature Review Neuroscience. 9 (7), 505-518 (2008).
  27. Cho, D. H., Nakamura, T., Lipton, S. A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (20), 3435-3447 (2010).
  28. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends in Cell Biology. 23 (2), 64-71 (2013).
  29. Picard, M., Shirihai, O. S., Gentil, B. J., Burelle, Y. Mitochondrial morphology transitions and functions: implications for retrograde signaling. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 304 (6), 393-406 (2013).
  30. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  31. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1(1986).
  32. Horvitz, H. R. Worms, Life, and Death (Nobel Lecture). Chembiochem. 4 (8), 697-711 (2003).
  33. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  34. Driscoll, M., Gerstbrein, B. Dying for a cause: invertebrate genetics takes on human neurodegeneration. Nature Reviews Genetics. 4 (3), 181-194 (2003).
  35. Brockie, P. J., Maricq, A. V. Ionotropic glutamate receptors: genetics, behavior and electrophysiology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  36. Mano, I., Straud, S., Driscoll, M. Caenorhabditis elegans Glutamate Transporters Influence Synaptic Function and Behavior at Sites Distant from the Synapse. Journal of Biological Chemistry. 282 (47), 34412-34419 (2007).
  37. Mano, I., Driscoll, M. C. elegans Glutamate Transporter Deletion Induces AMPA-Receptor/Adenylyl Cyclase 9-Dependent Excitotoxicity. J Neurochem Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1373-1384 (2009).
  38. Feldmann, K. G., et al. Non-Canonical Activation of CREB Mediates Neuroprotection in a C. elegans Model of Excitotoxic Necrosis. Journal of Neurochemistry. 148 (4), 531-549 (2019).
  39. Del Rosario, J. S., et al. Death Associated Protein Kinase (DAPK) -Mediated Neurodegenerative Mechanisms in Nematode Excitotoxicity. BMC Neuroscience. 16, 25(2015).
  40. Tehrani, N., Del Rosario, J., Dominguez, M., Kalb, R., Mano, I. The Insulin/IGF Signaling Regulators Cytohesin/GRP-1 and PIP5K/PPK-1 Modulate Susceptibility to Excitotoxicity in C. elegans. PLoS One. 9 (11), 113060(2014).
  41. Chung, S., Gumienny, T. L., Hengartner, M. O., Driscoll, M. A common set of engulfment genes mediates removal of both apoptotic and necrotic cell corpses in C. elegans. Nature Cell Biology. 2 (12), 931-937 (2000).
  42. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  43. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  44. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121 (8), 2525-2535 (1995).
  45. Berger, A. J., Hart, A. C., Kaplan, J. M. Galphas-induced neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 18 (8), 2871-2880 (1998).
  46. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiment. , e61368(2020).
  47. Altun, Z. F., Herndon, L. A., Crocker, C., Lints, R., Hall, D. H. WormAtlas. , Available from: www.wormatlas.org (2019).
  48. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A Neuronal Polychromatic Atlas of Landmarks for Whole-Brain Imaging in C. elegans. bioRxiv. , (2019).
  49. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).
  50. Regmi, S. G., Rolland, S. G., Conradt, B. Age-dependent changes in mitochondrial morphology and volume are not predictors of lifespan. Aging (Albany NY). 6 (2), 118-130 (2014).
  51. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1453-1466), (2015).
  52. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitani, A. Heat-Induced Calcium Leakage Causes Mitochondrial Damage in Caenorhabditis elegans Body-Wall Muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  53. Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  54. Moss, B. J., Park, L., Dahlberg, C. L., Juo, P. The CaM Kinase CMK-1 Mediates a Negative Feedback Mechanism Coupling the C. elegans Glutamate Receptor GLR-1 with Its Own Transcription. PLoS Genetics. 12 (7), 1006180(2016).
  55. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
  56. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC Genomics. 6, 42(2005).
  57. Spencer, W. C., et al. Isolation of Specific Neurons from C. elegans Larvae for Gene Expression Profiling. PLoS One. 9 (11), 112102(2014).
  58. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  59. Katz, M., et al. Glutamate spillover in C. elegans triggers repetitive behavior through presynaptic activation of MGL-2/mGluR5. Nature Communications. 10 (1), 1882(2019).
  60. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  61. Kaal, E. C., et al. Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1158-1165 (2000).
  62. Lewis, J. A., et al. Cholinergic receptor mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  63. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  64. Zhang, S., Kuhn, J. R. Cell isolation and culture. WormBook. , Available from: www.wormbook.org 1-39 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved