JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקה חדשנית של משפר-כתב ארעי המבוססת על rAAV. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לגרום לביטוי המונע על ידי משפר in vivo במוח העכבר.

Abstract

משפרים הם פלטפורמות קשירה למגוון רחב של גורמי שעתוק המניעים דפוסי ביטוי ספציפיים של גנים ספציפיים לרקמות ולתאים. אמצעים מרובים להערכת דנ"א שאינו מקודד ומצבי כרומטין שונים הוכחו כיעילים בניבוי נוכחותם של רצפי משפרים בגנום, אך אימות הפעילות של רצפים אלה ומציאת האיברים ושלבי ההתפתחות שבהם הם פעילים הוא תהליך עתיר עבודה. ההתקדמות האחרונה בווקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) אפשרה העברה נרחבת של טרנסגנים לרקמות עכבר, מה שאפשר בדיקות משפר in vivo מבלי להזדקק לבעל חיים מהונדס. פרוטוקול זה מראה כיצד מבנה כתב המבטא EGFP תחת שליטתו של מקדם מינימלי, שאינו מניע ביטוי משמעותי בפני עצמו, יכול לשמש כדי לחקור את דפוסי הפעילות של רצפי משפר מועמדים במוח העכבר. מבנה כתב ארוז AAV מועבר למוח העכבר ודוגר במשך 1-4 שבועות, ולאחר מכן החיה מוקרבה, וקטעי מוח נצפים תחת מיקרוסקופ. EGFP מופיע בתאים שבהם המשפר הנבדק מספיק כדי ליזום ביטוי גנים, תוך ציון המיקום והשלב ההתפתחותי שבו המשפר פעיל במוח. שיטות שיבוט סטנדרטיות, אריזות AAV בעלות נמוכה והרחבת הסרוטיפים והשיטות של AAV להעברת in vivo וקריאת הדמיה סטנדרטית הופכים גישה זו לגישה נגישה לחקר האופן שבו ביטוי גנים מווסת במוח.

Introduction

משפרים הם אלמנטים גנומיים של ויסות ציס-רגולטורי המשמשים כאתרי קשירה של גורמי שעתוק ויכולים להניע את הביטוי של גן מטרה באופן ספציפי מרחבית 1,2. הם פעילים באופן דיפרנציאלי בסוגי תאים, רקמות ושלבי התפתחות שונים ויכולים להיות מצעים של וריאציה גנומית הקשורה לסיכון למחלות 3,4. לפיכך, הצורך להבין את הדינמיקה של תפקוד המשפר הוא קריטי להתקדמות הן ביישומים תרגומיים והן ביישומים מדעיים בסיסיים בגנומיקה. בסיליקו תחזיות של פעילות משפר יכולות לשמש משאבים מצוינים ליצירת השערות לגבי יכולת שיפור 5,6. פעילות משפרת חזויה כזו יכולה לדרוש תיקוף וחקירה נוספים להבנה מלאה של הפעילות התפקודית. מבחני כתבים משפרים הוכיחו את עצמם כבעלי ערך למטרה זו במגוון מערכות, מתאים ועד בעלי חיים 7,8,9. לקראת הרחבת מחקרים אלה בהקשר גמיש וחסכוני של in vivo, פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיטות מבוססות in vivo AAV לבדיקת רצפי משפר פוטטיביים על יכולתם להניע את הביטוי של גן מדווח חוץ רחמי במוח העכבר שלאחר הלידה. למשפחה זו של שיטות יש תועלת בחקירת רצפי מועמדים בודדים או סינון ספרייה מקביל והיא רלוונטית למחקר בסיסי ותרגומי.

שיטה זו משלבת בפלסמיד יחיד רצף דנ"א מועמד לשיפור פוטטיבי עם גן מדווח (כאן EGFP), תחת שליטתו של מקדם מינימלי שאינו מניע ביטוי משמעותי. הפלסמיד נארז לתוך AAV רקומביננטי (rAAV) ומוזרק למודל של בעלי חיים. בעוד היישום כאן הוא על המוח, סרוטיפים שונים של rAAV מאפשרים זיהום על פני סוגי רקמות שונים, כך שניתן להרחיב גישה זו למערכות אחרות10. לאחר פרק זמן מסוים, ניתן לאסוף את המוח ולבדוק את הביטוי של הגן המדווח. ביטוי חזק, בהשוואה לבקרות, מצביע על כך שרצף המועמדים שנבדקו הצליח "לשפר" את ביטוי הגן (איור 1). עיצוב פשוט זה מציע גישה קלה וברורה לבדיקת רצף של פעילות משפרת in vivo במוח.

בנוסף לבדיקת יכולת השיפור של רצף, ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות לקביעת פעילות משפר מסוג תא. בגישות מבוססות רצף לקביעת פעילות משפרת דיפרנציאלית, מיון תאים על סמנים ספציפיים לסוג התא לפני ריצוף דנ"א ורנ"א יכול לאפשר לחוקרים לקבוע אם סוגי תאים שונים מראים פעילות משפרת דיפרנציאלית, כפי שתואר ב- Gisselbrecht et al.11. בגישות מבוססות הדמיה, תיוג משותף של תמונות עם סמנים ספציפיים לסוג תא מאפשר לבחון אם תאים המציגים פלואורסצנציה מונעת משפר מציגים גם סמנים מסוג תא בעלי עניין 12,13,14,15,16. מבחני כתב משפר מאפשרים בדיקה ישירה של שונות אלילית הקשורה לסיכון במשפרים להשפעות על יכולת המשפר. הרוב המכריע של מוקדי הסיכון שזוהו במחקרי אסוציאציה כלל-גנומית (GWAS) נמצאים באזורים שאינם מקודדים בגנום17. מחקרי ביאור פונקציונליים של מוקדי סיכון אלה מצביעים על כך שחלק גדול ככל הנראה פועלים כמשפרים18,19,20. פריסת MPRA in vivo יכולה לאפשר בדיקה של גרסאות אלה הקשורות לסיכון לפעילות משפרת במוח12,21. לבסוף, משלוח ואיסוף בנקודות זמן שונות יכולים להציע תובנות לגבי השלבים ההתפתחותיים שבמהלכם פעיל המשפר.

עיצובי פלסמידים משפרים-כתבים הם מגוונים וניתן להתאים אותם אישית כך שיתאימו למטרות הניסוי. ישנן מספר אפשרויות עבור מקדמים מינימליים ששימשו במחקר משפר, כגון מקדם מינימלי β-גלובין אנושי22 ועכבר Hsp68 מקדם מינימלי23. מקדמים אלה ידועים כמניעים רמות נמוכות של ביטוי, אלא אם כן הם משולבים עם אלמנט משפר כדי להפעיל אותם. לעומת זאת, אלמנטים מקדימים מכוננים מניעים ביטוי חזק של הטרנסגן, שימושי לשליטה חיובית או לבדיקת תפקוד משפר על רקע ביטוי חזק. אפשרויות נפוצות עבור מקדמים מכוננים כוללות CAG, מקדם היברידי המופק ממקדם β-אקטין עוף ומשפר ציטומגלווירוסמיידי 24, או EF1α25 אנושי. מאחר שידוע שמשפרים פועלים באופן דו-כיווני26, הכיוון והמיקום של המשפר ביחס למקדם המינימלי הם גמישים (איור 2A). מבחני משפר-כתב מסורתיים ממקמים את המשפר במעלה הזרם של המקדם, ובמשלוחי ספרייה, כוללים רצף ברקוד במורד הזרם של הגן המדווח כדי לשייך קריאות ריצוף עם המשפרהנבדק 27. עם זאת, משפרים יכולים גם להיות ממוקמים במסגרת הקריאה הפתוחה של הגן המדווח ולשמש כרצף ברקוד משלהם, כפי שנעשה ב- STARR-seq28. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתכנון הבדיקה STARR-seq, ומכניס את רצף משפר המועמדים לתוך 3' UTR של הגן המדווח. בעוד שהאוריינטציה STARR-seq מציעה את היתרון של שיבוט יעיל יותר, היא פחות מובנת מהגישה הקונבנציונלית ועשויה לגרום ליציבות RNA משתנה בין מבנים. ניתן להתאים בקלות את השיטות המתוארות לכיוון STARR-seq או קונבנציונלי עם שינויים קלים בתהליך השיבוט שתוארו במקום אחר27,29.

ניתן להשתמש בשיטות שונות של אספקת AAV כדי להתאים אישית עוד יותר את הטכניקה הזו כך שתתאים למטרות הניסוי (איור 2B). זריקות תוך גולגולתיות ישירות, המתוארות בהרחבה בפרוטוקול זה, מספקות ריכוז גבוה של הנגיף ישירות למוח30. זה נותן יעילות התמרה גבוהה המרוכזת באתר ההזרקה, מה שהופך את זה לטכניקה מצוינת לניסויים המבקשים למקסם את הצפיפות של תאים מתמרים על פני אזור של רקמה. הזרקה סטריאוטקטית יכולה לעזור לתקנן את אתר ההזרקה על פני בעלי חיים לצורך התמרה מקומית הניתנת לשחזור. זריקות תוך גולגולתיות הן הפשוטות ביותר בבעלי חיים מוקדמים לאחר הלידה. כטכניקה חלופית, זריקות סיסטמיות יכולות להעביר טרנסגנים באמצעות AAVs עם סרוטיפים המסוגלים לחצות את מחסום הדם-מוח31. זריקות לווריד הזנב מאפשרות לנגיף להסתובב בכל הגוף, ומאפשרות העברה כללית על פני רקמות רבות10. זריקות רטרו-אורביטליות הן טכניקת הזרקה מערכתית נוספת המעבירה את הנגיף מאחורי העין לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי32. זה מציע מסלול ישיר יותר עבור AAV מהמערכת הוורידית למוח, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה יותר של תאים מתמרים במוח מאשר זריקות לתוך כלי דם היקפיים יותר33.

היבט גמיש נוסף של טכניקה זו הוא שיטת הקריאה. באופן כללי, ניתן לתאר אפשרויות כמבוססות דיווח או מבוססות רצף (איור 2C). שילוב כתב פלואורסצנטי כגון GFP במסגרת הקריאה הפתוחה של המבנה מביא לביטוי של החלבון הפלואורסצנטי בכל התאים המתמרים שבהם המשפר המועמד הניע ביטוי. טכניקות תיוג והדמיה כגון אימונוהיסטוכימיה מאפשרות הגברת אותות. טכניקות קריאה מבוססות ריצוף כוללות זיהוי רצפים מהמבנה המועבר ב-RNA שנאסף מהרקמה. על ידי כימות כמות הדנ"א הנגיפי שנמסר בתחילה, ניתן להשתמש בהשוואה של רנ"א מבוטא לעומת דנ"א מועבר כדי לקבוע את המידה שבה רצף משפר שנבדק היה מסוגל להניע ביטוי מוגבר של הטרנסגן, למשל, בהקשר של בדיקת כתב מקבילה מסיבית (MPRA). MPRAs מציעים הרחבה רבת עוצמה של טכניקות אלה כדי לבדוק עד אלפי משפרים מועמדים לפעילות בו זמנית ותוארו בהרחבה במחקר גנומי 12,27,34,35,36. סינון תפוקה גבוה יותר מושג על ידי ביצוע שלבי שיבוט, אריזה, מסירה ורצף עבור משפרי מועמדים באצווה ולא בנפרד.

בחירת משפר מועמדים מספקת הזדמנות נוספת לגמישות (איור 2D). לדוגמה, בדיקה זו יכולה לשמש לזיהוי משפרים של גן מסוים, כדי לוודא את תפקודם של אזורי עניין ב- DNA שאינם מקודדים, או כדי לקבוע סוגי תאים ספציפיים או שלבים התפתחותיים שבמהלכם פעיל משפר - כל אלה משרתים מטרות הן במדע בסיסי והן בחקר מחלות. באופן כללי, בחירת משפר מועמדים מונעת על ידי תחזיות סיליקו של פעילות המשפר. בדרך כלל, תחזיות סיליקו כוללות ChIP-seq עבור שינויים היסטון המצביעים על משפרים אפשריים, כגון H3K27ac37 ומיפוי נגישות כרומטין38. לבסוף, תחום מחקר הולך וגדל הוא סינון מבוסס פונקציה של אלמנטים משפרים שתוכננו באופן סינתטי, המאפשר מחקרים על האופן שבו רצף משפר מכוון את פונקציה39 ותכנון של משפרים עם תכונות ספציפיות40.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UC Davis (פרוטוקול #22339) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של UC Davis (BUA-R1903). פרוטוקול זה נבדק על עכברי C57BL/6J משני המינים ביום שלאחר הלידה 0-1.

1. שכפלו את רצף המועמדים המשפרים לפלסמיד הווקטורי AAV.

הערה: הפרוטוקולים המייצגים ניתנים, אך לאסטרטגיית השיבוט יש רמה גבוהה של גמישות.

  1. בחר או עצב מבנה של כתב. כאן, מועמד המשפר מוכנס לאזור 3 ' לא מתורגם (UTR) של הגן המדווח EGFP, המתבטא בשליטת המקדם המינימלי Hsp68.
    הערה: מבנים רבים של פלסמיד MPRA המתאימים לבדיקה זו הופקדו ב- Addgene41 וזמינים לשימוש מחקרי.
  2. תכנן פריימרים ל-PCR כדי להגביר רצף של תחומי עניין. הוסף לקצה 5' של הפריימרים את זרוע ההומולוגיה המתאימה לשיבוט גיבסון (~35 bp המתאים לרצף 5' במעלה הזרם של מיקום ההחדרה, גדיל עליון עבור הפריימר הקדמי, וגדיל תחתון עבור הפריימר ההפוך).
    הערה: ודא שרצף פריימר הבסיס הוא באורך של ~18-24 כ"ס ותכולת GC של ~50%-60% עם טמפרטורת התכה של כ-57-59 מעלות צלזיוס.
  3. בצע PCR מדגימת DNA באמצעות הפריימרים שתוכננו לשימוש.
    1. הרכיבו את תערובת תגובת ה-PCR בצינורות PCR של 0.2 מ"ל כמתואר בטבלה 1.
    2. הניחו את תערובות התגובה של ה-PCR על מחזור תרמי ובצעו מחזוריות בהתאם לתוכנית המוזכרת בטבלה 1.
    3. אשר את ההצלחה של PCR על ידי הפעלת 5 μL של מוצר PCR על ג'ל אגרוז 0.7%-1% ב 100 V במשך 30-60 דקות. בדוק את קטע האורך החזוי.
    4. נקה את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת עמודת ניקוי תגובה אנזימטית מסחרית. התוספת הסופית היא תוספת השיבוט.
  4. בצע עיכול הגבלה כדי ליניאריזציה של וקטור AAV באתר השיבוט הייחודי כדי להכניס את המשפר לווקטור.
    1. אתר השיבוט ב-3' UTR של מבנה כתב המשפר המשמש כאן תחום על ידי אתרי הגבלה ייחודיים של PacI ו- AscI. בצע תקציר כדי ליניאריזציה של הפלסמיד במיקום זה על פי הפרמטרים הבאים (שלבים 1.4.2-1.4.4).
    2. לעכל 1-10 מיקרוגרם של דנ"א וקטורי באמצעות PacI ו- AscI, תלוי כמה תגובות שיבוט יהיה צורך. הכן את התגובות באמצעות החיץ המצורף בהתאם להוראות היצרן.
    3. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות כדי לעכל את הדנ"א הווקטורי. (אם מעכלים יותר מ-5 מיקרוגרם בתגובה של 50 μL, ייתכן שיהיה צורך בדגרה ארוכה יותר.)
    4. לאחר 1-2 שעות של דגירה, השבת את האנזים על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    5. הפרד את שברי עיכול ההגבלה על ידי אלקטרופורזה בג'ל באמצעות ג'ל אגרוז של 0.7%-1%, הפעל ב-100 וולט למשך 30-60 דקות.
    6. הבלו את הרצועה עבור וקטור ליניאריזציה לטהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרית.
  5. ביצוע תגובות שיבוט של גיבסון ושינוי צורה
    1. קבע את הריכוז של הווקטור המטוהר ואת תוספת השיבוט באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: דנ"א בולע אור ב-260 ננומטר, בעוד שמזהמים בולעים אור ב-230 ננומטר ו-280 ננומטר. יחסים גבוהים (>1.8) של 260/230 ו-260/280 מצביעים על דנ"א מטוהר מאוד.
    2. להרכיב תגובות שיבוט של גיבסון בצינורות PCR של 0.2 מ"ל: 5 מיקרון של תערובת מאסטר של גיבסון 2x, מקטעי דנ"א של 0.02-0.5 pmol ביחס של 3:1 להוסיף לווקטור (ריכוז DNA אופטימלי לתגובה צריך להיקבע באופן אמפירי) ומים נטולי Nuclease (להעלות את הנפח ל -10 μL).
    3. דגירה של תגובות גיבסון בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במחזור תרמי.
  6. טרנספורמציה רקומבינציה לקויה (recA-) מוסמכת Escherichia coli (E. coli).
    1. הגדר אמבט מים ל -42 מעלות צלזיוס והפשרה של התאים המוכשרים הזמינים מסחרית על קרח.
      הערה: ניתן לבצע שלב זה לפני שלב 1.4, והתאים יכולים להפשיר תוך כדי הכנה ודגרה של תגובת גיבסון.
    2. Aliquot 30-50 μL של תאים לתוך צינורות microcentrifuge 2.0 מ"ל. הוסף 2 μL של תגובת גיבסון לאליקוט ותייג את הצינור עם זהותו של גיבסון. לדגור את התאים על הקרח במשך 30 דקות.
      הערה: השתמש ב-5-10 ננוגרם של וקטור ריק לא מעוכל כבקרה חיובית ובמים כבקרה שלילית.
    3. הלם חום התאים באמבט המים 42 מעלות צלזיוס במשך 30-45 שניות, מיד להחזיר את הצינורות לקרח, ולתת להם להתאושש במשך 5 דקות.
    4. בעודכם על קרח, הוסיפו 400-950 μL של מדיית ההתאוששות המסחרית.
      הערה: מדיית ההתאוששות ששימשה בניסויים אלה מכילה 2% פפטון צמחי, 0.5% תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 ו-20 mM גלוקוז.
    5. לאחר התאוששות על קרח, לשחזר באופן מלא את התאים על ידי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה של 250 סל"ד במשך 30-60 דקות.
    6. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר 400 μL של supernatant, משאיר ~ 50 μL של חיידקים לצלחת.
    7. צלחת על מדיה סלקטיבית דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
      הערה: המדיה הסלקטיבית ששימשה בניסויים אלה מכילה 1.0% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 1.0% נתרן כלורי, 1-2% אגר, 96-97% מים וקרבניצ'ילין בריכוז של 100 מיקרוגרם למ"ל. השתמש תמיד בזני רקומבינציה חסרים של חיידקים לשיבוט פלסמידים נגיפיים מכיוון שלחוזרים הטרמינליים ההפוכים של הנגיף (ITR) יש רצפים תואמים והם יכולים לעבור רקומבינציה הומולוגית. עם זאת, זני recA של חיידקים עדיין עוברים רמות נמוכות של רקומבינציה. פלסמיד הכתבים המשמש כאן הוא AAV משלים את עצמו, שבו הרצף של אחד ה- ITR השתנה וכבר אינו תואם באופן מושלם את ה- ITR האחר. גידול החיידקים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס מומלץ גם להאטה נוספת בקצב הרקומבינציה ההומולוגית.
  7. אמת שיבוטים ושחזר פלסמידים.
    1. הכינו תערובת מאסטר של PCR באמצעות פריימרים קדמיים והפוכים (Table of Materials) שמתאימים לווקטור, ומקיפים את מיקום ההוספה. Aliquot 10 μL נפחים לתוך צינורות רצועת PCR 0.2 מ"ל.
    2. בצינורות בעלי תחתית עגולה של 14 מ"ל, הכינו 5 מ"ל אליקוטים של מרק LB סלקטיבי אנטיביוטי, אחד לכל מושבה שנבדק באמצעות PCR ובקרה שלילית.
    3. השתמש בקיסם סטרילי או בקצה פיפטה כדי לבחור מושבה בודדת ולגרד בגסות את המושבה לתחתית צינור PCR אחד.
    4. כאשר המושבה התנתקה לתערובת הראשית של PCR, שחרר את הקיסם או הקצה לתוך אחד מאליקוטים LB ותייג את הצינור בגודל 14 מ"ל עם תגובת גיבסון ומספר צינור ה- PCR.
    5. הניחו את תגובות ה-PCR של המושבה על מחזור תרמי ובצעו מחזור עם התוכנית המתוארת בטבלה 2.
    6. דגירה של תרביות נוזליות של 5 מ"ל המחוסנות בקיסמים או קצוות פיפטה באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד.
    7. הפעל את תגובות ה- PCR של המושבה על ג'ל אגרוז של 0.7%-1% ב- 100 וולט למשך 30-60 דקות ודמיינו את הפסים במערכת הדמיה של ג'ל דוק.
    8. השליכו את תרביות ה-5 מ"ל שאינן מציגות את רצועת ה-PCR החזויה.
    9. עבור כל שיבוט משולב בהצלחה, אפשר לתרביות 5 מ"ל לגדול בן לילה ולאחר מכן לבצע מיני הכנה פלסמיד מ 4.5 מ"ל באמצעות ערכה מסחרית. שמור 0.5 מ"ל של התרבות הנוזלית ולשמור ב -80 מעלות צלזיוס כמלאי גליצרול.
    10. אשר כי הטרנסגנים הכלולים בתוך הפלסמידים נקיים ממוטציות לא רצויות באמצעות ריצוף סנגר42.
    11. לאחר שמבנה הכתב אושר כמשובט בהצלחה, השתמש במלאי הגליצרול שנשמר כדי לחסן תרבית מתנע של 5 מ"ל ולגדול במשך 8-16 שעות באינקובטור רועד ב-30 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד.
    12. ברגע שהמרק מעונן, דיללו את תרבית המתנע פי 1,000 ב-250-300 מ"ל של ציר LB סלקטיבי טרי ודגרו לפחות למשך הלילה באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. לאחר מכן לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת פלסמיד מקסי מסחרית.
      הערה: חיידקים יגדלו לאט יותר ב-30 מעלות צלזיוס לעומת 37 מעלות צלזיוס, אך זוהי הטמפרטורה הטובה ביותר להאטת קצב הרקומבינציה הספונטנית בעת גידול תרביות גדולות.
    13. בצע תקציר XmaI כדי לבדוק רקומבינציה של ה- ITR באמצעות שלבים 1.4.2-1.4.5, תוך החלפת XmaI במקום PacI ו- AscI. דמיינו את הרצועות על מערכת הדמיה של מסמך ג'ל.
      הערה: פלסמיד rAAV עם שני ה-ITR הקיימים יניב שתי רצועות על ג'ל לאחר תקציר זה: האחת באורך הגנום של ה-rAAV והשנייה באורך שאר עמוד השדרה של הפלסמיד. אם יש רק רצועה אחת, אז ה- ITRs עברו רקומבינציה הומולוגית, והפלסמיד rAAV לא יהיה מסוגל לארוז חלקיקים ויראליים. עמוד השדרה הפלסמידי rAAV המתואר כאן תוכנן כך שאתרי XmaI מתרחשים רק ב- ITRs. אם תוסף המועמד המשפר מכיל גם אתרי XmaI, עדכן את תוצאות הרצועה החזויות והניתוח בהתאם.

2. השג rAAV ארוז.

  1. השתמש ב-rAAV ארוז (באופן מקצועי או פנימי) לניסויים במחקר זה.
    הערה: ישנן אפשרויות רבות לאריזת rAAV. ניתן לארוז rAAV באופן מקצועי בחברה או במתקן ליבה באוניברסיטה. ניתן גם לארוז את ה- rAAV בתוך החברה תוך שימוש בטכניקות שונות הנעות במורכבותן ובצורך בציוד מיוחד43,44. הדאגה העיקרית היא להשיג וקטור באיכות גבוהה וכי titer זיהומיות נקבע ברמה גבוהה של ודאות. הן rAAVs ארוזים באופן מקצועי והן ארוזים בתוך הבית שימשו לניסויים שונים שתוארו במחקר זה.

3. הזרקת פלסמיד ארוז rAAV תוך גולגולתי לעכברי ילודים.

  1. הכינו תערובת rAAV למשלוח.
    1. אם הכוונה היא להשוות את דפוסי הביטוי בין וירוסים משפרים שונים, השוו את הטיטרים של כל הווירוסים להשוואה על ידי דילול כולם כך שיתאימו לנגיף הכי פחות מרוכז.
    2. ערבבו יחד יחס של 2:1 או 3:1 של נגיף המדווח המשפר ונגיף מדווח הבקרה המובע באופן מכונן והוסיפו כמות קטנה (0.06% ריכוז סופי) של צבע ירוק מהיר.
      הערה: Fast Green הוא צבע הנמצא בשימוש נרחב בזריקות של חיות ניסוי, כולל עם AAV, כדי לדמיין את אתר ההזרקה במהלך ומיד לאחר ההליך45,46,47,48. אמנם זהו שלב חשוב של הבטחת איכות, אך ייתכן שתוספת הצבע עלולה להפריע להתמרת. לשקול מחדש את השימוש בצבע הזרקה עשוי להיות חשוב לאופטימיזציה של פרוטוקול במקרים מסוימים. נגיף הבקרה המכונן הוא קריטי לחלוטין להשוואת זריקות עצמאיות. זריקות הנגיף ישתנו במיקום ובהיקף ההעברה מבעל חיים לחיה. הבקרה המכוננת תאפשר להוציא זריקות כושלות מניתוח ותספק סטנדרט לנורמליזציה של שונות בהעברת הנגיף.
    3. שברו את קצהו של פיפטה זכוכית סטרילית משוכה העשויה מצינורית נימי בדרגה μL על ידי ניקוב עדין דרך מגבון עדין שעוקר על ידי השרייתו ב-70% אתנול ומותר לו להתייבש לחלוטין. לאחר מכן הכנס את פיפטה הזכוכית המשוכה למכלול השואף המורכב ממכשיר להפעלת לחץ המחובר לצינורות גומי באורך 15 אינץ 'המסתיימים באטם גומי להחזקת פיפטה מיקרו-נימי.
      הערה: "ההתקן להפעלת לחץ" עשוי להיות מזרק או פיה. אם יש להשתמש במזרק, אדם שני יידרש להפעיל לחץ דרך המזרק בזמן שהנסיין מתמרן את הפיפטה ביד אחת ואת החיה ביד השנייה. אם משתמשים בפיה, המאפשרת לנסיין שליטה עדינה הן על מיקומי החיה והפיפטה והן על הלחץ המופעל על המזרק, נדרשת זהירות יתרה כדי למנוע זיהום וירוס.
    4. הפעל לחץ שלילי דרך מכלול השואף כדי למשוך נפח קטן (~ 0.2-0.5 μL) של שמן מינרלי לתוך פיפטה זכוכית.
      הערה: שלב זה חשוב מאוד כדי לספק מחסום למניעת חלקיקים נגיפיים אירוסוליים מזהמים את מכלול השואף.
    5. מניחים את מכלול השואב המוכן בצד ושומרים את הנגיף על הקרח עד שהוא מוכן להזרקה.
  2. Cryo-מרדים את העכברים היילודים בצלחת פלסטיק יבשה שקועה חלקית בקרח עד להפסקת רפלקס נסיגת הדוושה (~5 דקות). ודאו שהעכברים אינם באים במגע ישיר עם הקרח.
  3. השתמש בלחץ שלילי דרך מכלול השואף כדי למשוך את תערובת הנגיף לתוך פיפטה זכוכית משוך עד שהמניסקוס עובר את סימן הסימון 2 μL.
  4. הסר את העכבר מתא הקירור והצב אותו על הספסל. אתרו את אתרי ההזרקה הדו-צדדיים באמצע הדרך בין למבדה לברגמה ובאמצע הדרך בין תפר הסגיטל לכל עין. יש לחטא את שני האזורים בעזרת מגבון אלכוהול.
  5. השתמש בפיפטה הזכוכית המשוכה כדי לחדור את גולגולתם של עכברי היילודים והפעל בעדינות לחץ חיובי דרך מכלול השואף כאשר המחט נכנסת למוח. צפו במניסקוס של תערובת הנגיף. ההתנגדות ללחץ המופעל תפחת כאשר קצה הפיפטה מגיע לחדר הצדדי. מוציאים 1 μL של הנגיף, למשוך את הפיפטה, ולחזור על החדר השני לרוחב.
  6. הניחו את העכבר על כרית חימום או על תא חימום כדי להתאושש. לאחר התעוררות ופעילות, החזירו את בעל החיים לכלוב הביתי שלו.

4. לאסוף רקמות ולבצע אימונוהיסטוכימיה.

  1. לאחר זמן מספיק לאחר התמרת הנגיף, מרדימים את העכברים ומקריבים על ידי זלוף שריר הלב.
    הערה: ניסויים רבים, כולל התוצאות המייצגות המוצגות כאן, מאפשרים תקופה של 4 שבועות או יותר עד שהנגיף יתמר. עם זאת, AAVs משלימים את עצמם יכולים להראות ביטוי חזק כבר 7 ימים12. ייתכן שיהיה צורך לייעל את תקופת הדגירה הרצויה בהתאם לטכניקות ולמטרות ניסיוניות ספציפיות.
    1. הכן משאבה פריסטלטית עם צינורות עירוי תוך ורידי ומחט 25 גרם.
    2. הכינו 1x PBS ו-4% פרפורמלדהיד (PFA) והניחו אותם על קרח.
    3. מניחים את קצה הכניסה של הצינורות ב-PBS 1x קר כקרח. הגדר את קצב הזרימה (2.5 מ"ל/דקה עבור עכברי P7, 3.5 מ"ל/דקה עבור עכברי P28) והפעל את המשאבה עד שהמאגר נמשך כל הדרך דרך הצינורות ומתנקה מבועות. מניחים את המחט בצד עד שהיא מוכנה לזילוף.
    4. בתוך מכסה אדים, פיפטה נפח קטן של איזופלורן על מגבת נייר בתחתית תא צנצנת טיפה. הניחו את העכבר שהוזרק בעבר על סורג מעל מגבת הנייר, כדי להבטיח שהוא לא יבוא במגע ישיר עם האיזופלורן. אטמו את החדר כדי להרדים את העכבר. המתן ~ 5 דקות ואז פתח את התא ובדוק אם יש רפלקס משיכת דוושה. המשך ברגע שהחיה מחוסרת הכרה.
      הערה: לאורך כל הזילוף, יש לשמור על העכבר על איזופלורן עם חרוט אף כדי למנוע חזרה להכרה.
    5. השתמש מספריים כירורגיים כדי לפתוח את הבטן ואת החזה של העכבר, להסיר את כלוב הצלעות ולחשוף את הלב.
    6. השתמש בזוג מיקרו-מספריים של הקשתית כדי לבצע חתך קטן באטריום הימני של העכבר, להחדיר את מחט האינפוזיה לחדר השמאלי ולהפעיל את המשאבה הפריסטלטית.
    7. יש למזג את החיה עם PBS קר כקרח 1x עד שהדם נשטף מתוך החתך באטריום הימני מתבהר. ניקוי הרקמה מדם חשוב מאוד מכיוון שלתאי דם אדומים יש אוטופלואורסצנציה, וכלי הדם עלולים לפגוע ביכולת לדמות תאים המבטאים כתב.
    8. השהו את המשאבה הפריסטלטית והעבירו את צינורות הכניסה מה-PBS ל-4% PFA. הפעל מחדש את המשאבה והזליף 1 מ"ל / גרם של משקל גוף, ~ 25 מ"ל עבור עכבר מבוגר.
      הערה: רעידות קיבוע צריכות להיות ניתנות לצפייה, וגוף העכבר צריך להתקשות.
  2. לנתח ולתקן את המוח.
    1. הסר את ראש העכבר עם מספריים כירורגיים.
    2. באמצעות מספריים כירורגיים קטנים, להתחיל בבסיס הגולגולת ולבצע חתך לאורך קו האמצע של הראש ולמשוך בחזרה את העור ואת הרקמה שמתחת כדי לחשוף את הגולגולת.
    3. בעזרת מספריים של קשתית הקשתית, חותכים בזהירות את החלק האחורי של הגולגולת, מתחילים בפורמן מגנום וממשיכים למעלה לכיוון ולאורך התפר הסגיטלי עד שנורות חוש הריח עוברות.
    4. הכנס את המספריים לתוך הגולגולת מעל נורות חוש הריח ולעשות שני חתכים אופקיים בגולגולת. בצע זוג דומה של חתכים אופקיים בעצם העורפית. החתכים האופקיים וקו האמצע יוצרים זוג דשים דמויי דלת בחלק העליון של הגולגולת.
    5. קלף בחזרה את דשי הגולגולת כדי לחשוף את המוח במלואו. השתמש בזוג פינצטה כדי לנתק את נורות חוש הריח מהגולגולת ולחתוך את עצבי הגולגולת, ולשחרר את המוח מהגולגולת.
    6. זרוק את המוח לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל עם 3-5 מ"ל של 4% PFA ב-PBS. לאחר תיקון 6 שעות עד לילה. אין לתקן את הרקמה יתר על המידה.
  3. הכינו את המוחות לקריוסקציה.
    1. העבירו את המוח המקובע לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל עם 12-14 מ"ל של 30% סוכרוז ב-PBS להתייבשות. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס עד שהמוח שוקע לתחתית הצינור (2-3 ימים).
    2. טבלו את המוח הקבוע והמיובש בתרכובת אופטימלית של טמפרטורת חיתוך (OCT) בקריומולד של 15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ"מ. הוסיפו OCT עד שהמוח מכוסה במלואו.
    3. מניחים את cryomold על גוש קרח יבש ומקפיאים את הדגימה בגוש מוצק של OCT (~ 5 דקות).
      הערה: ניתן לאחסן בלוקי OCT בטמפרטורה של -80°C למשך חודשים עד שנים.
    4. תייג את cryomold עם שם המדגם ואת הכיוון של המוח.
  4. להשיג חתכים קורונלים באמצעות מיקרוטום cryostat.
    1. סמן את הכיוון של המוח על בלוק OCT בעיפרון והסר את הבלוק מהקריומולד בתוך הקריוסטאט.
    2. מקם את בלוק ה- OCT כך שהמוח יהיה מכוון עם נורות חוש הריח הפונות ללהב של הקריוסטאט והדביק את הבלוק למחזיק האובייקט של הקריוסטאט עם כמה OCT טרי.
    3. לאחר הקפאה במקום, התחל לחתוך 50 מיקרומטר חלקים דרך הבלוק הבא שלבים 4.4.4-4.4.6.
    4. אין להשתמש בצלחת נגד רול. חלקים יתכרבלו לגלילים הדוקים תוך כדי חיתוך ויתאספו על גבי הבלוק או ייפלו למטה למגש איסוף.
    5. צפו בצורת הבלוק בחיתוכים הראשונים שנעשים. בצע חיתוכים אנכיים דרך הבלוק, ויצר פנים אחידות כאשר מתחילים לחתוך. התאם את הזווית באמצעות זרועות כוונון הדגימה במידת הצורך.
    6. כאשר נורות חוש הריח גלויות, שימו לב היטב לצורת החלקים. אם אחד מהם נראה גדול יותר מהשני, החתכים הם בזווית יחסית למוח, ויש צורך ליישר את הכיוון של המוח כנגד הלהב באמצעות זרועות כוונון הדגימה.
      הערה: אם חותכים ישר, קליפת המוח צריכה להתחיל להופיע מעל כל נורת חוש הריח בו זמנית.
    7. לאחר שנורת חוש הריח נחתכה ורקמת המוח הרוסטרלית נראית לעין, הפחיתו את עובי החיתוך ל-30-35 מיקרומטר והתחילו לאסוף את החלקים הצפים. בצע את השלבים 4.4.8-4.4.13 עבור חתך המוח.
    8. הברישו את כל החלקים הקודמים ממחזיק הבלוק והאובייקט, כך שהם ייפלו למגש האיסוף. הברישו אותם לצד אחד של המגש ושמרו אותם בנפרד. אם הערימה גדולה מדי, רוקנו את המגש.
    9. יש לפזר 1 מ"ל של PBS לתוך כל באר של צלחת 24 באר. תייג שורה אחת עבור כל מוח.
    10. חותכים 6 חתכים קורונלים. אחזו את החלקים באמצעות פינצטה קרה וסדרו אותם על במת הקריוסטאט. חזור על שלב זה 2 או 3 פעמים, תוך שמירה על קבוצות של 6 חלקים נפרדים.
    11. יש להרטיב מברשת צבע בגודל 000 עם PBS ולמרוח עודפי נוזלים על טישו או מגבת נייר נטולת מוך. השתמש במכחול כדי להרים בעדינות כל חלק, אחד בכל פעם, ולהניח אותו בבארות המתאימות של צלחת 24 הבאר.
    12. מניחים אחד מששת החלקים מקבוצת הפרוסות לתוך כל אחת מ-6 הבארות בשורה של לוח 24 הבאר. זה מבטיח שכל באר מכילה חלקים מייצגים המשתרעים על פני האזור המחולק במוח.
    13. המשך החתך בקבוצות של 6 עד לחתך הקצה הקאודאלי של קליפת המוח.
    14. לאחסון, אטמו את צלחת הבאר 24 עם פרפילם ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: המקטעים יציבים במשך 1-2 חודשים ב-4 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש בתמיסת PBS עם 0.1% נתרן אזיד כדי לעכב צמיחת חיידקים ולהאריך את חיי המדף של החלקים. עם זאת, אם יש לאחסן את החלקים במשך יותר מחודשיים, יש למקם אותם בתמיסה מגינה בהקפאה ולהקפיא אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
  5. בצע אימונוהיסטוכימיה להגברת אותות גנים מדווחים.
    הערה: כל השלבים למעט שליפת אנטיגן צריכים להתבצע באמצעות תסיסה עדינה עד בינונית (~ 100 סל"ד) על שייקר מסלולי. כדי לשמר פלואורסצנטיות מקומית של כתב הבקרה (mRuby3), יש להגן על כל השלבים מפני אור ככל האפשר.
    1. הכן את המאגרים הדרושים כמתואר בטבלה 3.
    2. הכינו צלחת חדשה של 24 בארות עם שורה אחת לכל מוח מוכתם. בעמודה הראשונה של בארות, להוסיף 1 מ"ל של PBS לכל באר.
    3. באמצעות מכחול בגודל 000, העבירו בעדינות באר אחת של חלקים מהקולקציה המקורית ל-PBS הטרי בצלחת החדשה של 24 בארות לשטיפה מהירה להסרת תרכובת OCT שיורית.
    4. הוסף 1 מ"ל של ARB לבאר הבאה בלוח 24 הבאר והעביר קטעים לבאר זו. דוגרים בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
    5. תנו לצלחת להתקרר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות.
    6. הוסף 1 מ"ל של PB לבאר הבאה ולהעביר את החלקים לבאר זו. דגירה ב- RT במשך 20 דקות.
    7. הוסף 500 μL של BB לבאר הבאה ולהעביר את החלקים לבאר זו. דגירה ב-RT למשך שעה אחת.
    8. הוסף 2 מ"ל של WB ל- BB ולאחר מכן פיפטה החוצה ~ 2 מ"ל של תמיסה והשלכה, משאיר תמיסת BB מדוללת בבאר. חזור על הפעולה עד שהמקטעים נראים בבירור.
    9. לדלל את הנוגדן העיקרי (עוף IgY נגד GFP, 1:1000) ב- BB. הוסף 350-500 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית לבאר הבאה והעבר את החלקים לבאר זו. אטמו את הצלחת עם פרפילם ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    10. יש לדלל BB עם WB כפי שנעשה בעבר עד שהקטעים נראים בבירור.
    11. הוסף 1 מ"ל של WB לבאר הבאה והעבר את החלקים לבאר זו. דגירה ב- RT במשך 20 דקות.
    12. הסר ~ 800-900 μL של חיץ ולהשליך. מוסיפים 1 מ"ל WB טרי ומדגרים 20 דקות. החלף 1 מ"ל של WB 4 פעמים נוספות עבור סך של 5 כביסות, 20 דקות כל אחת.
    13. לדלל את הנוגדן המשני (חמור נגד עוף אלכסה פלואור 488 מצומד, 1:500) ב BB. הוסף 350-500 μL של תמיסת הנוגדנים המשנית לבאר חדשה. דגירה ב-RT למשך 45 דקות עד שעה.
      הערה: זוהי הבאר השביעית, כך שאם מכתימים קטעים מיותר מ-2 מוחות, יהיה צורך בלוח חדש בשלב זה.
    14. לדלל BB עם WB כמו בעבר ולהעביר את החלקים לבאר חדשה מלאה 1 מ"ל של WB. לשטוף את החלקים כפי שנעשה בעבר במשך 20 דקות 3 פעמים.
    15. הכן פתרון עובד של DAPI ב- PBS (ריכוז סופי 0.04-0.8 מיקרוגרם / מ"ל). הגן על הפתרון מפני אור.
    16. הוסף 1 מ"ל פתרון DAPI לבאר הבאה ולהעביר את החלקים לבאר זו. דגירה ב- RT במשך ~ 5 דקות.
    17. העבר את החלקים בחזרה ל- WB והרכב בעדינות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות מכחול בגודל 000. אפשרו למגלשות להתייבש באוויר.
    18. יש למרוח את הכיסויים עם מדיית הרכבה מתאימה. אפשרו לשקופיות להירפא ב-RT בחושך במהלך הלילה.

5. תמונה וניתוח של מקטעי רקמת המוח לפעילות המשפרת.

  1. השתמש בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה נמוכה (5x) כדי להקליט תמונות פלואורסצנטיות המשתרעות על פני אזור המוח.
  2. אתר את אתר ההזרקה והערך את היקף התמרת הנגיף בהתבסס על צפיפות ועוצמה של תאים פלואורסצנטיים אדומים. הקפידו להשוות בין בעלי חיים שהותמרו באופן דומה.
  3. הקלט תמונות פלואורסצנטיות מפורטות עם עדשה אובייקטיבית להגדלה גבוהה יותר (≥25x) אם תרצה בכך.
    הערה: הקפד תמיד להשתמש באותן הגדרות עבור פרמטרי רכישה כגון עוצמת אור עירור, מסננים וזמן חשיפה בין דגימות שיש להשוות.
  4. עבד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.
    הערה: העיבוד עשוי להתבצע בכל חבילת תוכנה לניתוח תמונות. השלבים הבאים הם הצעות לקביעה אם רצף פועל כמשפר בהקשר בניית הכתב (שאלה של כן או לא) באמצעות הפצת FIJI בקוד פתוח של ImageJ. פוטומטריה מעמיקה יותר עשויה להתאים כאשר משווים את דרגות הפעילות בין גרסאות משפרות. תמונות מדגימות שונות צריכות תמיד להיות מעובדות באופן עקבי על מנת שניתן יהיה להשוות ביניהן.
    1. החל מסננים כדי להפחית את הרעש. בפיג'י, בחר באפשרות Despeckle בתפריט תהליך > רעש .
      הערה: זהו מסנן חציוני בגודל 3 x 3.
    2. הפחת פלואורסצנציה ברקע בעקבות שלבים 5.4.3-5.4.6.
    3. הפרדת הערוצים של תמונה רב-ערוצית. בפיג'י, בחרו באפשרות 'פצל ערוצים ' בתפריט ' תמונה > צבע' .
    4. השתמשו בכלי בחירת מלבן או עיגול כדי לצייר צורה קטנה באזור בתמונה שאין בו תאי פלואורסצנט, ולמדוד את עוצמת הפיקסלים הממוצעת של הרקע באמצעות ' נתח > מדידה'. חזור על הפעולה כדי לדגום אזורים מרובים.
      הערה: ודא שהאפשרות 'ערך אפור ממוצע ' נבחרה בתפריט ' נתח > קבע מדידות' .
    5. ממוצע הערך האפור הממוצע מ- 5-8 אזורי רקע ושחרר את הנקודה העשרונית. הפחת ערך זה מכל פיקסל בתמונה באמצעות ' תהליך' > 'מתמטיקה' > 'הפחת'.
      הערה: עיגול למספר השלם הקרוב ביותר עלול להעריך יתר על המידה את הרקע כדי להחסיר. זה שמרני יותר פשוט להשמיט את הנקודה העשרונית. לדוגמה, 6.4 יעוגל כלפי מטה ל-6, אך יש לעגל גם את 6.5 כלפי מטה ל-6 כדי למנוע את הסיכון של חיסור 0.5 יחידות של אות ממשי מכל פיקסל.
    6. אם תרצו, מזגו את הערוצים בחזרה לתמונה רב-ערוצית. בפיג'י, השתמשו ב'תמונה' > ' צבע' > 'מיזוג ערוצים'.
    7. חברו את כל התמונות החופפות יחד. בפיג'י, השתמש בתוספים > תפירה > תפירת רשת/אוסף.
    8. כוונן את הבהירות והניגודיות. בפיג'י, השתמשו בתמונה > התאימו > בהירות/ניגודיות.
      הערה: השתמש תמיד באותם ערכי מינימום ומקסימום עבור כל תמונה שיש להשוות.
    9. ספירת מספר התאים הפלואורסצנטיים הירוקים לאחר שלבים 5.4.10-5.4.12. אלה הם התאים שבהם רצף משפר המועמדים הצליח להניע את ביטוי הכתב.
    10. התחילו בהסתרת הערוץ הירוק והשתמשו בכלי בחירת הצורה החופשית כדי לצייר צורה סביב האזור במוח שמבטא פלואורסצנטיות אדומה. באמצעות הפונקציה Measure בפיג'י, מדוד את השטח, הצפיפות המשולבת והערך האפור הממוצע של הערוץ האדום באזור זה.
    11. בעזרת הכלי בחירה מרובת נקודות, ספור את מספר התאים הירוקים באזור זה.
    12. לנרמל את מספר התאים הירוקים על ידי הצפיפות המשולבת של הערוץ האדום. בהירות התעלה האדומה המקומית היא מדד פרוקסי לעוצמת החשיפה לנגיף, המאפשר השוואה של פעילות המשפרת בין בעלי חיים מתמרים שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות שיטות אלה, רצף של 915 bp באינטרון השלישי הקשור לסיכון פסיכיאטרי של הגן CACNA1C19,49,50 נבדק לפעילות משפרת במוח העכבר שלאחר הלידה. רצף זה התגלה ב-MPRA של 345 רצפי משפר מועמדים שבמרכזם סיכון פסיכיאטרי ונוירולוגי SNPs12 וניסויי אפי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת rAAV לפריסת טרנסגנים מונעי משפר במוח העכבר שלאחר הלידה. בפרוטוקול כללי זה, משפר מועמדים, מקדם מינימלי, גן מדווח ורצף ברקוד אופציונלי משוכפלים לתוך עמוד שדרה פלסמיד AAV. ניסויים אלה יכולים להיעשות עם רצף משפר מועמד יחיד או עם רצפים רבים במקביל. הפלסמיד נארז לתוך rAAV ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

הריצוף בוצע בליבת טכנולוגיות הדנ"א של אוניברסיטת קליפורניה בדייוויס. אנו מודים למעבדה של לין טיאן באוניברסיטת קליפורניה בדייוויס על ההכשרה על אריזות rAAV והעניקה לנו בנדיבות עוזר AAV ופלסמידים של נציג / כובע. עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIGMS R35GM119831.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Citrate BufferSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated DNA TechnologiesN/A: Custom designedForward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated DNA TechnologiesN/A: Custom designedReverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
AgaroseVWRVWRVN605-500G
Aspirator tube assembliesSigma-AldrichA5177-5EAfor mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishesThermo Fisher Scientific08-757-100D
CarbenicillinSigma-AldrichC1389-5G
Chicken IgY anti-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Confocal microscopeZeissLSM900The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5"VWR82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mLThermo Fisher Scientific22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mLThermo Fisher Scientific352059
Fast Green dyeGraingerF0099-1G
Fine detail paint brush setArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Glass capillary tubesDrummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi KitQIAGEN12663Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade WaterVWRSH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needleThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Lint-free wipe
LB AgarThermo Fisher ScientificBP1425-500LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissorIntegra LifeSciences360-215
Mineral oilSigma Life Science69794-500ML
NEB Stable Competent E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-UpTakara740609.5Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT mediumVWR25608-930
Orbital shakerCole Parmer60-100
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mLVWR490003-692
Peristaltic pumpGilsonF155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificF549L
Powdered milkSunny Select
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28106
rCutSmart BufferNEBB6004SBuffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscINEBR0558L
Restriction enzyme: PacINEBR0547L
Restriction enzyme: XmaINEBR0180L
SOC outgrowth mediumNEBB0920SRecovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free)Millipore Sigma033522.5KG
TAE bufferApex20-194
Transfer tubingGilsonF1179941For peristaltic pump
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification SystemThermo Fisher ScientificA1460Plasmid mini prep kit

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020(2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479(2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956(2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014(2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863(2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384(2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279(2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877(2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56(2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56(2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270(2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628(2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93(2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298(2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061(2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380(2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243(2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888(2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved