JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

Abstract

לאיזון Redox יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס תאי. הדור המוגבר של מינים חמצן תגובתי (ROS) מקדם את השינוי של חלבונים, שומנים, ו- DNA, אשר בסופו של דבר עשוי להוביל לשינוי בתפקוד התאים ומוות התא. לכן, זה מועיל לתאים כדי להגדיל את ההגנה נוגדת החמצון שלהם בתגובה על עלבונות מזיקים, או על ידי הפעלת מסלול נוגד חמצון כמו Keap1 / Nrf2 או על ידי שיפור אוכלי נבלות redox (ויטמינים A, C, ו- E, β קרוטן, פוליפנולים, בין היתר). דלקת ומתח חמצוני מעורבים בפתוגנזה ובהתקדמות של רטינופתיות, כגון רטינופתיה סוכרתית (DR) ורטינופתיה של פגות (ROP). מאז תאי גליה מולר (MGCs) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס של רקמת רשתית עצבית, הם נחשבים מודל אידיאלי ללמוד מנגנוני הגנה תאיים אלה. במובן זה, כימות רמות ROS עם שיטה לשחזור ופשוט הוא חיוני כדי להעריך את התרומה של מסלולים או מולקולות המשתתפים במנגנון ההגנה על תאים נוגדי חמצון. במאמר זה, אנו מספקים תיאור מלא של ההליכים הנדרשים למדידת ROS עם DCFH-DA בדיקה וציטומטריית זרימה ב- MGCs. שלבי מפתח לעיבוד נתונים cytometry זרימה עם התוכנה מסופקים כאן, כך הקוראים יוכלו למדוד רמות ROS (אמצעים גיאומטריים של FITC) ולנתח היסטוגרמה פלואורסצנטית. כלים אלה מועילים מאוד כדי להעריך לא רק את הגידול ROS לאחר עלבון תאי, אלא גם כדי ללמוד את ההשפעה נוגדת החמצון של מולקולות מסוימות שיכולות לספק אפקט מגן על התאים.

Introduction

הרשתית העצבית היא רקמה מאורגנת מאוד המציגה שכבות עצביות מוגדרות היטב. באלה, נוירונים (גנגליון, amacrine, דו קוטבי, אופקי, ותאי photoreceptor) מחוברים זה לזה וגם עם תאי גליה מולר (MGCs) ואסטרוציטים, מה שמוביל פוטו-טרנסדוקציה נאותה ועיבוד של מידע חזותי 1,2. MGCs ידועים יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס רשתית כי הם חוצים את כל קטע הרשתית, ולכן, הם יכולים לקיים אינטראקציה עם כל סוגי התאים כי לווסת תהליכי הגנה מרובים. דווח כי MGCs יש מספר פונקציות חשובות לשמירה והישרדות של נוירונים ברשתית, כולל גליקוליזה כדי לספק אנרגיה נוירונים, הסרת פסולת עצבית, מיחזור של נוירוטרנסמיטורים, ושחרור של גורמים נוירוטרופיים, בין היתר 3,4,5.

מצד שני, דלקת, עקה חמצונית וניטרוסיבית מעורבים בפתוגנזה ובהתקדמות של מחלות אנושיות רבות, כולל רטינופתיות 6,7,8,8,9,10,11. מאזן redox בתאים תלוי רגולציה הדוקה של רמות ROS. ROS נוצרים כל הזמן בתנאים פיזיולוגיים כתוצאה של נשימה אירובית בעיקר. החברים העיקריים במשפחת ROS כוללים רדיקלים חופשיים תגובתיים כגון אניון סופראוקסיד (O2͘͘͘͘•−), רדיקלים הידרוקסיל (•OH), מי חמצן שונים (ROOR′), הידרופרוקסידים (ROOH), ומי חמצן ללא רדיקלי (H2O2)12,13. בשנים האחרונות, התברר כי ROS ממלא תפקיד איתות חשוב בתאים על ידי שליטה בתהליכים חיוניים. MGCs יש הגנה נוגדת חמצון חזקה על ידי הפעלת גורם גרעיני תמלול אריתרויד-2 הקשורים גורם גורם 2 (Nrf2) ואת הביטוי הבא של חלבונים נוגדי חמצון כדי לחסל את הייצור המופרז של ROS בתנאים פתולוגיים 14,15,16. כאשר התאים מאבדים את שיווי המשקל שלהם עקב ייצור מוגזם של ROS או יכולת פגומה להסיר ROS, הצטברות של עקה חמצונית מקדמת שינויים מזיקים בחלבונים, שומנים, ו- DNA, המובילים ללחץ תאי או למוות. הגידול של מערכת ההגנה נוגדת החמצון ברשתית משפר את הרזולוציה ומניעה של רטינופתיות, כגון ROP ו RD 17,18,19,20,20,21,22,23,24. לכן, המדידה של ייצור ROS בזמן אמת היא כלי רב עוצמה ושימושי.

ישנן מספר שיטות למדידת ייצור ROS או עקה חמצונית בתאים. בין אלה, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) בדיקה היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר לכימות ישיר של מצב redox של תא 25,26,27,28. בדיקה זו היא ליפופילית ולא פלואורסצנטית. דיפוזיה של בדיקה זו על פני קרום התא מאפשרת את המחשוף שלה על ידי אסטראזות תאיות בשני קשרים אסתר, לייצר מוצר קוטבי יחסית קרום התא אטום, 2 ′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). מולקולה לא פלואורסצנטית זו מצטברת באופן תאי, והחמצון שלאחר מכן על ידי ROS מניב את DCF המוצר הפלואורסצנטי ביותר. החמצון של הגשושית הוא תוצר של פעולה של סוגים מרובים של ROS (peroxynitrite, רדיקלים הידרוקסיל, תחמוצת החנקן, או מי חמצן), אשר ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלי (פליטה ב 530 ננומטר עירור ב 485 ננומטר). המגבלה של טכניקה זו היא כי סופראוקסיד ומי חמצן אינם מגיבים בעוצמה עם H2DCF25,29. במאמר זה, אנו משתמשים בדיקה DCFH-DA כדי למדוד ולכמת ROS על ידי cytometry זרימה. מסיבה זו, אנו גורמים לייצור ROS על ידי גירוי MGCs עם ממריץ ROS, A או B, לפני טעינת התאים עם בדיקה פלואורסצנטית. בנוסף, אנו משתמשים בתרכובת נוגדת חמצון. לבסוף, אנו מציגים נתונים מייצגים ואמינים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: עבור קומפוזיציות מאגר ראה טבלה 1.

1. הכנה לתרבות התא

הערה: מתואר כאן הכנה תרבית של תאי MIO-M1, קו תאי גליה של מולר אנושי שהונצח באופן ספונטני (Moorfield's/ המכון לרפואת עיניים - מולר 1). תמיד להשתמש בטכניקה אספטית נכונה ולעבוד במכסה המנוע זרימה למינארית.

  1. הכן את המדיום המלא של הנשר (DMEM) של דולבקו. כדי DMEM המכיל 4.5 g / L D-גלוקוז ו 110 מ"ג / L נתרן פירובט, להוסיף 10% FBS מומת חום, 10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 50 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין. הכן את המדיום הטרי, ביום שבו תאי MIO-M1 יופשרו.
  2. להפשיר את תאי MIO-M1 הקפואים ביום 1.
    1. כדי לעשות זאת, להסיר את cryovial המכיל 5 x 105 5 MIO-M1 תאים ב FBS עם 10% DMSO מאחסון חנקן נוזלי ומיד למקם אותו לתוך אמבט מים 37 °C (37 °F).
      הערה: תמיד ללבוש מסכת פנים או משקפי בטיחות, שכן cryovials מאוחסן חנקן נוזלי להציג סיכון של פיצוץ בעת הפשרה.
    2. להפשיר את תאי MIO-M1 במהירות (בפחות מ 1 דקות) על ידי התחממות הבקבוקון באמבט מים 37 °C (37 °F) עד שיש רק קצת קרח עזב את הבקבוקון.
    3. מנגבים את החלק החיצוני של הבקבוקון עם 70% אתנול ומעבירים אותו למכסה מנוע לזרימה למינארית.
    4. מעבירים את התאים המופשרים מהבקבוקון לצינור סטרילי של 15 מ"ל ולאחר מכן מוסיפים 6 מ"ל של DMEM מלא שחומם מראש.
    5. צנטריפוגה ההשעיה התא בערך 600 x g במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, סופר-ננט ברור וכדור שלם יוצגו לעין. להשליך את supernatant עם פיפטה מבלי להפריע גלולה התא.
    6. נתק בעדינות את הכדור ו resuspend התאים ב 10 מ"ל של מדיום DMEM מלא. העבר השעיית תא זה לתוך צלחת תרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ ודגור הצלחת במשך כ 2 ימים ב 37 °C (37 °F), 5% CO2.
  3. כאשר תאי MIO-M1 הופכים ל- 80%-90% במפגש ביום 4, בצע את השלבים הבאים.
    1. מעבירים את הצלחת למכסה מנוע זרימה למינארי מהאינקובטור. הסר בזהירות את supernatant ולשטוף 2x עם 5 מ"ל של PBS סטרילי ומחומם מראש. לשאוף את PBS.
    2. חלוקת 1 מ"ל של 0.5% פתרון טריפסין-EDTA ודגור ב 37 °C (37 °F) בחממת CO2 במשך 3-5 דקות לנתק את התאים.
    3. הוסף 7 מ"ל של מדיום DMEM המלא כדי לעכב את פעולת הטריפסין. Disaggregate MGCs מקובצים באשכולות על ידי צנרת איטית למעלה ולמטה (P1000). לאסוף את ההשעיה התא בצינור 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה ב 600 x g במשך 5 דקות. זרוק את הסופר-טבעי. בעדינות resuspened את גלולה התא ב 2 מ"ל של מדיה מלאה DMEM. העבר 1 מ"ל של השעיית תא זו ללוח 100 מ"מ המכיל 9 מ"ל של מדיום DMEM מלא שחומם מראש.
    5. חזור על הפעולה עם צלחת 100 מ"מ נוספת. לדגור על הצלחת במשך כ 1 יום ב 37 °C (5% CO2 אינקובטור.
  4. כאשר שתי הצלחות הופכות 80%-90% יחד (ביום 6), להעביר את הצלחת לתוך מכסה המנוע זרימה למינארי. בצע את שלב 1.3. כדי להשיג גלולה תא.
  5. נתק בעדינות את הכדור והחזר את התאים ב-5 מ"ל של מדיית DMEM מלאה. לספור את תאי MIO-M1 באמצעות hemocytometer (תא Neubauer) ופתרון כחול טריפאן על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. שים את כיסוי הזכוכית על האזור המרכזי של תא נויבואר. מניחים את התא על משטח שטוח (למשל, שולחן או שולחן עבודה).
    2. ערבבו נפח שווה של כתם כחול טריפאן עם התאים. לדוגמה, לערבב 60 μL של כחול טריפאן עם 60 μL של תאים עבור דילול 1:2.
    3. מתערובת זו, לטעון 10 μL עם micropipette לתוך תא Neubauer.
    4. הנח את תא נויבואר הטעון על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הדליקו את האור והתאמו את הבהירות.
    5. הזז את שלב המיקרוסקופ למיקום אופטימלי והתאם את המוקד עד לקבלת תמונה חדה של התאים.
    6. לספור את התאים בתוך ארבעת הריבועים (מחולק ב 16) הממוקם בפינת hemocytometer (נפח: 0.1 מ"מ3 כל ).
    7. חשב את ריכוז התאים באמצעות המשוואות שלהלן.
      ריכוז = (מספר תאים x 10.000)/מספר ריבועים
      ריכוז = (מספר תאים x 10.000)/4
      ריכוז = מספר תאים x 2500
      הערה: אם מתבצע דילול התאים, יש להמיר את הריכוז המתקבל לריכוז המקורי לפני הדילול.
      ריכוז = (מספר תאים x 2500 x 2) = (מספר התאים x 5000 תאים / מ"ל)
    8. התאם את ההשעיה של התא ל-1 x 105 תאים/מ"ל במדיום DMEM מלא וצלחת 2 מ"ל של השעיית תא זה ללוח של 6 בארות (2 x 105 תאים/טוב). לנער את הצלחת בעדינות כדי להפיץ את התאים הומוגנית. דגירה צלחת 6-well לילה ב 37 °C (5% CO2 אינקובטור.

2. תנאים ובקרות בדיקה

  1. כלול את בקרות הניסוי הבאות עבור כל ניסוי:
    1. בקרת זרימה אוטומטית (תאים ללא בדיקה DCFH-DA, בקרה להגדרת הפרמטרים cytometer זרימה).
    2. שליטה בסיסית (תאים לא מגורשים).
    3. שליטה חיובית (תאים שטופלו במעודד ROS, A או B).
    4. שליטה שלילית (תאים שטופלו בתרכובת נוגדת חמצון)
    5. דגימה (תאים שטופלו בתרכובת נוגדת חמצון וממריץ ROS, A או B).

3. ביצוע הבדיקה

הערה: הבדיקה מבוצעת ביום 7. השתמש תמיד בטכניקה אספטית נכונה ועבוד במכסה המנוע של זרימה למינארית, אלא אם כן הונחה אחרת.

  1. הכן DMEM בסרום נמוך. תוספת DMEM המכיל 4.5 גרם / L D-גלוקוז ו 110 מ"ג / L נתרן פירובט עם 0.5% FBS מומת בחום, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 50 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין. הכינו את המדיום הטרי ביום שבו יטופל MIO-M1.
  2. מעבירים את הצלחת בעלת 6 הבארות (60%-70% מפגש) למכסה מנוע לזרימה למינארית מהחממה. לשאוף את supernatant ולשטוף את התאים 1x עם PBS. הוסיפו 2 מ"ל של ה-DMEM בסרום הנמוך לבאר ודגרו את הצלחת של 6 בארות למשך 2 שעות ב-37°C, 5% CO2. זה נעשה כדי להרעיב את התאים.
  3. לאחר רעב סרום, לטפל בתאים עם תרכובת נוגדת חמצון במשך 6 שעות.
    1. לשאוף את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של מלאי מדולל לתנאים הבאים: שליטה שלילית (תאים שטופלו עם תרכובת נוגדת חמצון) ודגימה (תאים שטופלו עם תרכובת נוגדת חמצון וממריץ ROS, A או B).
    2. דגירה צלחת 6-well במשך 6 שעות ב 37 °C (5° F), 5% CO2.
      הערה: אם אתם משתמשים בתרכובת נוגדת חמצון אחרת או במעכב ROS, יש לתקנן את הזמן והריכוז האופטימליים לגירויים.
  4. לאחר 6 שעות של דגירה, לטפל בתאים עם ממריץ ROS, A או B, במשך 30 דקות.
    1. הוסף את הגירויים לתנאים הבאים: שליטה חיובית (תאים שטופלו עם ממריץ ROS, A או B) ובארות מדגם (תאים שטופלו עם תרכובת נוגדת חמצון וממריץ ROS, A או B).
      הערה: שמור את פתרונות המלאי על קרח.
    2. דגירה צלחת 6-well במשך 30 דקות ב 37 °C (80 °F), 5% CO2.
      הערה: אם אתה משתמש במעודד ROS אחר, סטנדרטיזציה נכונה של הזמן והריכוז האופטימליים לגירויים.
  5. טען את התאים עם בדיקה DCFH-DA.
    1. לשאוף את supernatant ולשטוף את התאים בצלחת 6-well 3x עם PBS כדי להסיר את כל הגירויים.
    2. כבה את האור של מכסה המנוע לזרימה למינארית ועבוד בחושך. הכן דילול של 1:1000 של 5 mM DCFH-DA פתרון מלאי בדיקה כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מיקרומטר DCFH-DA ב- DMEM ללא אדום פנול בצינור 15 מ"ל.
    3. מערבבים בעדינות באמצעות מערבולת ומוסיפים 1 מ"ל של פתרון זה לבארות הבאות: שליטה בסיסית (תאים לא מגורה), שליטה חיובית (תאים שטופלו במעודד ROS), שליטה שלילית (תאים שטופלו בתרכובת נוגדת חמצון) ובארות לדוגמה (תאים שטופלו בתרכובת נוגדת חמצון, ומעודד ROS, A או B).
    4. הוסף 1 מ"ל של DMEM ללא אדום פנול לתאי בקרת autofluorescence.
    5. דגירה צלחת 6-well במשך 30 דקות ב 37 °C (80 °F), 5% CO2.
      הערה: הגשוש רגיש לאור. השלך את כל פתרון הבדיקה שאינו בשימוש.

4. הכנת תאים לציטומטריית זרימה

  1. לאחר 6 שעות, לשמור את הצלחת על קרח. משלב זה ואילך, אין צורך להשתמש בטכניקה אספטית נכונה ולעבוד במכסה המנוע של זרימה למינארית.
  2. לשטוף את התאים 3x עם 2 מ"ל של PBS קר לבאר. הוסיפו 0.5 מ"ל של חיץ ניתוק קר לכל באר. לקצור את התאים על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000.
  3. לאסוף אותם בצינורות מסומנים 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 600 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).
    הערה: בעת קצירת התאים, הימנעו מהיווצרות בועות על-ידי הגדרת פיפטת P1000 ל-0.4 מ"ל. ממדרגה זו ואילך, עבוד מהר.
  4. כאשר צנטריפוגה מסתיימת, לשים שכותרתו צינורות 1.5 מ"ל עם התאים על קרח. להשליך את supernatant בזהירות בעדינות לנתק את גלולה התא עם הקשה.
  5. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS לכל צינור 1.5 מ"ל מסומן כדי לשטוף את התאים. במידת הצורך, השתמש במערבולת בעוצמתה הנמוכה ביותר לניתוק מלא של גלולה התא. צנטריפוגה אותם ב 600 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). חזור על שלבים אלה פי 2 יותר. (בצע שלוש שטיפות בסך הכל).
  6. כאשר הכביסה האחרונה מסתיימת, תווית 5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים תחתית (צינורות cytometry זרימה) עבור כל התנאים הניסיוניים (ראה שלב 2.).
  7. כאשר צנטריפוגה מסתיימת, resuspend כדורי התא ב 200 μL של מאגר FACS. נתק בעדינות את הכדור בכל צינור 1.5 מ"ל באמצעות מערבולת. מעבירים לצינורות עגולים עם תווית של 5 מ"ל. שמור את הצינורות על קרח עד שהם מנותחים על cytometer הזרימה.

5. רכישת נתונים בציטומטר זרימה

  1. באמצעות תוכנת ציטומטריית הזרימה, צור ניסוי חדש. לשם כך, בשורת התפריטים עבור אל ניסוי ולחץ על ניסוי חדש (Ctrl+E).
  2. כמו כן, בשורת התפריטים, עבור אל תצוגה ולחץ על האפשרויות הבאות: סרגל כלים, שורת מצב, דפדפן, Cytometer, מפקח, גליון עבודה, לוח מחוונים לרכישה ועורך דו-הסברתי כדי לראות חלונות אלה בסביבת העבודה.
  3. בצד שמאל של התוכנה, לחץ על Specimen_001 . זה יפתח רשימה של צינורות (Tube_001, Tube_002 וכו '). כדי לתייג את הצינורות עבור הפקדים ותנאים ניסיוניים שונים, לחץ פעמיים על Tube_001, Tube_002 וכו 'ושנה את שמם (ראה שלב 2.).
  4. בחר את הערוצים/ הפרמטרים שיש לנתח (FSC, SSC, FITC ו- APC או כל פלואורוכרום אחר כדי לראות את הרביע) בצינור הראשון מהגדרות Cytometer של הניסוי.
  5. לחץ על סמל מצביע הצינור הנוכחי כדי לבחור את הצינור, והסמל ישתנה לירוק. הנח את צינור "בקרת הזרימה האוטומטית" על זרוע השאיפה, והזז את הבסיס בזהירות רק שמאלה.
    1. כדי להפעיל את המדגם "בקרת זרימה אוטומטית", עבור אל החלון לוח מחוונים של רכישה ולחץ על קבל נתונים. פתח מתווה נקודה עבור FSC (על ציר ה- x) לעומת SSC (על ציר ה- y).
    2. התאם את מתח הפיזור קדימה והצד במהירות כדי להבטיח שהאירועים יופיעו בגרף. בחלון לוח המחוונים של הרכישה, לחץ על הפסק רכישה. בניסוי זה, הגדרות המתח הבאות שימשו: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
  6. כדי להגדיר את מתח FITC, הפעל את "השליטה החיובית (תאים שטופלו במעודד ROS, A או B)". התאם את המתח כך שכל האירועים יופיעו על היסטוגרמה של FITC. במקרה זה, השתמש במתח של 280 V. בחלון לוח המחוונים של הרכישה, לחץ על הפסק רכישה.
  7. מניחים שוב את צינור "בקרת הזרם האוטומטי" על זרוע השאיפה. בחלון לוח מחוונים של רכישה, לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן רשום נתונים ובחר את תנאי העצירה הרצויים (לדוגמה, 50,000 אירועים). צייר שער סביב התאים המעניינים, למעט תאים מתים ופסולת.
    הערה: אירועים אלה נצפים כאירועים קטנים בהרבה מאוכלוסיית התאים העיקרית ומופיעים בפינה השמאלית התחתונה של העלילה.
  8. כאשר הרכישה מסתיימת, להסיר את הצינור מזרוע השאיפה. הציוד ישטוף את עצמו. בחלון לוח מחוונים של רכישה, לחץ על הצינור הבא והפעל את הפקד הבסיסי (תאים לא מגורים). לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן הקלט נתונים.
    1. מהשער ההתחלתי (שער שאינו כולל את התאים המתים והפסולת), צור תרשים נקודות נוסף של FITC (על ציר ה- x) לעומת APC (על ציר ה- y). צייר שער רבעים והתאם את הקואורדינטות כדי לדמיין את האירועים ברביע השמאלי התחתון של חלקת FITC לעומת APC.
  9. להקלטת הדגימות הבאות, הסר את הצינור ולחץ על הצינור הבא > קבל נתונים > נתוני הקלטה.
    הערה: ציטומטר הזרימה המשמש כאן (ראה טבלת חומרים) מתעד לכל היותר 1 x 106 אירועים לכל צינור.
  10. כאשר ההקלטה של כל הצינורות מסתיימת, יצא את הנתונים לדיסק D. לשם כך, לחץ על קובץ > יצא קבצי > FCS > בחר גירסה 3.0 או 3.1.
    הערה: למרות שרכישת נתונים באמצעות תוכנה אחת (ראה טבלת חומרים) מתוארת בפירוט בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש בכל תוכנה אחרת של ציטומטריית זרימה. ניתן להגדיר את פרמטרי הרכישה (FSC, SSC ו- FITC) באותו אופן כדי להשיג את התוצאות.

6. ניתוח הנתונים שנרכשו

  1. פתח את התוכנה והוסף את הדוגמאות באמצעות לחצן הפעולה הוסף דוגמאות ; הוא ממוקם בשורת המשימות או ברצועת הניווט.
    1. לחץ על הוסף דוגמאות.
    2. באמצעות דפדפן הקבצים, נווט אל התיקיה Experimental.
    3. בחר את התיקיה הניסיונית ולחץ על בחר.
      הערה: הקבצים לדוגמה נטענים כחלק מהקבוצה "כל הדוגמאות" לסביבת העבודה.
  2. לחץ פעמיים על הדוגמה הראשונה בסביבת העבודה: בקרת פלואורסצנטיות אוטומטית.
    הערה: פעולה זו פותחת חלון גרף המתווה אירועים לאורך פיזור קדימה (FSC-A על ציר ה- x) לעומת פרמטרים של פיזור צד (SSC-A בציר y).
  3. צייר שער מצולע כדי לבודד את התאים המעניינים, למעט תאים מתים ופסולת.
    1. לחץ על הכלי שער מצולע .
    2. לחץ בתוך העלילה כדי ליצור את שער המצולע. הפוך צדדים רבים ככל הנדרש.
    3. לחץ פעמיים בנקודה האחרונה כדי לסגור את המצולע וליצור את השער הרצוי.
    4. ספק שם עבור השער, כגון "תאי MIO-M1", ולחץ על אישור.
      הערה: מופיע חלון התוויית תרשים חדש המציג רק את אירועי MIO-M1 ללא תאים מתים ופסולת.
    5. חזור על הפעולה עם כל הדגימות כדי לנתח.
  4. שנה את העלילה להיסטוגרמה. לשם כך, לחץ על תווית הפרמטר ציר X ובחר FITC-A. לחץ על תווית הפרמטר ציר Y ובחר היסטוגרמה. זה משנה את העלילה להיסטוגרמה חד-ממדית.
  5. הוסף סטטיסטיקה באמצעות חלון הוספת סטטיסטיקה.
    1. מתחת לגרף ההיסטוגרמה, לחץ על הוסף סטטיסטיקה. התוכנית תפתח חלון סטטיסטיקה חדש.
    2. בצד שמאל של החלון החדש בחר את הסטטיסטיקה ממוצע גיאומטרי.
    3. בחר את התאים אוכלוסיה MIO-M 1.
    4. מתוך רשימת הפרמטרים הזמינים, בחר FIT-C.
    5. לחץ על לחצן הוסף כדי להחיל אותם על הניתוח.
      הערה: פעולה זו יוצרת את הנתונים הסטטיסטיים החדשים "ממוצע גיאומטרי: FITC" בעץ הגיטינג לדוגמה, והערכים שלהם מוצגים בסביבת העבודה שלך.
  6. שים את הערכים הגיאומטריים האלה בתוכנית סטטיסטיקה וניתח.
  7. לחץ על סמל L כדי לפתוח את עורך הפריסה; סמל זה נמצא בכרטיסיה תפריט בסביבת העבודה. מקם את חלון סביבת העבודה ואת עורך הפריסה זה לצד זה.
    הערה: עורך הפריסה הוא חלון סביבת עבודה מופרד עם כלים להצגת התוויות גרפיות וסטטיסטיקות מרובות בדוח גרפי פשוט. זה יכול להיות מיוצא עם קובץ הסיומת שאתה מעדיף, כמו PDF או JPG, בין היתר.
    1. מעץ הניצוץ של דוגמה בחלון סביבת העבודה, גרור את אוכלוסיית התאים MIO-M 1 לתוך עורך הפריסה.
    2. ודא שגרף היסטוגרמה המכיל את האירועים בשער מוצג בעורך הפריסה. מידע בסיסי נוסף יפורט בתיבת טקסט להלן.
    3. גרור את כל הדגימות כדי להשוות אותן באותו גרף. התוכנית תחפוף ביניהם.
    4. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על גרף ההיסטוגרמה ובחר מאפיינים. התוכנית תפתח חלון הגדרת גרף חדש. חלון זה כולל ארבע כרטיסיות (ביאור, גופנים, מקרא וציון). לחץ על הכרטיסיה ציין ושנה את ציר ה- y מ'אוטומטי' ל'מודאלי'. לחץ על החל.
    5. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המדגם ושנה את צביעה, סגנון קו, עובי קו וכו 'כדי להתאים אישית את התרשים.
    6. כדי לייצא את התמונה, לחץ על הכרטיסיה קובץ ומיד לאחר מכן בחר שמור תמונה ברצועת המסמך. בחרו את הסוג המועדף של קובץ התמונה (לדוגמה, PDF).
      הערה: נפתחת תיבת דו-שיח לשמירה, המבקשת ממך לבחור מיקום שמירה. לחץ על שמור.
  8. שמור את הניתוח כקובץ סביבת עבודה ( .wsp).
    1. בפינה הימנית העליונה, לחץ על סמל ניתוח ציטומטריה ובחר שמירה בשם.
    2. בחר שמור כסביבת עבודה (WSP) כדי לשמור את המסמך בנתונים וניתוח.
    3. הזן שם עבור קובץ סביבת העבודה.
    4. לחץ על שמור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, הראינו נתונים מייצגים וכמותיים המדגימים זיהוי ציטומטריית זרימה של ייצור ROS עם בדיקת פלואורסצנטיות DCFH-DA מתאי MIO-M1 מגורה עם ממריץ ROS, A או B. כצפוי, ראינו שינויים בפלואורסצנטיות FITC בתאים לא מגורים מעל רמות ההפלורציה האוטומטית (איור 1A, השווה בין "שליטה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מספר מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, מחלות דלקתיות, איסכמיה/רפרטפוזיה, מחלות לב איסכמיות, סוכרת ורטינופתיות, וגם מצבים פיזיולוגיים כמו הזדקנות, מובילים לייצור יתרשל ROS 6,7,8,9,10,111. לכן, אי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות למריה פילאר קרספו ופאולה אלחנדרה עבאדי מ- CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, קורדובה, ארגנטינה) על הסיוע בציטומטריית זרימה וגבריאלה פורלן ונוליה מלדונאדו לסיוע בתרבות התא. אנו מודים גם לויקטור דיאז (פרו-מזכיר התקשורת המוסדית של FCQ) על הפקת הווידאו והעריכה.

מאמר זה מומן על ידי מענקים מ Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), and Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-DCFH-DASigma35845-1G
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Gibco by life technologies15630-080
BD FACSCanto II flow cytometerBD BiosciencesFACSCanto
BD FACSDiva softwareBD Biosciences
Cell Culture Dishes 100x20 mmCell Star- Greiner Bio-One664 160
CentrifugeThermoSorvall legend micro 17 R
Centrifuge Tubes (15 ml)BIOFILCFT011150
Centrifuge Tubes (50 ml)BIOFILCFT011500
CryovialCRYO.S - Greiner Bio-One126263
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichW387520-1KG
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrateMerck106575
DMEM without phenol redGibco by life technologies31053-028
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Gibco by life technologies11995065
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, DihydrateMerck324503
Fetal Bovine SerumInternegocios
FlowJo v10 SoftwareBD Biosciences
GlucoseMerck108337
hemocytometer, Neubauer chamberBOECO,Germany
Laminar flow hoodESCOAC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX)Gibco by life technologiesA12860-01
MitoSOX RedInvitrogen M36008
Penicillin/StreptomycinGibco by life technologies15140-122
Potassium ChlorideMerck104936
Potassium-dihydrogen phosphateMerck4878
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)Falcon - CorningBD-352008
Sodium AzideMerck822335
Sodium ChlorideMerck106404
Sodium HydroxideMerck106462
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 mlTarson500010-N
Tissue Culture Plate 6 wellBIOFILTCP011006
Trypan BlueMerck111732
Trypsin-EDTA 0.5% 10XGibco by life technologies15400-054
Vortex MixerLabnet International, Inc.

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  3. Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  4. Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
  5. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
  6. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
  7. Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
  8. Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43(2017).
  9. Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
  10. Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
  11. Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
  12. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  13. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  14. Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
  15. Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199(2019).
  16. Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
  17. Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
  18. Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
  19. Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
  20. Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
  21. Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
  22. Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
  23. Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
  24. Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
  25. Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
  26. Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).
  27. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).
  28. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  29. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  30. Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
  31. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  32. Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved