גישת הדמיה תוך-חיונית פלואורסצנטית לחקר דינמיקת איתות סידן הנגרמת על ידי עומס באוסטאוציטים של עכברים

Summary

המאמר הנוכחי מתאר ביצוע גישת הדמיה תוך-חיונית כדי לצפות באיתות סידן המושרה מכנית של אוסטאוציטים משובצים in vivo בזמן אמת בתגובה לעומס מכני ברמת הרקמה של המטטרסל השלישי של העכבר.

Abstract

רקמת העצם רגישה להפליא להבדלים בגודל העומס המכני. אוסטאוציטים, תאים דנדריטיים היוצרים סינציטיום בכל העצם, אחראים על התפקוד המכנו-סנסורי של רקמת העצם. מחקרים המשתמשים בהיסטולוגיה, מודלים מתמטיים, תרביות תאים ותרביות איברי עצם ex vivo קידמו מאוד את ההבנה של מכניוביולוגיה של אוסטאוציטים. עם זאת, השאלה הבסיסית כיצד אוסטאוציטים מגיבים ומקודדים מידע מכני ברמה המולקולרית in vivo אינה מובנת היטב. תנודות בריכוז הסידן התוך-תאיות באוסטאוציטים מציעות מטרה שימושית ללמידה נוספת על מנגנוני טרנסדוקציה מכניים חריפים של העצם. כאן, אנו מדווחים על שיטה לחקר מכניוביולוגיה של אוסטאוציטים in vivo, המשלבת זן עכבר עם אינדיקטור סידן מקודד גנטית פלואורסצנטי המתבטא באוסטאוציטים עם מערכת העמסה והדמיה in vivo כדי לזהות ישירות את רמות הסידן האוסטאוציטים במהלך ההעמסה. זה מושג באמצעות מכשיר כיפוף תלת-נקודתי שיכול לספק עומסים מכניים מוגדרים היטב למטטרסל השלישי של עכברים חיים ובמקביל לנטר תגובות סידן פלואורסצנטיות של אוסטאוציטים באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. טכניקה זו מאפשרת תצפית ישירה in vivo על אירועי איתות סידן אוסטאוציטים בתגובה לעומס עצם שלמה והיא שימושית במאמץ לחשוף מנגנונים במכניוביולוגיה של אוסטאוציטים.

Introduction

מטריצת העצם מאורגנת על פי דרישה מכנית ^1,2 ויכולה להשתנות באופן דינמי כדי להסביר דרישות מכניות משתנות ^3,4,5. עבודה מכוננת על המנגנון המכני-סנסורי בעצם פורסמה כמאמר מודלים לפני כ-30 שנה ^6,7,8, שם הוצע כי אוסטאוציטים המוטמעים בתוך רקמת חישת העצם מרימים עיוות מכני באמצעות תנועת נוזלים בסביבתם המקומית. מודל זה אומת בניסוי בניסויים במבחנה ובניסויים מחוץ לגוף, שם הוכח בבירור כי אוסטאוציטים רגישים למדי למכניקה 1,2,3,4,5,6 וגם מבטאים ציטוקינים, המכוונים את התנהגותם של אוסטאובלסטים בוני עצם 7 ואוסטאוקלסטים ^{8,9,10, 11,12}.

איתות סידן הוא שליח שני בכל מקום שהוקם כדמות מרכזית ויעד ניסוי אמין במכניוביולוגיה של אוסטאוציטים 13,14,15,16. לאיתות סידן יש יתרון בכך שהוא נחקר באופן נרחב בביולוגיה של התא¹⁷, מה שאומר שיש הרבה ידוע על ההשפעות שלו במורד הזרם ועל הכלים הפלואורסצנטיים המתאימים הזמינים לתצפית ניסויית. ניתוחים במבחנה השתמשו באיתות סידן כאמצעי לזיהוי הפעלה מכנית של אוסטאוציטים ואפיון התנהגות איתות דינמית ^5,18,19. יש לציין כי תצפית על איתות סידן בקו תאי אוסטאוציטים סיפקה ראיות חותכות לכך שהפעלת נוזלים בחיבורי האינטגרין לאורך תהליך התא היא ככל הנראה הצורה העיקרית של הפעלת זרימת נוזלים²⁰. מחקר זה הוא אחד מני רבים המציגים את התועלת של איתות סידן. הוא מושרה באופן אמין עם הפעלה מכנית של אוסטאוציטים ובכך משמש כמטרה רבת עוצמה לחקירת מכנוביולוגיה של אוסטאוציטים.

התמרה מכנית של אוסטאוציטים in vivo תלויה מאוד במיקרו-סביבה המיידית שלהם. חלבונים קושרי מטריצה (למשל, פרוטאוגליקנים, אינטגרינים) מספקים חיבורים פונקציונליים בין ממברנות התאים האוסטאוציטים בסידור שהוא קריטי להפעלת נוזלים של התא^21,22. בעוד שניתוחים דו-ממדיים (2D) במבחנה מועילים, הם מוגבלים בכך שהם אינם משלבים את התכונות התלת מימדיות הקריטיות (3D) הללו. תכשירים מחוץ לגוף של איתות סידן אוסטאוציטים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית שפכו מעט אור על האופן שבו אוסטאוציטים מגיבים תוך שמירה על המטריצה שמסביב שלמה^13,16. עם זאת, הסרת אספקת הדם מהעצם נחשבת כמשנה את החומרים המזינים ואת דינמיקת הנוזלים של המערכת הלקונו-תעלית. חקירה של מכאנוביולוגיה של אוסטאוציטים דורשת חקירה in vivo של איתות אוסטאוציטים המושרה על ידי עומס.

חקירה in vivo של תאים משובצים בעצם עוכבה במידה רבה על ידי המגבלות של טכניקות הדמיה מסורתיות, כגון שדה בהיר ומיקרוסקופיה קונפוקלית. אוסטאוציטים ממוקמים במטריצה מינרלית²³ המורכבת מהידרוקסיאפטיט, קולגן מסוג 1 וחלבונים אחרים שאינם קולגניים המגבילים את הנגישות האופטית²⁴ והופכים את החקירה in vivo למאתגרת מבחינה טכנית. עם זאת, ההתקדמות האחרונה בהדמיה פלואורסצנטית לא ליניארית ומדווחי סידן מקודדים גנטית מציגים את ההזדמנות להתגבר על אתגרים אלה.

כאן, אנו מדווחים על גישה חדשה עם היכולת לדמות אוסטאוציטים in vivo כדי למדוד איתות סידן ברזולוציה של רמת התא²⁵. זה מושג על ידי שימוש בסמן פלואורסצנטי דינמי באמצעות אינדיקטור סידן מקודד גנטית בפעם הראשונה באוסטאוציטים של עכברים. עכברים עם ביטוי ממוקד אוסטאוציטים מונע DMP1-Cre של GCaMP6f מציגים פלואורסצנטיות גלויה באוסטאוציטים בכל קליפת המוח הדיאפיזיאלית של מטטרסלים של עכברים^17,26. אנו משתמשים במערכת כיפוף תלת-נקודתית על מנת ליישם רמות פיזיולוגיות של עוצמת מתח בין 250-2,000 με²⁷. טכניקה זו מאפשרת הדמיה in vivo של דינמיקת איתות סידן אוסטאוציטים במהלך העמסה מכנית של העצם כולה ויכולה להיות שימושית לכל מי שמבקש להבין מכאנוביולוגיה של אוסטאוציטים. שיטה זו תתאים לחוקרים המבקשים להרחיב את עבודתם מניתוחים במבחנה ליישומי in vivo, במיוחד תוך שמירה על ניתוחים מולקולריים מבוססי תפקוד (כלומר, חקירת פעילות תאית באמצעות איתות סידן) בניגוד למחקרי פנוטיפ רחבים.

Protocol

כל השיטות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קורנל.

1. הכנת חומרים וציוד

1. תכנן ובנה את מכשיר הטעינה המטטרסלית לשימוש עם מיקרוסקופ מולטיפוטון עילי.
   הערה: פרטים על מפרטי הרכיבים ופעולת ההתקן מתוארים בתיעוד המשלים של מחקר קודם²⁵. בקצרה, הרכיבים העיקריים מורכבים ממפעיל בסדרה עם תא עומס ותושבת טעינה, אמבט מים וסיכת נקודת משען. ניתן להשיג את המפעיל ותא העומס באופן מסחרי והם אמורים להיות מסוגלים להכיל עומסים של עד 300 גרם. אמבט המים, סיכת נקודת המשען ותושבת העומס צריכים להיות בנויים מטיטניום או נירוסטה. ניתן לייצר אותם בבית או באופן מסחרי באמצעות הדפסת מתכת תלת מימדית.
2. כייל את ערכי גודל המתח לתזוזה של המפעיל מראש עבור קבוצות עכברים בודדות (כלומר, מין, טיפול, גנוטיפ). זה נעשה באמצעות מיפוי מתח פני השטח בהליך שתואר במחקר קודם²⁵.
3. השתמש בעכברים עם רקע C57BL/6, בגילאי 16-18 שבועות, המבטאים מבנים של אינדיקטור סידן פלואורסצנטי באוסטאוציטים. ביטוי ממוקד של אוסטאוציטים מושג על ידי הכלאה של עכברי GCaMP6f ו-Dmp1-Cre המופעלים על ידי פלוקס. הפרטים של אסטרטגיות רבייה וספקים של עכברים מייסדים מתוארים במחקר שפורסם בעבר²⁵.
4. עקר את כל הכלים הכירורגיים, תושבת העומס, אמבט המים וסיכת נקודת המשען באמצעות חיטוי (57.2 מעלות צלזיוס, 15 psi, 3-4 דקות). חיטוי מטרות מיקרוסקופ עם 100% אתנול.
5. הפעל רכיבים אלקטרוניים, כולל מקור לייזר, מיקרוסקופ, תא עומס ומפעיל. אפשר 15-20 דקות לכל רכיב להתחמם לפני הדמיה תוך-חיונית.
   1. ודא שרכיבי המפעיל ותא העומס מחוברים ומופעלים בהתקן הבקרה. צור את תוכנת הבקרה עם מגוון פלטפורמות, כולל Matlab, LabView ו-Python, בהתאם להעדפות המשתמש. קוד ה-Matlab העיקרי המשמש במחקר זה נקרא Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (בתוך תיקיית MT3 Loading Device Control Software.zip קובץ משלים 1).
      הערה: רוב מערכות המיקרוסקופ הדו-פוטוני הזמינות מסחרית מגיעות עם תוכנת הדמיה חזקה. המאפיינים העיקריים הנדרשים לשיטה זו הם היכולת לכוון לייזר לעירור המתאים ל-GCaMP6f (920 ננומטר), היכולת להתאים את עוצמת הספק הלייזר ואיסוף סדרות זמן בתדר של לפחות 6 הרץ. לפני הניסוי, יש לאשר חיבור לייזר לתוכנת ההדמיה וסידור נתיב האור המתאים להדמיה דו-פוטונית. זה מאושר בדרכים שונות בהתאם להגדרת ההדמיה. בדרך כלל, יש מחוון אור.

2. ניתוח

1. הכינו שלב כירורגי ועקרו את פני השטח עם 70% אתנול. ודא כי נעשה שימוש בטכניקות אספטיות לאורך כל ההליכים הכירורגיים. שמור על רמת הניקיון הנדרשת לפרוטוקול זה, מכיוון שמדובר בהליך סופני.
2. להרדים את העכבר עם איזופלורן מאודה מעורבב עם אוויר או חמצן ברמה רפואית בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה. בצע הרדמה ראשונית בתא אינדוקציה של מכרסמים עם 3%-5% איזופלורן. שמור על הרדמה של 1%-2.5% איזופלורן בקונוס האף להליכי הדמיה כירורגיים ותוך חיוניים.
3. הנח מכשיר חימום מתחת או ליד העכבר כדי לסייע בשמירה על טמפרטורת גוף הליבה ההומאוסטטית. עקוב אחר טמפרטורת הגוף של העכבר, קצב הלב וריווי החמצן לאורך כל הניתוח. שמרו על קצב הנשימה בין 60-80 נשימות לדקה ושמרו עליו על ידי התאמת מינון האיזופלורן.
4. הנח את העכבר במצב שכיבה. אשר את עומק ההרדמה לפני החתך באמצעות צביטה בבוהן. זהה את המיקום בין המטטרסל השני והשלישי. בצע חתך אזמל דרך הדרמיס בין המטטרסל השני והשלישי, החל מהקצה הדיסטלי והתקדם באופן קרוב לאורך העצמות (~5 מ"מ).
   הערה: המטטרסלים דיסטליים לעצמות הקרסול בכפה ועוקבים ישירות קרוב לפלנגות הדיסטליות. הם מורכבים ממטטרסלים (מדיאליים לרוחביים) I, II, III, IV ו-V. המטטרסל השלישי מרוכז באמצע ההיבט הוולארי של הכפה האחורית.
5. בעזרת מלקחיים, פתח את אתר הניתוח על ידי משיכת העור לכיוון הקצוות המדיאליים/רוחביים. כרתו את הגידים המאריכים באמצעות מספריים ישרים של Vannas כדי לחשוף את המטטרסל השלישי.
6. הכנס את סיכת נקודת המשען המרכזית של מכשיר הטעינה של המטטרסל מתחת למטטרסל השלישי.
   1. בתחילה, הכנס את הסיכה לחלל הקטן בקצה הדיסטלי שבו המטטרסל השלישי פוגש את הפלנגה הפרוקסימלית ולאחר מכן הזז את הסיכה קרוב עד שהיא נחה באמצע הפיר של המטטרסל השלישי.
   2. הקפד במיוחד להבטיח ממשק ישיר בין העצם לסיכה, למעט כל שריר ופנים. זה קריטי להדמיה יציבה במהלך פרוטוקולי טעינה.
7. החזק את הקרסול עם מלקחיים והנח את כף הרגל לתוך אמבט המים המלא בפוספט (DPBS) של Dulbecco (8-10 מ"ל). אבטח את הכפה במקומה עם תושבת הטעינה וחבר את התושבת לסידור המפעיל/תא העומס. הכנה וסידור כירורגי שהושלם בתוך המכשיר מוצג באיור 1.

3. הדמיה

הערה: למערך המיקרוסקופיה השלם של שני פוטונים המשמש בפרוטוקול זה יש שתי חבילות תוכנה: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 עבור הלייזר (איור 2) ו- ThorImageLS4.0 עבור המיקרוסקופ (איור 3). כדי לצלם על שני הפוטונים, לחץ על Live (איור 3, כפתור הפעלה כחול). בעת ביצוע ניסוי להדמיה ושמירת נתונים, לחץ על לכידה (איור 3, הכרטיסייה בחלק העליון, ליד הגדרת לכידה). אלה ספציפיים לציוד ולספקים המשמשים בניסוי זה, אך חלופות רבות עם המפרט הדרוש הנמצא בפרוטוקול זה (אורכי גל עירור, גודל חלון ניתן לצפייה, קצב לכידת תמונה וכו') יעבדו גם כן.

1. הרם בזהירות רבה את מערך התקן הטעינה עם העכבר והנח אותו על פלטפורמת המיקרוסקופ.
2. התחל עם מטרת הגדלה נמוכה במצב אפיפלואורסצנטי (איור 3, תפריט נפתח בחלק העליון עם בחירות Multiphoton או Fluorescence Setup) כדי לאתר ולמרכז את אמצע הדיאפיזה של העצם.
3. לאחר איתור אזור מעניין, עבור להגדלה אובייקטיבית גבוהה יותר של טבילה במים (20x-40x) והעביר את האופטיקה לשני פוטונים (איור 3, תפריט נפתח למעלה עם בחירות Multiphoton או Fluorescence Setup).
   הערה: שדה הראייה המומלץ הוא לפחות 250 מיקרומטר x 250 מיקרומטר לפעילות סלולרית וניתן להשיג אותו באמצעות זום אופטי או דיגיטלי בהתאם למערכת ההדמיה.
   1. צפיפות הפיקסלים המינימלית המתאימה היא 512 פיקסלים x 512 פיקסלים. כדי להגדיר את צפיפות הפיקסלים, השתמש בהגדרות Galvo/Resonance Area Control (איור 3).
   2. בעת מציאת ההחזר על ההשקעה, הימנעו מפוטו-הלבנה על ידי הפחתת ההספק באמצעות אפשרות בקרת ההספק (איור 3,) והגדלת ה-PMT ampלהגברה בהגדרות בקרת סורק Galvo/תהודה (איור 3).
   3. זהה את פני העצם במצב דו-פוטוני על ידי חיפוש האוטו-פלואורסצנטי הסיבי periosteum בתעלה הירוקה המשתמשת במסנן פס פס שמרכזו 525 ננומטר.
      הערה: האוטו-פלואורסצנציה נראית ביותר עם אורך גל העירור ב-1,000 ננומטר אך זמינה גם בעירור של 920 ננומטר (איור 3, בקרת לייזר רב-פוטונית). ציון דרך זה חשוב לקביעת העומק היחסי של ה-ROI לקליפת המוח המטטרסלית בעת התבוננות באוסטאוציטים. יש לציין כי במהלך ניסויים בסדרות זמן, העומק המדויק של המטוס המצולם אינו נרשם, אם כי הוא נוטה לנוע בין 15-30 מיקרומטר. אם רוצים מדידות עומק מדויקות, יהיה צורך לבצע ערימת z.
4. הפעל סיבוב טעינת מבחן כדי להבטיח שההכנה והמיקום הכירורגיים בתוך מכשיר הטעינה היו יעילים בהשגת שדה ROI יציב (כלומר, ללא תזוזה של מישור z). בקצרה, הפעל מחזור העמסה כדי להעריך את יציבות התכשיר הכירורגי. בצע טעינה על ידי הפעלת הקטע הפעל את סרוו והעבר בקוד Matlab.
   1. החל עומס טרה קטן. ודא כי פרוטוקולי טעינת גלי ההברסין המתאימים מוכנים מבעוד מועד. הזן פרמטרי טעינה מתאימים שהתקבלו במהלך הכיול בסעיף 1.2. בצע טעינה על ידי הפעלת הקטע הפעל את סרוו והעבר בקוד Matlab.
   2. אם יש תנועה נראית לעין של התאים על המסך, הנובעת ממיקרו-תנועה של העצם בתגובה לטעינה או נשימה, בחר החזר ROI שונה לאורך כיווני y או z כדי להבטיח שהוא נמצא ישירות מעל סיכת נקודת המשען המרכזית. אם התנועה נמשכת, כוונן את המיקום הכירורגי של הסיכה באופן ידני מתחת למטטרסל השלישי.
      הערה: אזור עניין טוב (ROI) הוא אזור שבו התאים אינם נעים פנימה והחוצה מהמישור/מיקוד. ניתן לכוונן את התנועה בכיווני x ו-y לעיבוד שלאחר שימוש בתוסף התאמת התבניות ב-ImageJ.
5. בצע הדמיית z-stack או t-series עם טעינה בהתאם לתכנון הניסוי כדי לתעד אירועי איתות מורפומטריים או דינמיים המושרים על ידי עומס, בהתאמה.
   1. הגדר את אורך גל העירור עבור מחוון הפלואורסצנט (למשל, 920 ננומטר עבור GCaMP6f). עבור z-stack, השתמש ברזולוציה נמוכה מספיק כדי ללכוד תכונות של האוסטאוציטים, כגון צעדים של 0.25-1 מיקרומטר. עבור סדרה t, השתמש בהגדרות כדי לדגום לפחות פי 6 מקצב הטעינה. עבור קצב טעינה של 1 הרץ, הדמיה ב-6 פריימים לשנייה (FPS) מייצגת את קצב הלכידה המינימלי המתאים (איור 3, בקרת סורק Galvo/תהודה).
   2. לטעינה והדמיה חיה, אסוף נתוני בסיס לא טעונים בכל סיבוב. במחקר זה, עדיפות 60 שניות של הדמיה לא טעונה ואחריה 60 שניות של טעינה והדמיה. תכנן את פרוטוקולי הטעינה וההדמיה בהתאם. כדי לאסוף נתונים, לחץ על לכידה (איור 3, הכרטיסייה בחלק העליון, ליד הגדרת לכידה).
      1. תקופת העקשן לתגובת איתות סידן מלאה בתאי העצם מוערכת בכ-15 דקות²⁸. המתן לפחות כל כך הרבה זמן בין התקפי טעינה רציפים בעת איסוף נתוני איתות דינמיים.
      2. לאורך כל הניסוי, אל תשאירו את החיה ללא השגחה כדי להבטיח שהיא לא תתעורר באופן בלתי צפוי מההרדמה או תחווה מצוקה ללא אפשרות להתערבות.
         הערה: המתת חסד בסוף ההליך צריכה להתבצע באמצעות פריקת צוואר הרחם או אמצעים מתאימים אחרים בהתאם לשיטות שאושרו על ידי IACUC. זהו פרוטוקול שאינו הישרדותי, כלומר כל בעלי החיים מורדמים לאחר ההדמיה.

תוצאות

כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה לחקר איתות סידן באוסטאוציטים משובצים in vivo באמצעות הכנה כירורגית חריפה והדמיה פלואורסצנטית מרובת פוטונים. ניתן לצפות באות פלואורסצנטי ירוק ממדדי סידן מקודדים גנטית באוסטאוציטים באמצעות ביטוי DMP1-Cre. איור 4 הוא תמונ?...

Discussion

קשה לחקור אוסטאוציטים באופן ניסיוני בגלל מיקומם המוטבע במטריצת הרקמה הקשה, אליה הם מתדרדרים במהירות או מתבדלים עם הסרת נישה זו. חקר אוסטאוציטים דרש כושר המצאה עצום במהלך שלושת העשורים האחרונים, כגון יצירת קווים דמויי אוסטאוציטים^29,30,31

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Handle scalpel	Electron Microscopy Sciences	72040-03	Surgical supplies
20x Water immersion objective	Olympus	XLUMPLFLN20XW	This is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIR	AM Bickford	80120	A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit	AM Bickford	80000	An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ	The Jackson Laboratory	28865	GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ	The Jackson Laboratory	23047	Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cell	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	905898	LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesium	VWR International	21-030-CV	Ionically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick tool	Electron Microscopy Sciences		Surgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%	Sigma Aldrich	SIAL-459844-500ML	Sterilization purposes
Fulcrum pin	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kit	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	717435	Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)	NIH	N/A	Install here https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-013-25	100% inhalation vapour liquid
Loading bracket	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019a	MathWorks		For running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isoflurane	Butler Schein Animal Health	14309	Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet		2500A Vet
Piezo servo controller	PI-USA	E-625	Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuator	PI-USA	P-602.5SL	Actuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100	Electron Microscopy Sciences	72044-10	Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mm	Electron Microscopy Sciences	78326-42	Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscope	ThorLabs	N/A	This is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)	Coherent	N/A	This system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed.
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10	Surgical supplies
Water bath	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document