ניטור ומודולציה בזמן אמת של לחץ דם במודל ארנב של שבץ איסכמי

Summary

רישום לחץ דם עורקי רציף מאפשר לחקור השפעות של פרמטרים המודינמיים שונים. דו"ח זה מדגים את היישום של ניטור לחץ דם עורקי רציף במודל בעלי חיים גדולים של שבץ איסכמי לקביעת פתופיזיולוגיה של שבץ, השפעה של גורמים המודינמיים שונים והערכת גישות טיפול חדשניות.

Abstract

שליטה בלחץ הדם, הן מבחינת ערכים מוחלטים והן מבחינת השונות שלו, משפיעה על התוצאות בחולי שבץ איסכמי. עם זאת, עדיין מאתגר לזהות את המנגנונים המובילים לתוצאות גרועות או להעריך אמצעים שבאמצעותם ניתן למתן השפעות אלה בגלל המגבלות האוסרות הטבועות בנתונים אנושיים. במקרים כאלה, מודלים של בעלי חיים יכולים לשמש לביצוע הערכות קפדניות וניתנות לשחזור של מחלות. כאן אנו מדווחים על חידוד של מודל שתואר קודם לכן של שבץ איסכמי בארנבות, אשר מתוגבר עם רישום לחץ דם מתמשך כדי להעריך את ההשפעות של אפנון על לחץ הדם. בהרדמה כללית, עורקי הירך נחשפים דרך חתכים כירורגיים כדי למקם את נדן העורקים באופן דו-צדדי. תחת הדמיה פלואורוסקופית והנחיית מפת דרכים, מיקרוקטטר מתקדם לתוך עורק של מחזור הדם האחורי של המוח. אנגיוגרמה מבוצעת על ידי הזרקת עורק החוליות הנגדי כדי לאשר חסימה של עורק המטרה. כאשר הצנתר החוסם נשאר במקומו למשך זמן קבוע, לחץ הדם נרשם ברציפות כדי לאפשר טיטרציה הדוקה של מניפולציות לחץ דם, בין אם באמצעים מכניים או פרמקולוגיים. בסיום מרווח החסימה, המיקרוקטטר מוסר, והחיה נשמרת בהרדמה כללית למשך זמן קבוע של זילוח. במחקרים חריפים, לאחר מכן מרדימים את בעל החיים ועורפים את ראשו. המוח נקצר ומעובד כדי למדוד את נפח האוטם תחת מיקרוסקופ אור ומוערך עוד יותר עם כתמים היסטופתולוגיים שונים או ניתוח תעתיק מרחבי. פרוטוקול זה מספק מודל הניתן לשחזור שניתן להשתמש בו למחקרים פרה-קליניים יסודיים יותר על ההשפעות של פרמטרים של לחץ דם במהלך שבץ איסכמי. זה גם מאפשר הערכה פרה-קלינית יעילה של התערבויות נוירופרוטקטיביות חדשניות שעשויות לשפר את הטיפול בחולי שבץ איסכמי.

Introduction

שבץ איסכמי (IS) הוא גורם מוביל למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם, ושכיחותו צפויה לעלות ככל שהחברה מזדקנת^{בגיל שנה}. בעוד התקדמות משמעותית נעשתה בהתערבויות אקוטיות ובאסטרטגיות מניעה שניוניות, טיפולים נוירופרוטקטיביים משלימים לא עקבו אחר האפס 2,3,4,5,6,7. יש צורך במחקר נוסף על פתולוגיה של שבץ מוחי מכיוון שמנגנונים שבאמצעותם טיפולים עשויים להוכיח יעילות או לא מובנים היטב. זאת בעיקר בשל האופי ההטרוגני של אוכלוסיית חולי השבץ, שלרבים מהם יש תחלואה נלווית רבה המבלבלת^{את ניתוח 1}. אחד הגורמים למגבלות במחקר הוא היעדר נתונים ברמת הרקמה - תקן הזהב במחקר הביו-רפואי - בשל התחלואה האוסרת של דגימת רקמה ממערכת העצבים המרכזית האנושית. באופן ספציפי, קצירת רקמת כלי דם באדם חי תגרום לשבץ, ולכן רקמת כלי הדם מתקבלת בדרך כלל רק בנתיחה שלאחר המוות, שאינה מייצגת מספיק את האוכלוסייה הכללית ונוטה לכיוון מחלה מתקדמת יותר בחולים קשישים עם אבחנות מקבילות.

במקרים כאלה, כאשר לא ניתן להשתמש במספיק נתונים אנושיים, מודלים של בעלי חיים יכולים לגשר על פערי הנתונים. מודלים גדולים של בעלי חיים של שבץ מוחי מוגבלים מכיוון שרוב בעלי החיים הגדולים המשמשים במחקר הם ungulates בעלי rete mirabile המונע גישה אנדו-וסקולרית ישירה לעורקי המוח 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . ארנבים יש היסטוריה ארוכה של שימוש לחקר מחלות לב וכלי דם, כולל פתולוגיות תוך גולגולתיות 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. ארנבים מהווים מודל אידיאלי למחלות כלי דם במוח מכיוון שהם גדולים מספיק לצנתור אנדו-וסקולרי וחסרים את ה-rete mirabile המונע גישה תוך גולגולתית אצל יונקים גדולים אחרים 9,15,16,17. הם שימשו בעבר במיוחד לחקירת דאע"ש באמצעות חסימה מדויקת ומבוקרת היטב של עורק תוך גולגולתי עם מיקרוקטטר¹⁸.

שליטה בלחץ הדם (BP), הן באמצעות אפנון של השתנות BP מוחלטת או BP (BPV), המידה שבה BP עורקי משתנה סביב BP ממוצע, היא יעד טיפולי פוטנציאלי מתפתח עבור חולי IS לאחר דיווחים על תוצאות גרועות יותר אצל אלה עם BP או BPV בשליטה גרועה 19,20,21,22. חסרה חקירה מכניסטית של האופן שבו שינויים מובילים לתוצאות גרועות בחולי דאע"ש. זה נובע בחלקו מהקושי להשיג נתונים ברמת הרקמה ולבצע ניתוחים מבוקרים היטב בבני אדם. כדי לבחון התערבויות המווסתות BP או BPV, יש להשתמש במודלים של בעלי חיים כדי להתגבר על מגבלות אלה. דו"ח זה מתאר את הזיווג המוצלח של מודל ארנב שאומת בעבר של IS באמצעות חסימה מבוקרת של עורק המוח האחורי בשילוב עם מדידה תוך-עורקית רציפה של BP¹⁸. השיטה המוצגת כאן משפרת את הגישות הקודמות לפתופיזיולוגיה של שבץ מוחי על ידי יישום מודל שבץ מאומת וניתן לשחזור על מערכת שבה ניתן להשיג מדידה ובקרה מדויקות של BP. במודל מעודן זה, ניתן להעריך את עומס האוטם באמצעות צביעה היסטופתולוגית פוסט-פרוצדורלית של המוח שנקטף, אשר ניתנת גם לכתמים שונים ולניתוחים מתקדמים יותר כגון תעתיק מרחבי. בנוסף, ניתן לבחור גם בעורק הדם האחורי החסום לניתוח תחלואה לאחר הליכי הישרדות.

Protocol

פרוטוקול זה מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול IACUC מספר 21-09021 של אוניברסיטת יוטה). ארנבים לבנים בוגרים מניו זילנד מתקבלים מספקים מסחריים.

1. רכישת בעלי חיים

1. התאקלמו את בעלי החיים למשך הזמן הנדרש לאחר הגעתם על פי הפרוטוקול המוסדי, ושיכנו בעלי חיים חברתיים בויבריום עם תזונת צ'או סטנדרטית. תקופת ההתאקלמות במוסד שלנו היא שבועיים.

2. הרדמה ומעקב

1. יש לבצע הרדמה אנדוטרכאלית כללית עם הזרקה תוך שרירית של בופרנורפין (0.03 מ"ג/ק"ג) ולאחר כ-30 דקות עם קטמין (25-35 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (3 מ"ג/ק"ג) הזרקה תוך שרירית. יש לשמור על הרדמה עם 1%-5% איזופלורן בחמצן הניתן דרך צינור אנדוטרכאלי. במהלך האינדוקציה, השתמש ב-100% FiO 2 ולאחר מכן בצע טיטראט כלפי מטה עד ל-FiO 2 הנמוך ביותר ששומר על 100% SpO₂.
   הערה: הרדמה רצופה נחוצה כדי למנוע תנועה על ידי בעל החיים, כך שהשבץ יהיה ההפרעה היחידה של תהליך השראת השבץ. זה גם מונע קפיצות BP שייגרמו תסיסה שיכולה לנבוע מהרדמה לא מספקת. חמצון עקבי חשוב גם לבקרה להשגת משיכות דומות. אמצעים אלה נלקחים בחשבון בתוצאות המייצגות המתוארות להלן.
2. ודא עומק מספיק של הרדמה על ידי החלת גירויים מזיקים על הבוהן. יש למרוח משחת עיניים וטרינרית על העיניים למניעת יובש.
3. עקוב אחר ריווי החמצן על ידי מד דופק אוקסימטר המונח על האוזן. קבל גישה תוך ורידית עם אנגיוקטטר בווריד אוריקולרי. ודא שהוא מאובטח באמצעות תפר או הלבשת סרט שקוף דביק. כדי להקל על vasospasm, יש להניח 0.25 אינץ' של ניטרוגליצרין טרנסדרמלי בחלק הפנימי של האוזן לאחר השראת הרדמה.
4. לספק נוזלי תחזוקה עם מלוחים רגילים בקצב של 1 סמ"ק/ק"ג/שעה. יש לבצע בדיקת טמפרטורת הוושט כדי לנטר את טמפרטורת הגוף. שמרו על נורמותרמיה (33-37 מעלות צלזיוס) לפי הצורך בעזרת שמיכות חימום המונחות מתחת לחיה.

3. הכנה כירורגית

1. הניחו את הארנב במצב שכיבה על שולחן ניתוח תואם פלואורוסקופיה. הרחב את הראש כשהוא מייעל את המיקום לתצוגות אנגיוגרפיות עוקבות. ארנבים יש עורקים רגישים להפליא נוטה vasospasm לאחר מכשור.
2. הסר פרווה משני אזורי המפשעה באמצעות קוצץ חשמלי. לאחר מכן, מישוש את פעימות עורק הירך הדו-צדדי כדי לאשר פינוי נאות על ידי חיתוך דו-צדדי. הכינו את העור עם קרצוף של chlorhexidine ואלכוהול, ולאחר מכן לעטוף את העור בצורה סטרילית הרגילה.
3. ניהול הרדמה מקומית על ידי הזרקה תת עורית 2 מ"ל של 1% לידוקאין באזורי המפשעה הדו צדדיים. בצע חתך כירורגי של 5 ס"מ עם להב מספר 10 במקום בו הוזרק לידוקאין. השתמשו בדיסקציה קהה כדי לחשוף את הצרור הנוירו-וסקולרי (איור 1A). במידת הצורך, הרחיבו את החתך כדי לחשוף כראוי קטע עורקי גדול מספיק לגישה.
4. עם בידוד של צרור neurovascular, לטפטף כמה טיפות של 1% לידוקאין על העורק כדי למנוע vasospasm. יש להפריד את העורק בעדינות מהווריד ומהעצב הסמוך באמצעות מלקחיים. זהה את העורק לפי המראה האופייני של הקיר השרירי שלו בהשוואה לקירות הדקים של הווריד. העורק יהיה דם בהיר יותר, בעוד הווריד יכיל דם כהה יותר.

4. גישה עורקית

1. לאחר שהעורק בודד, העבירו את המלקחיים ישרי הזווית מתחת לכלי. אחזו בשתי לולאות כלי עם המכשיר והעבירו אותן בעדינות מתחת לעורק. מקם אחד מהם בקצוות במעלה ובמורד הזרם של כלי השיט החשוף.
2. חשוף את העורק למתיחה עדינה על ידי משיכת לולאות כלי הדם. בשלב זה, בדקו את כלי הדם לאיתור שאריות רקמה, והוציאו אותה בדיסקציה עדינה (איור 1B). זה מגדיל את הסיכויים לגישה מוצלחת.
3. השתמש באנגיוקטטר 22 G לגישה. מקדמים מעט את הצנתר עצמו מעל המחט הפנימית מכיוון שלעתים קרובות זה נדבק כאשר הוא יושב לחלוטין ויכול לעקור את המכשיר במהלך ניסיונות גישה.
4. לאחר ניתוח כלי הדם והכנת האנגיוקטטר, מטפטפים שוב לידוקאין על הכלי. העורק יתרחב באופן ניכר, מה שמגדיל את הסיכויים לגישה מוצלחת ולמיקום של נדן בטכניקת סלינגר.
5. החל מתיחה עדינה על לולאת כלי הדם במורד הזרם כדי לחרוט את העורק על ידי הפחתת היציאה. זה גם מייצב את הכלי לניסיון הגישה. הקדמו באיטיות את המחט של האנגיוקטטר לאמצע המקטע העורק החשוף (איור 1C). כאשר הבזק של דם נראה באנגיוקטטר ובחדר שבמרכזו, מקדמים את הצנתר מעל המחט לתוך לומן העורקי.
6. אם ניסיון הגישה נכשל, השג המוסטאזיס על ידי החלת המתיחה על לולאת כלי השיט במעלה הזרם. שטפו את האנגיוקטטר במי מלח והחליפו אותו על מחט הכניסה שלו לניסיונות נוספים.
7. כאשר האנגיוקטטר ממוקם בהצלחה בכלי הדם אל המרכז שלו, התקדמו מיקרו-חוט Cope דרך לומן האנגיוקטטר אל אבי העורקים (איור 1D). הסירו את האנגיוקטטר מעל החוט והחליפו אותו בנדן הידרופילי דק 5 צרפתי (איור 1E).
8. אשר את חזרת הדם העורקי דרך צינור הזרוע על ידי פתיחת השסתום התלת-כיווני. יש לשטוף את הנדן במי מלח בשיעור 0.9% ולנעול את השסתום סגור במהלך השטיפה.
9. הדקו את רכזת הנדן לעור הסמוך באמצעות תפר משי נוסף 3-0. חזור על תהליך זה עבור עורק הירך הנגדי. להשגת יעילות גבוהה יותר, שני מפעילים יכולים לעבוד בו זמנית תוך התמקדות בעורק אחד כל אחד.

5. אנגיוגרפיה מוחית צוואר הרחם וגישה תוך גולגולתית

1. תחת הדמיה פלואורוסקופית, מקדמים צנתר גלישה צרפתי 4 על חוט גלישה בקוטר 0.035 אינץ' המוחדר דרך נדן הירך השמאלי. מקמו את קצה צנתר הגלישה בעורק החוליה השמאלי הפרוקסימלי. הסר את החוט ושטוף את הקטטר עם heparinized 0.9% מלוחים.
2. בצעו אנגיוגרפיה על-ידי הזרקה ידנית לעורק החוליה השמאלי עם ניגודיות יוד תחת הגדלה נמוכה כדי להמחיש את כל הראש והצוואר (איור 2A). לווסת את ההזרקה של תמיסת הניגוד על ידי התחלה עם הזרקה בלחץ נמוך כי crescendos כדי לדמיין את כלי הדם כולו.
   הערה: יש צורך בהזרקה מספקת כדי להמחיש את הריפלוקס במורד עורק החוליה הימני, מכיוון שתמונה אנגיוגרפית זו תשמש להנחיית מפת הדרכים לבחירת עורק החוליה הימני ביעילות. הזרקה עדינה נדרשת כדי למזער vasospasm או פגיעה עמוקה יותר. בנוסף, כוח או נפח מוגזמים יכולים לגרום לתנועה חולפת של בעל החיים גם תחת הרדמה עמוקה.
3. להזרקת חוליה שמאלית, יש להזריק 50% חומר ניגוד מדולל במי מלח רגילים עם קרשנדו עדין ממזרק 3 סמ"ק. הזרקת 1-2 סמ"ק של הניגודיות המדוללת מספיקה בדרך כלל. קבע את כמות ההזרקה המספקת על ידי בדיקת הריפלוקס במורד עורק החוליה הימני ולתוך העורק התת-קלאבי הימני. במהלך הזרקה זו, שימו לב גם לעורקי המוח האחורי והמוח הקטן העליון, שאחד מהם יהיה המטרה להסתתר עם המיקרוקטטר.
4. הכינו מיקרו-קטטר צרפתי מכוון זרימה 2.4 עם מיקרו-חוט בגודל 0.010 אינץ'. צור צורת C על קצה המיקרו-חוט. בהנחיית מפת דרכים, מקדמים את המיקרו-צנתר בתוך צנתר 4 גלייד צרפתי דרך מעטפת הירך הימנית ומעל החוט לעורק החוליה הימני. בשל הנטייה לווזוספזם המושרה על ידי צנתר, מזער את זמן המניפולציה של המכשיר ואת מספר ניסיונות הצנתר שבוצעו.
5. לקדם את המיקרוקטטר דרך המקטע הצווארי של עורק החוליה הימני. כדי לעבור בצורה הטובה ביותר את הפנייה החדה מקטע V2 לקטע V3, הקדמו את המיקרו-קטטר לבדו בזמן שהמיקרו-חוט חוזר פרוקסימלי לקצהו. הובלה עם microwire בשלב זה יגרום לעתים קרובות בחירה של ענפים צדדיים קטנים של עורק החוליות יכול להיות המקור של vasospasm משמעותי.
6. לאחר שעבר את הפנייה החדה מ- V2 ל- V3, המיקרוקטטר עובר לעתים קרובות בקלות לעורק הבזילרי הפרוקסימלי. בשלב זה, לקדם את microwire ובחר את העורקי המוח האחורי הרצוי או עורקי המוח הקטן העליון. זריקות מיקרוקטטר אינן מומלצות בהתחשב באופי השביר של העורקים התוך גולגולתיים.
7. מקדמים את המיקרו-קטטר דרך המיקרו-חוט לתוך עורק המטרה. בחר מיקום פרוקסימלי כפי שהוא בדרך כלל הבטוח ביותר בחלק האחורי לתקשר בשל הזווית שלה במקורו. מיקום עמוק יותר אפשרי בעורק המוח הקטן העליון (איור 2B).
8. חזרו על האנגיוגרמה על-ידי הזרקת צנתר עורק החוליה השמאלי עם הגדלה גבוהה מעל הראש כדי לאשר חסימה של עורק המטרה (איור 2B-C). להדמיה מיטבית, הזריקו ניגודיות בעוצמה מלאה במזרק 3 סמ"ק. בדרך כלל, לא יותר מ 1 סמ"ק יידרש עבור opacification נאות של כל העורקים תוך גולגולתיים.
9. הסר בעדינות את המיקרו-חוט מהמיקרוקטטר תחת הדמיה פלואורוסקופית כדי לאשר מיקום יציב. הניחו סטופקוק על רכזת המיקרוקטטר וסגרו את הסטופקוק כדי למנוע איבוד דם מזרימת דם לאחור. הסר את צנתר החוליה השמאלית כדי להפוך את נדן הגישה של הירך השמאלית לזמין.
10. במהלך תקופת החסימה שלאחר מכן, רכשו תמונות פלואורוסקופיות לסירוגין כדי לאשר מיקום יציב של המיקרוקטטר החסימתי. תוצאות של תקופות חסימת עורק מוחי אחורי שנעו בין 60-240 דקות פורסמו בעבר¹⁸.

6. מדידת לחץ דם ומודולציה

1. בעוד שאתר גישה פמורלי אחד מנוצל עבור מיקרוקטטר תוך גולגולתי חוסם, השתמש במעטפת הנגדית למדידת BP.
2. הקלט קריאות BP עורקיות רציפות עם חיישן פיאזוהתנגדותי 3 מד צרפתי, ממוקם דרך נדן הירך ומתקדם עד שקצה החיישן נמצא באבי העורקים החזי התחתון. חבר חיישן זה לחומרת רכישת נתונים והצג באופן חזותי לחצים מדודים באמצעות התוכנה המשויכת אליו. התבונן ב- BP בחלון התצוגה החזותית של הלחץ. ניתן לייצא הקלטות BP לגיליון אלקטרוני לצורך תצוגה חזותית בתוכנת הסטטיסטיקה.
3. לחלופין, אם רוצים מניפולציה מכנית של BP באמצעות צנתר בלון, מקדמים צנתר בלון פוגרטי 4 צרפתי 5 מ"מ דרך מעטפת הירך הזמינה. מקמו את הבלון באבי העורקים האינפרא-כלייתי (infrarenal aorta). השתמש בלומן הפנימי בגודל 0.025 אינץ' למעקב לחץ כדי לעקוב ברציפות אחר BP במעלה הזרם של הבלון ובקוטר 4 הצרפתי של הבלון כדי שקו מעקב BP שני יחובר לנדן לניטור רציף של BP במורד הזרם של הבלון.

7. המתת חסד וקצירת רקמות

1. הסר את המיקרוקטטר החוסם לאחר 3 שעות, ולאחר מכן המשך במדידה ובאפנון BP עורקי לתקופה הרצויה הנוספת. תקופת התאוששות סטנדרטית של 3 שעות משמשת להדמיה של אוטם שהושלם על היסטולוגיה לאחר מכן.
2. לאחר השלמת זמני החסימה וההתאוששות שנקבעו, יש לוודא כי בעל החיים נמצא במישור כירורגי של הרדמה ולבצע המתת חסד (קיבוע זילוח עם תמיסת חציצה פוספט, ואחריו עריפת ראש לאחר אישור היעדר פעילות לבבית). לחלופין, בצע קיבוע זילוח על ידי החדרת פרפוזט דרך נדן הירך, ולאחר מכן טרנסקציה של וריד הצוואר, הווריד הנבוב התחתון או האטריום הימני.
   הערה: זילוח עשוי להיות עדיף עבור כמה ניתוחים לאחר המוות מאז ביטוי גנים או ערכי סמן ביולוגי עשויים להיות מושפעים על ידי התמיסה. שתי הטכניקות בוצעו בהצלחה על ידי הקבוצה שלנו.
3. בהליכים חריפים עם קציר מיידי של המוח, לאשר המתת חסד ולערוף את פני החיה. מוציאים את הקלבריום בצורה חתיכת עם רונגורים, מתחילים ברכס העורפי ועובדים קדמית עד שניתן לקצור את המוח בשלמותו. הכניסו את המוח לפורמלין או לתמיסת טמפרטורת חיתוך אופטימלית והקפאת בזק, בהתאם לסוג ניתוח הרקמה הרצוי.

תוצאות

בניסויים הראשונים עם מודל זה, הקבוצה שלנו השיגה בהצלחה את התוצאה הרצויה של חסימת עורק המוח הקטן האחורי או העליון ב -12 מתוך 14 בעלי חיים (85.7%). לצורך הניסוי נחקרו שבעה זכרים ושבע נקבות. משקל החיה הממוצע היה 3.6 ק"ג (± 0.46 ק"ג). בשני בעלי החיים שבהם לא הושגה הצלחה, וזוספאזם עמוק המושרה על ידי צנתר מנע ?...

Discussion

הושגה התקדמות משמעותית בניהול דאע"ש, במיוחד בהתחשב בהתקדמות בהתערבות אקוטית ובאסטרטגיות מניעה שניוניות. עם זאת, ניתן לעשות עבודה נוספת כדי לשפר את הטיפול בחולי דאעש. התקדמות מוגבלת בהיבטים אחרים של הטיפול בדאע"ש, במיוחד בתחום ההגנה העצבית, נובעת ככל הנראה מהמגבלות בהבנה הפתופיזיולוגית של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	A184H
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B9275
Catheter	Terumo	CG415	4F glide catheter
Endovascular Pressure Sensor	Millar	SPR-524
Euthasol	Virbac	PVS111
Guidewire	Terumo	GR1804
Iohexol	ThermoFisher	466651000	Iodinated Contrast
Ketamine	Biorbyt	orb61131
LabChart Software	ADInstruments
Lidocaine	Spectrum	LI102
Microcatheter	Medtronic	EV3 105-5056	Marathon Microcatheter
Microwire	Medtronic	EV3 103-0608	Mirage Microwire
PowerLab	ADInstruments
Rabbit Brain 2mm Coronal Cutting Matrix	Ted Pella	15026
Saline	FisherScientific	23-535435
Sheath	Merit Medical	PSI-5F-11
Xylazine	ThermoFisher	J61430.14