פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

Summary

השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.

Abstract

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית בקביעת מחלת המטופל מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. CTCs מנותקים מהגידול הראשוני, נכנסים למערכת זרימת הדם, ועלולים לגדול באתרים מרוחקים, ובכך לשלוח גרורות לגידול. מכיוון ש- CTCs נושאים מידע דומה לגידול הראשוני, בידוד CTC ואפיון לאחר מכן יכולים להיות קריטיים בניטור ואבחון סרטן. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן שיטות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מספקות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה. שבבים מיקרופלואידים מציעים שיטת ביופסיה נוזלית ללא כל כאב עבור החולים. בעבודה זו, אנו מציגים רשימה של פרוטוקולים עבור שבבים מיקרופלואידים קליניים, פלטפורמת בידוד CTC רב-תכליתית, המשלבים מערך של פונקציות ושירותים הדרושים להפרדה, ניתוח ואבחון מוקדם של CTC, ובכך מאפשרים ניתוח ביומולקולרי וטיפול בסרטן. התוכנית כוללת ספירת תאי גידול נדירים, עיבוד מקדים קליני של דם המטופל, הכולל ליזה של תאי דם אדומים, ובידוד והכרה של CTCs באתרם על שבבים מיקרופלואידים. התוכנית מאפשרת ספירה מדויקת של תאי גידול או CTCs. בנוסף, התוכנית כוללת כלי המשלב בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים רב-תכליתיים וזיהוי אימונופלואורסצנטי באתרו על השבבים, ולאחר מכן אנליזה ביומולקולרית.

Introduction

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן טכניקות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מציעות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה¹. מספר נדיר של תאי גידול מעורבבים עם דם נורמלי מחקה באופן הדוק דם חולה אמיתי מאז 2-3 מ"ל של דם חולה אמיתי מכיל רק 1-10 CTCs. כדי לפתור בעיה ניסיונית קריטית, במקום להשתמש במספר גדול של תאי גידול שהוכנסו ל-PBS או מעורבבים עם דם רגיל, השימוש במספר נדיר של תאי גידול מספק לנו מספר נמוך של תאי דם, שהוא קרוב יותר למציאות בעת ביצוע ניסוי.

סרטן הוא סיבת המוות המובילה בעולם². CTCs הם תאי גידול שנשפכים מהגידול המקורי ומסתובבים במערכת הדם והלימפה³. כאשר CTCs עוברים לסביבה חדשה הניתנת לשרידות, הם גדלים כגידול שני. זה נקרא גרורות והוא אחראי ל 90% ממקרי המוות בחולי סרטן⁴. CTCs חיוניים לפרוגנוזה, לאבחון מוקדם ולהבנת מנגנוני הסרטן. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם המטופל ^5,6.

שבבים מיקרופלואידים מציעים ביופסיה נוזלית שאינה פולשת לגידול. יש להם את היתרון של היותם ניידים, בעלות נמוכה ובעלי קנה מידה תואם תאים. הבידוד של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים מסווג בעיקר לשני סוגים: מבוסס זיקה, המסתמך על אנטיגן-נוגדנים קושרים ^7,8,9 והיא השיטה המקורית והנפוצה ביותר לבידוד CTC; ושבבים פיזיים, המנצלים את הבדלי הגודל והעיוות בין תאי הגידול לתאי הדם 10,11,12,13,14,15^, הם נטולי תוויות וקלים לתפעול. היתרון של שבבים מיקרופלואידים על פני טכניקות חלופיות הוא שהגישה המבוססת פיזית של מיקרו-פילטרים בעלי אליפסה גדולה לוכדת היטב CTCs ביעילות לכידה גבוהה. הסיבה לכך היא שמיקרו-עמודי אליפסה מאורגנים במנהרות דקות של רווחי קו. מרווחי הקו שונים מהמרווחים המסורתיים בין נקודות נקודתיות שנוצרו על ידי מיקרו-פוסטים כגון מיקרו-פוסטים של מעוין. לכידה מבוססת שבב גל של CTCs משלבת הן בידוד מבוסס רכוש פיזי והן בידוד מבוסס אהדה. לכידה מבוססת שבב גל כוללת 30 מערכים בצורת גל עם נוגדן של אנטי-EpCAM מצופה על מיקרופוסטים עגולים. ה-CTCs נלכדים על ידי הפערים הקטנים, והפערים הגדולים משמשים להאצת קצב הזרימה. ה-CTCs המוחמצים צריכים לעבור את הפערים הקטנים במערך הבא ונלכדים על ידי בידוד מבוסס זיקה המשולב בתוך השבב¹⁶.

מטרת הפרוטוקול היא להדגים ספירה של מספרים נדירים של תאי גידול ואת הניתוח הקליני של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים. הפרוטוקול מתאר את שלבי הבידוד של CTC, כיצד להשיג מספר נמוך של תאי גידול, ההפרדה הפיזית הקלינית של מסנני אליפסה קטנים, מסנני אליפסה גדולה ומסנני טרפז, שינוי זיקה והעשרה¹⁷.

Protocol

דגימות דם של מטופלים סופקו על ידי בית החולים Longhua המסונף לאוניברסיטה הרפואית של שנחאי.הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים לשימוש בדגימות למטרות מחקר.

1. ניסוי מקדים לבדיקת יעילות הלכידה עם תאי גידול בתרבית

1. תרבית את תאי הגידול MCF-7, MDA-MB-231 ו-HeLa לקביעת יעילות הלכידה. לדלל את תרחיף תאי הגידול, לספור את מספר תאי הגידול ולחזור על הפעולה עד לקבלת מספר התאים הרצוי ב 1 מ"ל של PBS.
   1. תרבית את התאים בבקבוק תרבית תאים עם מספר תא התחלתי של ~ 1 x 10⁵ תאים ב 1 מ"ל של מדיום הנשר של Dulbecco שונה (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה באטמוספירה לחה ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO₂ אטמוספירה.
   2. כאשר קווי התאים גדלים כחד-שכבות נצמדות למפגש של 95%, נתקו אותם מתרבית התרבית עם תמיסת טריפסין 0.25% למשך 2 דקות כמתואר ב-Chen et ^al.16.
   3. מכתימים את תאי הגידול עם calcein AM. שים 3 μL של calcein AM בצלחת התרבית, ולשמור את המנה באינקובטור במשך 30 דקות. לאחר מכן,לעכל את כל התאים עם טריפסין.
   4. לספור את תאי הגידול בתרבית PBS עם תא ספירת תאים, ולדלל עד 100 תאים סרטניים לכל 1 מ"ל של PBS מתקבלים.
      הערה: על מנת לספור במדויק את מספר התא, קח 50 μL של תרחיף התא המתקבל כדי לראות אם מספר תאי הגידול בו הוא חמישה או לא עם מיקרוסקופ. להחליט את נפח תרחיף התא שיש לקחת כדי לקבל 100 תאים סרטניים על פי המספר בפועל של תאי הגידול ב 50 μL של השעיית תאים.
2. הכנס את תרחיף התא המכיל 100 תאי גידול לכל 1 מ"ל PBS לתוך השבב המיקרופלואידי באמצעות מזרק עם משאבת מזרק בקצבי זרימה מגוונים של 0.5 מ"ל/שעה, 1 מ"ל/שעה, 2 מ"ל/שעה, 3 מ"ל/שעה, 4 מ"ל/שעה ו-5 מ"ל/שעה. השג את יעילות הלכידה עבור קצבי הזרימה השונים, וקבע את קצב הזרימה האופטימלי.
   1. ספרו את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב וזורמים החוצה מהשקע. חשב את יעילות הלכידה כמפורט להלן:
      יעילות לכידה = מספר התאים שנלכדו/(מספר התאים שנלכדו + מספר התאים הזורמים החוצה) × 100%
   2. חזור על הפעולה כדי להשיג את יעילות הלכידה עבור מספר שונה של תאי גידול מ 10 עד 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
3. בדוק ותקף את השבב המיקרופלואידי עבור מספר נדיר של תאים סרטניים. הזריקו את 10 המתלים לדוגמה אלה לתוך השבבים המיקרופלואידים באמצעות מחט חלולה העשויה עם מושך מיקרופיפטה כדי לשאוף 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו -10 תאי גידול מדוללים ב -1 מ"ל של PBS. לזהות ולמנות את מספר תאי הגידול עבור כל דגימה לאחר לכידתם על השבב.
   הערה: אורך המחט החלולה הוא כ-3 ס"מ וקוטר חיצוני של 1 מ"מ.
4. לבצע בדיקות קליניות לפני הניסוי עבור תאים סרטניים שהוקפצו לדגימות דם רגילות.
   1. לצבוע את תאי הגידול עם calcein AM, ולאחר מכן למנות 100 תאים סרטניים ב 5 μL של PBS. ספייק תאים אלה לתוך 1 מ"ל של דגימות דם נורמליות שלמות. הכנס תאים אלה לתוך השבב, ולמנות את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence ירוק. בצע ספירת in vivo על השבב כמתואר לעיל, וחשב את יעילות הלכידה לאחר הלכידה.
   2. חזור על שלב 1.4.1 עבור תשעה ריכוזים נוספים של מספרי תאי גידול מ-10 עד 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. מנה 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ו -10 תאי גידול כמתואר בשלב 1.3 ללא צביעה, ספייק לתוך 1 מ"ל של דם נורמלי שלם, להכניס דגימות אלה לתוך השבב microfluidic, וללכוד את תאי הגידול על השבב.
   4. כתם על השבב עם Hoechst, CK-FITC ו- CD45-PE. שים 3-5 μL של צבע פלואורסצנטי לתוך 20-30 μL של PBS, ולאחר מכן להציג פתרון זה על שבב microfluidic עם מזרק. מנה את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence כחול וירוק כדי לקבוע את יעילות לכידה.
5. בצע שינוי של השבב המיקרופלואידי ללכידה מבוססת זיקה של אנטי-EpCAM.
   הערה: מכיוון ששבב הגל משלב בידוד מבוסס זיקה ובידוד מבוסס מאפיינים פיזיים, שנה את השבב עם סוכנים.
   1. שנה את פני השטח של השבב עם 100 μL של 4% (v/v) 3-mercaptopropyl trimethoxysilane באתנול בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. הציגו פתרון זה לתוך השבב בזהירות ובאיטיות במקרה שהוא הורס את המבנה הפנימי של השבב, במיוחד את מליטה של המשטח העליון ואת זכוכית המצע.
      הערה: משטח השבב משתנה באמצעות מרקפטוסילן. האינטראקציות המתרחשות על השבב נקבעות על ידי קשרים כימיים. קשרים כימיים נקבעים כדי לממש את הקשר של הנוגדן שונה עם האנטיגן. ריאגנטים שונים משתנים בתוך השבב כדי ליצור קשרים כימיים המתחברים זה לזה. המגיב האחרון שיש לשנות הוא מולקולת הידבקות אנטי-אפיתל (anti-EpCAM). האנטיגן של פני השטח של תאי הגידול של EpCAM משתלב עם אנטי-EpCAM בתוך השבב כדי לממש את לכידת ה-CTCs.
   2. לשטוף עם אתנול 3x. הוסף 100 μL של חומר הצימוד N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS, 1 μM) על השבב, ולאפשר לו אינטראקציה במשך 30 דקות.
   3. יש לשטוף עם PBS 3x. השתמש מזרק כדי להציג 1 מ"ל של PBS על השבב כדי לשטוף.
   4. טפלו בשבב עם 30-40 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל נויטרווידין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמוביל לשיתוק התאים על GMBS, ולאחר מכן שטפו עם PBS כדי להסיר עודפי אבידין.
   5. שנה את השבב עם 3 μL של נוגדן EpCAM אנטי-ביוטינילציה בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-100 מיקרוליטר של PBS עם 1% (w/v) BSA. שמור את זה למשך הלילה.

2. ניסוי קליני על השבב לספירת תאי הגידול במחזור הדם (CTCs)

1. טרום תהליך קליני דגימות דם לחולי סרטן באמצעות תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (RBCL), או החדרת 2-3 מ"ל של דגימת הדם ישירות על השבב המיקרופלואידי באמצעות מזרק.
   1. בצע עיבוד מקדים, שאורך כ-30 דקות. לאסוף דגימות דם שלמות צינורות נוגדי קרישה. הוסף 6-9 מ"ל של תמיסת ליזה RBS לתוך 2-3 מ"ל של דם. צנטריפוגה ב 111 x גרם במשך 5-8 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את השכבה העליונה של נוזל אדום שקוף.
2. ללכוד, להכתים, לזהות ולמנות את התאים על השבב כמתואר להלן.
   1. לכוד את התאים על השבב כמתואר בשלב 1.הכתים את השבב עבור CTCs שנלכדו באמצעות Hoechst, CK-FITC ו- CD45-PE. CK-FITC הוא כתם ספציפי לתאי גידול, ו- CD45-PE מיועד לתאי דם לבנים.
   2. הוסף 3 μL של CK-FITC ל- 20 μL של PBS. הכנס את זה לתוך מזרק, ולשאוב את CK-FITC מדולל על השבב. מניחים לכתם למשך 30 דקות. הכנס 300 μL של PBS על השבב כדי לשטוף את השבב.
   3. הוסף 3 μL של CD45-PE ל 20 μL של PBS. הכנס את זה לתוך המזרק, ולשאוב את CD45-PE מדולל על השבב. אפשר לעמוד במשך 30 דקות. הכנס 300 μL של PBS על השבב כדי לשטוף את השבב.
   4. זהה את CTCs עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 20 או 40. CTCs פולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה, ותאי דם לבנים (WBCs) פולטים פלואורסצנטיות כחולה ואדומה. זהה את ה- CTCs עם פלואורסצנטיות כחולה וירוקה ואת ה- WBCs עם פלואורסצנטיות כחולה ואדומה.
   5. מתוך תמונות immunofluorescence, למנות את מספר CTCs לכוד על השבב. מנה את CTCs כ- Hoechst+/CK-FITC+/CD45− ואת ה- WBCs כ- Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
3. העשירו את ה-CTCs שנלכדו על ידי שטיפה עם PBS דרך המזרק בכיוון ההפוך אל השבב המיקרופלואידי כדי לאסוף את ה-CTCs שנלכדו על השבב מהמפרצון. השתמש מזרק עם 1 מ"ל של PBS, להציג אותו מן השקע כדי להעשיר את CTCs נתפס על השבב בתוך 2-3 דקות, ולאסוף אותם מן המפרצון. יש להשתמש ב-1 מ"ל PBS לכל שלב כביסה, ולחזור על הפעולה 3x.
4. הכתימו את תאי הגידול או CTCs שנלכדו על השבב המיקרופלואידי כמתואר להלן.
   1. מכתים באמצעות calcein AM. הוסף 5 μL של calcein AM ל 20 μL של PBS, להכתים את התאים במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 111 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל תאים סרטניים, והשהה ב 1 מ"ל של PBS.
   2. כדי לזהות את גרעיני התא, הוסף 20 μL של תמיסת DAPI (10 μL של מגיב DAPI ב- 20 μL של PBS) לשבב בקצב זרימה אופטימלי של 1 מ"ל/שעה עבור מיקרו-מסננים בעלי אליפסה גדולה ו- 1.5 מ"ל/שעה עבור טרפזים. לעבור דרך 20 μL של תמיסת מלאי אנטי cytokeratin (3 μL של נוגדן anti-cytokeratin ב 20 μL של PBS) כדי להגיב עם השבב במשך 30 דקות.
   3. הכתימו את ה-WBCs שנתפסו על השבב. לאחר שה-CTCs נלכדו על השבב, הוסף 25 μL של תמיסת נוגדנים נגד CD45 (5 μL של תמיסת anti-CD45 ב-20 μL של PBS) לשבב, ואפשר להכתים למשך 30 דקות. לשטוף עם PBS, ולזהות את תאי אפיתל עם פלואורסצנטיות כחולה וירוקה.
5. לבצע זיהוי immunofluorescence עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמתואר להלן.
   1. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ועורר את הדגימה עם הלייזר הכחול. מצא את התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה, שהם תאי גרעין. השתמש באחת מההגדלות הבאות: 10x, 20x או 40x. מצא שדה ברור לתא הגידול. עבור מקור הלייזר הכחול, השתמש באורך גל של לוחית עירור של 420-485 ננומטר ובאורך גל של צלחת פליטה של 515 ננומטר.
   2. מבלי להזיז את הדגימות, השתמש במקור לייזר אחר. סובב את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והלהיב את הדגימה עם הלייזר הירוק. מצא את התאים פולטים פלואורסצנטיות ירוקה, המעידה על תאים סרטניים. צלם תמונות של אותו שדה עם אותה הגדלה עם מקור לייזר ירוק זה. התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה מוכרים כתאי גידול. עבור מקור הלייזר הירוק, השתמש באורך גל של לוחית עירור של 460-550 ננומטר ובאורך גל של צלחת פליטה של 590 ננומטר
   3. מבלי להזיז את הדגימות, השתמש במקור לייזר אחר. סובב את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והרגש את הדגימה עם הלייזר האדום. מצא את התאים הפולטים פלואורסצנטיות אדומה. צלם תמונות של אותו שדה עם אותה הגדלה עם מקור לייזר אדום זה. התאים הפולטים פלואורסצנטיות כחולה ואדומה מוכרים כתאי דם לבנים.
   4. שמור את התמונה המתקבלת באמצעות כל אחד ממקורות הלייזר לעיל. צלם מספר תמונות של אותו שדה עם אורות בצבעים שונים.
   5. השתמש באור אולטרה סגול עם אורך גל של צלחת עירור של 330-400 ננומטר ואורך גל של צלחת פליטה של 425 ננומטר. השתמש באור סגול עם אורך גל של לוחית עירור של 395-415 ננומטר ואורך גל של צלחת פליטה של 455 ננומטר.
6. חשב את יעילות הלכידה כמו בשלב 1.2.1.

תוצאות

ההתקנה כולה כוללת משאבת מזרק, מזרק ושבב מיקרופלואידי. תרחיף התא במזרק מחובר למשאבת המזרק, ותרחיף התא מוכנס לשבב המיקרופלואיד כדי ללכוד את התאים. יעילות הלכידה של כל השבבים המיקרופלואידים שנוצלו הייתה בסביבות 90% ומעלה. עבור שבב הגל, תכננו מיקרו-מבנים עם פערים מגוונים. המרווחים הקטנים משמשי?...

Discussion

לפרוגנוזה ולאבחון מוקדם של סרטן יש השפעה משמעותית על הטיפול בסרטן¹. בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים מציע ביופסיה נוזלית ללא פלישה. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם¹, מה שהופך את זה למאתגר לבודד CTCs. CTCs יש תכונות דומות למקורות הגידול המקוריים שממנו הם מגיעים....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010