A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.

Abstract

לקטובצילוס היה סוג גדול ומגוון להפליא של חיידקים שכלל 261 מינים, כמה מהם זנים קומנסליים עם פוטנציאל לשימוש כמארז למאמצים ביולוגיים סינתטיים במערכת העיכול. השונות הפנוטיפית והגנוטיפית הרחבה שנצפתה בתוך הסוג הובילה לאחרונה לסיווג מחדש ולהכנסת 23 סוגים חדשים.

בשל רוחב הווריאציות בתוך הז'אנר הישן, פרוטוקולים שהודגמו בחבר אחד עשויים שלא לעבוד כפי שפורסם עם חברים אחרים. מחסור במידע מרוכז על איך בדיוק לתפעל זנים ספציפיים הוביל למגוון גישות אד-הוק , שלעתים קרובות מותאמות ממשפחות חיידקים אחרות. זה יכול לסבך את העניינים עבור חוקרים מתחילים בתחום, שאולי לא יודעים איזה מידע חל או לא חל על הזן הנבחר שלהם.

במאמר זה, אנו שואפים לרכז סדרה של פרוטוקולים עם הצלחה מוכחת, במיוחד בכינוי זן Limosilactobacillus reuteri F275 (מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם ייעוץ לפתרון בעיות ובעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן. פרוטוקולים אלה אמורים לאפשר לחוקר עם ניסיון מועט, אם בכלל, בעבודה עם L. reuteri DSM20016 לשנות פלסמיד, לאשר טרנספורמציה ולמדוד משוב מערכת בקורא צלחות באמצעות חלבון כתב.

Introduction

הסוג לקטובצילוס סווג היסטורית כגראם-חיובי, בצורת מוט, שאינו יוצר נבגים, אנארובים פקולטטיביים או מיקרו-אירופילים המפרקים סוכרים לייצור חומצה לקטית1. קריטריונים רופפים אלה הובילו לכך שלקטובצילוס היה, מבחינה פנוטיפית וגנוטיפית, סוג מגוון ביותר. סיווג רחב זה הביא לסיווג מחדש של הסוג, והציג 23 סוגים חדשים בשנת 20202.

הסוג הוותיק והרחב יותר כלל זנים עיקריים של קומנסל ופרוביוטיקה הנחשבים בדרך כלל בטוחים לצריכה (GRAS)3. משפחת Lactobacillaceae שומרת על תפיסה ציבורית של היותם "חיידקים טובים" בשל היתרונות הבריאותיים המדווחים הרבים המוענקים באמצעות

Protocol

1. הכנת L. reuteri DSM20016 תאים אלקטרוכשירים

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול של Berthier et al.17, עם מהירויות צנטריפוגה שהודיעו על ידי Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, יש לחסן את L. reuteri ממלאי גליצרול ל-6 מ"ל של מרק deMan Rogosa Sharpe (MRS). יש לדגור באופן אירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור סטטי.
  2. למחרת בבוקר, לחסן 4 מ"ל של תרבית לילה לתוך 200 מ"ל של מרק MRS (דילול 1:50).
  3. אפשר לגדול באופן אירובי באינקובטור סטטי של 37 מעלות צלזיוס עד שערך הצפיפות האופטית של 600 ננומ....

תוצאות

יעילות טרנספורמציה
L. reuteri אינו דורש פלסמיד dcm-/dam- ללא מתילציה, כפי שנצפה עבור לקטובצילאיםאחרים 19,20 (ראה איור 1). אלקטרופורציה של L. reuteri DSM20016 עם 10 μL של pTRKH3_mCherry2 פלסמיד 8.5 kb (pAMβ1 theta origin of replication) אמורה לתת יעילות.......

Discussion

השלב הקריטי ביותר לשינוי של L. reuteri DSM20016 הוא יצירת תנאי צמיחה אנאירוביים לאחר טרנספורמציות מצופות; מושבות שנרכשות בתנאים אירוביים הן רק מזדמנות מאוד ובדרך כלל אינן מצליחות לגדול כאשר מחוסנים במרק MRS. יש לתרגל גם ציפוי של כל נפח ההתאוששות כדי למקסם את ההסתברות לצמיחת מושבה. אפילו עם שני .......

Disclosures

אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו מעריכים מאוד את עצתו רבת הערך של פרופ' J.P. van Pijkeren (אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון), שהדרכתו בעבודה עם L. reuteri ATCC PTA 6475 סיפקה בסיס לשיטות המתוארות כאן.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderNEBN3200L
1mL Spectrophotometer cuvettesThomas Scientific1145J12
Agarose BioShopAGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)Beckman Allegra N/ANo longer in production
AnaeroGen 2.5 L SachetThermo ScientificOXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation systemVWR58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)FroggaBioTB50-500
DNA gel x6 loading dyeNEBB7024S
Electroporation cuvetteFisherbrandFB101
ErythromycinMillipore SigmaE5389-5G
Gel electroporation bath/dockVWR76314-748
Glycerol BioShopGLY001
Limosilactobacillus reuteriLeibniz Institute DSMZDSM20016Strain designation F275
LysozymeBioShopLYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)FroggaBioLMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)Qiagen27106slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated)Thermo ScientificCM0359B
MutanolysinMillipore SigmaM9901-5KU
NaOH Millipore Sigma1064691000
P100 PipetteEppendorf3123000047
P1000 PipetteEppendorf3123000063
P2.5 PipetteEppendorf3123000012
P20 PipetteEppendorf3123000039
P200 PipetteEppendorf3123000055
PCR tubesFroggaBioSTF-A120S
Personal benchtop microcentrifugeGenlantisE200100
Petri dishesVWR25384-088
PTC-150 Thermal CyclerMJ ResearchN/ANo longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)Addgene27168
SPECTRONIC 200 SpectrophotometerThermo Scientific840-281700
Storage microplateFisher Scientific14-222-225
SucroseBioShopSUC507
TAE Buffer 50xThermo ScientificB49
VortexVWR58816-121No longer in production
VWR 1500E incubatorVWRN/ANo longer in production

References

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved