שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.

Abstract

לקטובצילוס היה סוג גדול ומגוון להפליא של חיידקים שכלל 261 מינים, כמה מהם זנים קומנסליים עם פוטנציאל לשימוש כמארז למאמצים ביולוגיים סינתטיים במערכת העיכול. השונות הפנוטיפית והגנוטיפית הרחבה שנצפתה בתוך הסוג הובילה לאחרונה לסיווג מחדש ולהכנסת 23 סוגים חדשים.

בשל רוחב הווריאציות בתוך הז'אנר הישן, פרוטוקולים שהודגמו בחבר אחד עשויים שלא לעבוד כפי שפורסם עם חברים אחרים. מחסור במידע מרוכז על איך בדיוק לתפעל זנים ספציפיים הוביל למגוון גישות אד-הוק , שלעתים קרובות מותאמות ממשפחות חיידקים אחרות. זה יכול לסבך את העניינים עבור חוקרים מתחילים בתחום, שאולי לא יודעים איזה מידע חל או לא חל על הזן הנבחר שלהם.

במאמר זה, אנו שואפים לרכז סדרה של פרוטוקולים עם הצלחה מוכחת, במיוחד בכינוי זן Limosilactobacillus reuteri F275 (מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם ייעוץ לפתרון בעיות ובעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן. פרוטוקולים אלה אמורים לאפשר לחוקר עם ניסיון מועט, אם בכלל, בעבודה עם L. reuteri DSM20016 לשנות פלסמיד, לאשר טרנספורמציה ולמדוד משוב מערכת בקורא צלחות באמצעות חלבון כתב.

Introduction

הסוג לקטובצילוס סווג היסטורית כגראם-חיובי, בצורת מוט, שאינו יוצר נבגים, אנארובים פקולטטיביים או מיקרו-אירופילים המפרקים סוכרים לייצור חומצה לקטית¹. קריטריונים רופפים אלה הובילו לכך שלקטובצילוס היה, מבחינה פנוטיפית וגנוטיפית, סוג מגוון ביותר. סיווג רחב זה הביא לסיווג מחדש של הסוג, והציג 23 סוגים חדשים בשנת 2020².

הסוג הוותיק והרחב יותר כלל זנים עיקריים של קומנסל ופרוביוטיקה הנחשבים בדרך כלל בטוחים לצריכה (GRAS)³. משפחת Lactobacillaceae שומרת על תפיסה ציבורית של היותם "חיידקים טובים" בשל היתרונות הבריאותיים המדווחים הרבים המוענקים באמצעות

Protocol

1. הכנת L. reuteri DSM20016 תאים אלקטרוכשירים

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול של Berthier et ^al.17, עם מהירויות צנטריפוגה שהודיעו על ידי Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, יש לחסן את L. reuteri ממלאי גליצרול ל-6 מ"ל של מרק deMan Rogosa Sharpe (MRS). יש לדגור באופן אירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור סטטי.
2. למחרת בבוקר, לחסן 4 מ"ל של תרבית לילה לתוך 200 מ"ל של מרק MRS (דילול 1:50).
3. אפשר לגדול באופן אירובי באינקובטור סטטי של 37 מעלות צלזיוס עד שערך הצפיפות האופטית של 600 ננומ....

תוצאות

יעילות טרנספורמציה
L. reuteri אינו דורש פלסמיד dcm^-/dam^- ללא מתילציה, כפי שנצפה עבור לקטובצילאים^{אחרים 19,20} (ראה איור 1). אלקטרופורציה של L. reuteri DSM20016 עם 10 μL של pTRKH3_mCherry2 פלסמיד 8.5 kb (pAMβ1 theta origin of replication) אמורה לתת יעילות.......

Discussion

השלב הקריטי ביותר לשינוי של L. reuteri DSM20016 הוא יצירת תנאי צמיחה אנאירוביים לאחר טרנספורמציות מצופות; מושבות שנרכשות בתנאים אירוביים הן רק מזדמנות מאוד ובדרך כלל אינן מצליחות לגדול כאשר מחוסנים במרק MRS. יש לתרגל גם ציפוי של כל נפח ההתאוששות כדי למקסם את ההסתברות לצמיחת מושבה. אפילו עם שני .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production