A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.
לקטובצילוס היה סוג גדול ומגוון להפליא של חיידקים שכלל 261 מינים, כמה מהם זנים קומנסליים עם פוטנציאל לשימוש כמארז למאמצים ביולוגיים סינתטיים במערכת העיכול. השונות הפנוטיפית והגנוטיפית הרחבה שנצפתה בתוך הסוג הובילה לאחרונה לסיווג מחדש ולהכנסת 23 סוגים חדשים.
בשל רוחב הווריאציות בתוך הז'אנר הישן, פרוטוקולים שהודגמו בחבר אחד עשויים שלא לעבוד כפי שפורסם עם חברים אחרים. מחסור במידע מרוכז על איך בדיוק לתפעל זנים ספציפיים הוביל למגוון גישות אד-הוק , שלעתים קרובות מותאמות ממשפחות חיידקים אחרות. זה יכול לסבך את העניינים עבור חוקרים מתחילים בתחום, שאולי לא יודעים איזה מידע חל או לא חל על הזן הנבחר שלהם.
במאמר זה, אנו שואפים לרכז סדרה של פרוטוקולים עם הצלחה מוכחת, במיוחד בכינוי זן Limosilactobacillus reuteri F275 (מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם ייעוץ לפתרון בעיות ובעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן. פרוטוקולים אלה אמורים לאפשר לחוקר עם ניסיון מועט, אם בכלל, בעבודה עם L. reuteri DSM20016 לשנות פלסמיד, לאשר טרנספורמציה ולמדוד משוב מערכת בקורא צלחות באמצעות חלבון כתב.
הסוג לקטובצילוס סווג היסטורית כגראם-חיובי, בצורת מוט, שאינו יוצר נבגים, אנארובים פקולטטיביים או מיקרו-אירופילים המפרקים סוכרים לייצור חומצה לקטית1. קריטריונים רופפים אלה הובילו לכך שלקטובצילוס היה, מבחינה פנוטיפית וגנוטיפית, סוג מגוון ביותר. סיווג רחב זה הביא לסיווג מחדש של הסוג, והציג 23 סוגים חדשים בשנת 20202.
הסוג הוותיק והרחב יותר כלל זנים עיקריים של קומנסל ופרוביוטיקה הנחשבים בדרך כלל בטוחים לצריכה (GRAS)3. משפחת Lactobacillaceae שומרת על תפיסה ציבורית של היותם "חיידקים טובים" בשל היתרונות הבריאותיים המדווחים הרבים המוענקים באמצעות
1. הכנת L. reuteri DSM20016 תאים אלקטרוכשירים
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול של Berthier et al.17, עם מהירויות צנטריפוגה שהודיעו על ידי Rattanachaikunsopon et al.18.
יעילות טרנספורמציה
L. reuteri אינו דורש פלסמיד dcm-/dam- ללא מתילציה, כפי שנצפה עבור לקטובצילאיםאחרים 19,20 (ראה איור 1). אלקטרופורציה של L. reuteri DSM20016 עם 10 μL של pTRKH3_mCherry2 פלסמיד 8.5 kb (pAMβ1 theta origin of replication) אמורה לתת יעילות.......
השלב הקריטי ביותר לשינוי של L. reuteri DSM20016 הוא יצירת תנאי צמיחה אנאירוביים לאחר טרנספורמציות מצופות; מושבות שנרכשות בתנאים אירוביים הן רק מזדמנות מאוד ובדרך כלל אינן מצליחות לגדול כאשר מחוסנים במרק MRS. יש לתרגל גם ציפוי של כל נפח ההתאוששות כדי למקסם את ההסתברות לצמיחת מושבה. אפילו עם שני .......
אין ניגודי עניינים.
אנו מעריכים מאוד את עצתו רבת הערך של פרופ' J.P. van Pijkeren (אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון), שהדרכתו בעבודה עם L. reuteri ATCC PTA 6475 סיפקה בסיס לשיטות המתוארות כאן.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
Agarose | BioShop | AGR001 | |
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
Glycerol | BioShop | GLY001 | |
Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
Sucrose | BioShop | SUC507 | |
TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved