בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34+ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

Summary

מחקר זה ביסס שיטה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וקביעה תפקודית של תאי גזע שוכני דופן כלי דם CD34⁺ (CD34⁺ VW-SCs). שיטת בידוד קלה למעקב וחסכונית בזמן זו יכולה לשמש חוקרים אחרים כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים המעורבים במחלות לב וכלי דם.

Abstract

תאי גזע ותאי אב תושבי CD34⁺ שוכנים בדופן כלי הדם (VW-SCs) מוכרים יותר ויותר בזכות תפקידם המכריע בוויסות פגיעה ותיקון כלי דם. הקמת שיטה יציבה ויעילה לתרבית תפקודית של תאים מסוג CD34⁺ VW-SCs חיונית להמשך חקירת המנגנונים המעורבים בהתפשטות, נדידה והתמיינות של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. השיטה המתוארת משלבת סינון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה לטיהור תושבות ראשוניות CD34⁺ פולקסווגן SC. התאים המטוהרים מזוהים לאחר מכן באופן פונקציונלי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיית Ca²⁺ . בקצרה, תאים וסקולריים מן adventitia של אבי העורקים murine ועורק mesenteric מתקבלים באמצעות חיבור בלוק רקמות, ואחריו subculturing עד להגיע לספירת תאים של לפחות 1 × 10⁷. לאחר מכן, CD34⁺ VW-SCs מטוהרים באמצעות מיון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה. זיהוי של CD34⁺ VW-SCs כרוך בצביעת אימונופלואורסצנטיות תאית, בעוד שריבוי עוצמה תפקודית נקבעת על ידי חשיפת תאים למדיום תרבית ספציפי לצורך התמיינות מכוונת. יתר על כן, שחרור Ca²⁺ פנימי פונקציונלי וכניסת Ca²⁺ חיצונית מוערכים באמצעות תחנת עבודה הדמיה זמינה מסחרית בתאים עמוסי Fura-2/AM שנחשפו ל- ATP, קפאין או תפסיגרגין (TG). שיטה זו מציעה טכניקה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וזיהוי תאי גזע CD34⁺ השוכנים בדופן כלי הדם, ומספקת הזדמנות למחקרי מבחנה על מנגנוני הבקרה של VW-SCs וסינון תרופות ממוקדות.

Introduction

דופן כלי הדם ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות כלי הדם, בוויסות ההומיאוסטטי ובהתקדמות מחלות כלי הדם. בשנים האחרונות, מחקרים רבים חשפו את נוכחותן של שושלות תאי גזע שונות בעורקים. בשנת 2004, קבוצתו של פרופסור צ'ינגבו שו דיווחה לראשונה על קיומם של תאי גזע / אב וסקולריים בפריפריה של דופן כלי הדם הבוגרים, המבטאים CD34, Sca-1, c-kit ו- Flk-1¹. תאי גזע וסקולריים אלה מפגינים התמיינות רב-כיוונית ופוטנציאל התפשטות. בתנאים רגילים, הם נשארים שקטים יחסית; עם זאת, כאשר הם מופעלים על ידי גורמים ספציפיים, הם יכולים להתמיין לתאי שריר חלק, תאי אנדותל ופיברובלסטים. לחלופין, הם יכולים לווסת את המטריצה perivascular ואת היווצרות microvessel באמצעות אפקטים paracrine כדי לקדם תיקון או שיפוץ של כלי דם פצועים 2,3,4,5,6. לאחרונה, תאי גזע CD34⁺ בדופן כלי הדם נמצאו כממלאים תפקיד בהתחדשות תאי אנדותל לאחר פגיעה בעורק הירך². כתוצאה מכך, הבידוד והכימות של CD34⁺ VW-SCs ובחינת המאפיינים הביולוגיים הבסיסיים של תאי גזע CD34⁺ חיוניים להמשך לימוד מסלולי האותות המעורבים בוויסות של CD34⁺ VW-SCs.

קיימות כיום שיטות שונות להפרדת תאים, כולל טכניקות המבוססות על מאפייני תרבית תאים או תכונות פיזיקליות של תאים כגון צנטריפוגת שיפוע צפיפות, המביאה לתאים ממוינים המכילים תאים רבים שאינם מטרה וטוהר נמוך יחסית 7,8,9,10,11,12 . טכניקה נפוצה נוספת היא מיון תאים פלואורסצנטי/מגנטי. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) היא מערכת מורכבת עם דרישות טכניות גבוהות, והיא יקרה יחסית, גוזלת זמן רב ועלולה להשפיע על פעילות התאים הממוינים ^13,14. עם זאת, מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית (MACS) יעיל ונוח יותר, עם קצב התאוששות גבוה ופעילות תאים גבוהה ופחות השפעה על יישומים במורד הזרם⁸. לכן, בפרוטוקול זה, יישמנו MACS כדי לטהר CD34⁺ VW-SCs וזיהינו עוד יותר את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. הקמת שיטות בידוד מבוססות MACS לחקר תאי גזע של דופן כלי הדם תהיה רבת ערך. ראשית, הוא מאפשר ניסויים גנטיים וביולוגיים של התא. שנית, בידוד יעיל ותרבית של תאי גזע השוכנים בדופן כלי הדם מאפשרים הערכה שיטתית וסינון של גורמי איתות המווסתים את תפקודי תאי הגזע. שלישית, זיהוי פנוטיפים חיוניים בתאי גזע מספק "בקרת איכות" חשובה בהערכת מצב התא. לפיכך, זיהוי שיטות לטיהור יכול להיות שימושי עבור יישומים דומים לתאי גזע מקבילים שמקורם בכלי דם.

דוח זה מספק הדגמה מפורטת של שיטה יציבה ואמינה לתרבית של CD34⁺ VW-SCs, כולל זיהוי תאים והערכה תפקודית המבוצעת על ידי ציטומטריית זרימה, צביעה אימונופלואורסצנטית ומדידת איתות Ca²⁺ . מחקר זה מספק בסיס למחקר מעמיק נוסף על תפקודם של CD34⁺ VW-SCs ומנגנוני הבקרה שלהם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר, ובעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות לניהול ושימוש בחיות מעבדה בסין. המחקר עמד בקפדנות בדרישות האתיות של ניסויים בבעלי חיים, באישור ועדת האתיקה של בעלי חיים (מספר אישור: SWMU2020664). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בריאים בני שמונה שבועות משני המינים, במשקל שבין 18-20 גרם. בעלי החיים שוכנו במרכז חיות המעבדה של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט (SWMU).

1. תרבית בלוק רקמות של adventitia מאבי העורקים ועורקים mesenteric

1. בידוד תושב CD34⁺ פולקסווגן SC
   1. מרדימים שני עכברים עם שאיפת איזופלורן 3% (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). יש לוודא הרדמה מספקת על ידי צביטת בוהן. מקמו את העכבר בשכיבה בעזרת סרט רפואי וריססו חומר חיטוי אתנול 70% לחיטוי פרוות העכבר. פתח את חללי החזה והבטן באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים כדי לחשוף את הלב והמעיים. לאחר ניתוח אבי העורקים והעורקים המזנטריים המבודדים, נעצו את אבי העורקים והמצע המזנטרי בצלחת פטרי המכילה אלסטומר סיליקון וממולאת בתמיסת מלח פיזיולוגית. עם קבוצה נוספת של מספריים מעוקרים ומלקחיים, לנתח במהירות את השומן סביב אבי העורקים עורקים mesenteric.
   2. מעבירים את הרקמות המנותחות לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילה תמיסת 1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B (ראו טבלת חומרים). לאחר שטיפה פעמיים, מעבירים את העורקים למכסה מנוע של תרבית רקמה תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   3. חתכו את העורקים לאורכם והשתמשו במלקחיים עדינים כדי לקלף את השכבה החיצונית של אבי העורקים ואת הענף הראשון של העורקים המזנטריים. מעבירים את השכבות החיצוניות לצלחת פטרי בקוטר 3.5 ס"מ המכילה 0.1-0.2 מ"ל מדיום תרבית (ראו טבלת חומרים). חותכים את השכבות החיצוניות לחתיכות זעירות (כ-1 מ"מ³).
   4. מעבירים את חתיכות הרקמה לצלוחית T25 מצופה ג'לטין, ומבטיחים פיזור אחיד בתחתית הצלוחית. שמור על מרחק מתון בין חלקי הרקמה כדי להקל על זחילת התאים וצמיחה. מניחים את הבקבוק במאונך באינקובטור (37°C, 5% CO₂) למשך 3 שעות כדי לאפשר לגושי הרקמה להיצמד לתחתית הצלוחית.
   5. לאחר 3 שעות, להוסיף 5 מ"ל של DMEM גבוה גלוקוז צמיחה בינוני כדי לטבול את בלוקים רקמות. כיוון את בקבוק T25 אופקית. עקוב אחר נדידת תאים סביב גושי רקמות באמצעות מיקרוסקופ במרווחים של 3 ימים.
      הערה: המדיום צריך להכיל 20% נסיוב בקר עוברי, 0.2% גורם מעכב לוקמיה (LIF), 0.2 mM β-Mercaptoethanol, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ראה טבלה של חומרים). סרום בקר עוברי תומך בהתרבות תאים, בעוד LIF ו-β-Mercaptoethanol מעכבים התמיינות תאים ^7,8.
   6. כאשר התאים בבקבוק T25 מגיעים לכ-80% מפגש, יש לעבור ולתרבת אותם לצלוחית T75 אחת או שתיים. תרבית משנה של התאים על פני חמישה מעברים כדי להבטיח גדילה תקינה ובריאות.
2. הפרדה מגנטית של תאי גזע תושבי CD34⁺
   1. כאשר התאים בצלוחיות T75 אחת או שתיים מגיעות למפגש של 80%, נתק את התאים עם טריפסין, והשהה אותם מחדש ב -1 מ"ל של חיץ מיון (2 mM EDTA ו- 0.5% FBS). קבע את מספר התא (10⁷/T75 צלוחיות) וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם למשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר).
   2. השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את גלולת התא ב-98 מיקרוליטר של חיץ מיון לכל 10⁷ תאים בסך הכל. הוסף נוגדן CD34 2 μL (ראה טבלת חומרים). יש לערבב היטב ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C בחושך עם רעידות מדי פעם.
   3. לשטוף תאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ מיון וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הסר את supernatant בזהירות ולחלוטין, ו resuspend את התאים ב 80 μL של חיץ מיון.
   5. הוסף 20 μL Anti-FITC MicroBeads (לכל 10⁷ תאים סה"כ, ראה טבלת חומרים) לתוך המאגר. יש לערבב היטב על ידי פיפטינג חוזר ונשנה ולדגור במשך 15 דקות בחום של 4°C בחושך עם ניעור לסירוגין.
   6. שטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות כדי לדחות תאים. השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של חיץ.
   7. מקם עמודת MS אחת בתוך השדה המגנטי של מפריד מתאים, וודא שצינור איסוף (למשל, צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל) ממוקם מתחת לעמודת MS כדי לאסוף את הרכיבים המופרדים. (ראה טבלת חומרים). שטפו את העמוד עם חיץ של 500 μL והמתינו עד שהוא יעבור לחלוטין.
   8. טען את תרחיף התא לתוך העמודה ואסוף את הזרימה המכילה תאים לא מסומנים לתוך צינור 15 מ"ל.
   9. הסר את העמוד מהמפריד והנח אותו על צינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הכנס 500 μL של מאגר לתוך העמודה, ולאחר מכן שטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפת הבוכנה לתוך העמודה.
   10. כדי לשפר את הטוהר של תאי CD34⁺ , החלק המדולל יכול לעבור העשרה באמצעות עמודת MS שנייה. חזור על תהליך ההפרדה כאמור לעיל. להעריך את טוהר התאים הממוינים באמצעות ציטומטריית זרימה.
       הערה: בדרך כלל, 10%-20% CD34⁺ תאים מתקבלים, עם סביב 70%-80% תאים שליליים, וכ 10% אובדן עקב צביעה וצנטריפוגות הליכים.
   11. כדי לאשר עוד יותר את הטוהר של תאי גזע CD34⁺ דופן כלי הדם, לזהות את התאים ממוינים על ידי ציטומטריית זרימה. המחקר הנוכחי הראה טוהר של יותר מ-90%.

2. זיהוי תאים על ידי immunofluorescence

1. תאי זרעים על גבי כיסויים (קוטר 8 מ"מ) מצופים מראש ב-0.04% ג'לטין.
2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 60%-70%, שטפו פעמיים עם PBS וקיבעו את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות.
3. שטפו תאים עם PBS במשך 3 דקות (3 פעמים), וחדרו את התאים עם 0.2% Triton X-100 (ב-PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. יש לשטוף תאים עם PBS למשך 3 דקות (3 פעמים), ולחסום את הקישור הלא ספציפי של הנוגדנים עם סרום חמור 5% (ב-PBS) למשך שעה אחת.
5. הסר את המאגר החוסם על ידי החזקת כל מכסה על קצהו עם מלקחיים וניקוז אותו על יריעה של ניגוב ללא מוך.
6. לדגור על התאים בנוגדנים ראשוניים מדוללים פי 100 (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, ראו טבלת חומרים) ב-1% BSA (ב-PBS) למשך הלילה ב-4°C.
7. דקרו את התמיסה ושטפו את התאים עם PBS במשך 3 דקות (3 פעמים). יש לדגור על התאים עם נוגדן משני Alexa Fluor 488 (1:200 ב-1% BSA) (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך.
8. בצע צביעה נגדית של DAPI על ידי דילול תמיסת מלאי DAPI ל- 0.5 מיקרוגרם/מ"ל ב- PBS ותאי דגירה למשך 5 דקות.
9. יש לשטוף עם PBS ולאטום את הכיסויים עם מגיב נגד דהייה. צלם תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

3. בידול מושרה ואפיון של CD34⁺ פולקסווגן SC

1. זרע CD34⁺ תאי גזע בצפיפות מתאימה (40%-50% מפגש) על כיסויים וצלחות 6 בארות, בהתאמה.
2. השראת התמיינות מונחית תאי אנדותל מתאי CD34⁺ על ידי תרבית תאים בתרבית תאי אנדותל בינונית EBM-2 (ראה טבלת חומרים) למשך שבוע אחד.
3. השראת התמיינות מונחית תאי פיברובלסט מתאי CD34⁺ על ידי תרבית תאים בתרבית תאים פיברובלסטים בינונית FM-2 (ראה טבלת חומרים) למשך 3 ימים.
4. יש להכפיף את התאים הבלתי ממוינים והממוינים לצביעת אימונופלואורסצנטיות (כפי שהוזכר בשלב 2) בעירור לייזר של 488 ננומטר ומטרה של פי 40. זיהוי ביטוי של סמני תאי אנדותל (CD31, VWF) וסמנים של תאי פיברובלסט (PDGFRα, Vimentin) (ראה טבלת חומרים).
5. נתק את התאים עם טריפסין ולקבל את גלולת התא על ידי צנטריפוגה (300 x גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר). תאים מושהה מחדש עם 100 μL של מאגר מיון. יש לדגור מראש על תרחיף התא עם CD16/CD32 mAb מטוהר נגד עכבר (1 מיקרוגרם) (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות.
6. הוסף 2 μL של PE Rat נגד עכבר CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) נוגדן חד-שבטי APC (2 μL, 1:50) ו- CD140a (PDGFRa) נוגדן חד-שבטי FITC (2 μL, 1:50) ישירות לתאים מודגרים מראש בנוכחות Mouse Fc Block ודגרה נוספת ב- 4 ° C למשך 15 דקות.
7. שטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות (טמפרטורת החדר) כדי לדחות את התאים. השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את התאים ב-300 מיקרוליטר של חיץ. הכניסו צינורות זרימה עם תאים מוכתמים לקופסת קרח מוכנה לציטומטריית זרימה.

4. זיהוי איתות תוך תאי Ca²⁺ בתאי גזע CD34+ וסקולריים

1. תאי זרעים על כיסויים 10 שעות לפני ניסויים בצפיפות של עד 70% מפגש.
2. הוציאו את הכיסויים והדביקו אותם לתחתית תא מותאם אישית עם כל ג'לי נפט.
3. שטפו את הכיסויים פעם אחת עם PBS, החליפו בפורה-2/AM (5 מיקרומטר) בתמיסה של Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5.4 mM, MgCl₂ 1.2 mM, גלוקוז 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2.4 mM) (ראה טבלת חומרים), ודגרו על תאים למשך 30 דקות בחושך.
4. הסר את הצבע על ידי טיפול עם הפתרון של Tyrode במשך 10 דקות כדי לאפשר fura-2/AM de-esterification.
5. הרכיבו את התא על במה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במערכת הדמיה רחבת שדה המכילה מונוכרומטור ומצלמת CCD (ראו טבלת חומרים).
6. פתח את החלון הראשי, עבור אל תיבת הדו-שיח תפוס הגדרות ודף מצלמה ולחץ על הלחצן החי לתצוגת תמונה חיה .
7. בחר את סוג התמונה הפלואורסצנטית, הגדר את זמני החזרה על לולאה של 340 ננומטר/380 ננומטר, גודל התמונה וזמן החשיפה של המצלמה ל- 380 ננומטר ו- 340 ננומטר כדי להשיג בהירות תמונה מיטבית.
8. צלם תמונות בודדות וצייר מספר קווים חופשיים כדי להקיף את התאים בצבעים שונים ולהגדיר מראש אזור עניין (ROIs), תוך ציון הרקע כ- ROI 0.
9. ערוך מחדש פרוטוקול שכבר מוטבע בתצוגת סביבת העבודה וצור סביבת עבודה חדשה.
10. הפעל את הפרוטוקול, וה- "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" יציג את הגרף הקינטי המקוון.
11. בתצוגה המספרית, גיליון אלקטרוני יהיה גלוי, המציג עמודות של ערכים בקנה מידה אפור ומידע זמן מתאים. יצא את נתוני הגיליון האלקטרוני באמצעות הלוח.
12. חשב F340 nm/F380 nm המציין שינויים תוך-תאיים Ca²⁺ לאחר הפחתת פלואורסצנטיות הרקע (ROI 0).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בידוד וטיהור של CD34⁺ VW-SCs
טוהר גבוה של CD34⁺ VW-SCs מתקבל מן adventitia של העכבר אבי העורקים עורק mesenteric על ידי חיבור רקמות ומיון microbead מגנטי. אחוז תאי CD34⁺ בדופן כלי הדם הוא בדרך כלל 10%-30%. ציטומטריית זרימה מאשרת שהטוהר של תאי CD34⁺ המתקבל על-ידי מיון חרוזים מגנטי הוא יותר מ-90...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקר זה מספק שיטה מהירה ונוחה להשגת CD34⁺ פולקסווגן SCs פונקציונליים מאבי העורקים והעורקים המזנטריים של עכברים. CD34⁺ פולקסווגן SC המתקבלים בשיטה זו הם בעלי פעילות שגשוג ותכונות בידול רב-כיווניות. קולטני טריפוספט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP₃Rs), קולטני ריאנודין (RyRs) ותעלות סידן המופע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023