A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.
דג זברה הוא אורגניזם מודל מסקרן הידוע ביכולת התחדשות הלב המרשימה שלו. חקר הלב המתכווץ in vivo חיוני להשגת תובנות לגבי שינויים מבניים ותפקודיים בתגובה לפציעות. עם זאת, השגת תמונות 4 ממדיות ברזולוציה גבוהה ובמהירות גבוהה (4D, 3D מרחבי + 1D טמפורלי) של לב דג הזברה כדי להעריך את ארכיטקטורת הלב ואת התכווצות נותר מאתגר. בהקשר זה, מיקרוסקופ אור פנימי (LSM) וניתוח חישובי מותאם אישית משמשים כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה. אסטרטגיה זו, הכוללת בניית מערכת LSM, סנכרון רטרוספקטיבי, מעקב אחר תא בודד וניתוח מכוון משתמש, מאפשרת לחקור את מבנה המיקרו ואת תפקוד ההתכווצות על פני הלב כולו ברזולוציה של תא בודד בזחלי דגי הזברה Tg (myl7:nucGFP) הטרנסגניים. בנוסף, אנו מסוגלים לשלב מיקרו-הזרקה של תרכובות מולקולות קטנות כדי לגרום לפגיעה לבבית באופן מדויק ומבוקר. בסך הכל, מסגרת זו מאפשרת לעקוב אחר שינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, כמו גם אחר המכניקה האזורית ברמת התא הבודד במהלך מורפוגנזה והתחדשות לבבית.
דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם מודל נפוץ לחקר התפתחות הלב, הפיזיולוגיה והתיקון שלו בשל השקיפות האופטית שלו, יכולת הגמישות הגנטית שלו ויכולת ההתחדשות שלו 1,2,3,4. עם אוטם שריר הלב, בעוד שינויים מבניים ותפקודיים משפיעים על פליטת הלב והמודינמיקה, מגבלות טכניות ממשיכות לעכב את היכולת לחקור את התהליך הדינמי במהלך התחדשות הלב ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. לדוגמה, לשיטות הדמיה קונבנציונליות, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי, יש מגבלות במונחים של עומק הדמיה, רזולוציה טמפורלית או פוטוטוקסיות ללכידת השינויים הדינמיים ולהערכת תפקוד התכווצות הלב במ....
אישור למחקר זה ניתן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טקסס בדאלאס, תחת פרוטוקול מספר #20-07. Tg(myl7:nucGFP) זחלי זברה טרנסגניים12 שימשו במחקר הנוכחי. כל איסוף הנתונים ועיבוד התמונה לאחר מכן בוצעו באמצעות תוכנות קוד פתוח או פלטפורמות עם רישיונות מחקר או חינוך. המשאבים זמינים מהמחברים על פי בקשה סבירה.
1. גידול דגי זברה ומיקרו-הזרקה של עוברים
תזמון: יומיים
הפרוטוקול הנוכחי מורכב משלושה שלבים עיקריים: הכנה ומיקרו-הזרקה של דגי זברה, הדמיה של יריעות אור ושחזור תמונה 4D, ומעקב אחר תאים ואינטראקציית VR. דגי זברה בוגרים הורשו להזדווג, הביציות המופרות נאספו וביצעו מיקרו-הזרקה לפי הצורך עבור הניסויים המוצעים (איור 1). שלב זה מספק נקודת ?.......
השילוב של מודל דג הזברה עם שיטות הנדסיות טומן בחובו פוטנציאל עצום לחקר in vivo של אוטם שריר הלב, הפרעות קצב ומומי לב מולדים. תוך מינוף השקיפות האופטית, יכולת ההתחדשות והדמיון הגנטי והפיזיולוגי לבני אדם, עוברים וזחלים של דגי זברה הפכו בשימוש נרחב במחקר 1,2,4
למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.
אנו מביעים את תודתנו לד"ר קרוליין ברנס מבית החולים לילדים בבוסטון על כך שחלקה בנדיבות את דג הזברה המהונדס. אנו מודים לגב' אליזבת איבנז על עזרתה בגידול דגי זברה ביוטה דאלאס. אנו מעריכים גם את כל ההערות הבונות המסופקות על ידי חברי החממה D ב- UT Dallas. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
Animal models | |||
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
Light-sheet system | |||
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 | |
20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M | |
Rotation stepper motor | Pololu | 1474 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
Microinjector and vacuum pump | |||
Microinjector | WPI | PV850 | |
Vacuum pump | Welch | 2522B-01 | |
Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 | |
Virtual reality hardware | |||
VR headset | Meta | Quest 2 | |
30mg/L PTU solution | |||
PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
1X E3 working solution | - | - | |
1% Agarose | - | - | |
Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | - | - | |
10g/L Tricaine stock solution | |||
Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
Deionized water | - | - | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
150mg/L Tricaine working solution | |||
10g/L Tricaine stock solution | - | - | |
Deionized water | - | - | |
60X E3 stock solution | |||
Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
Potassium Chloride | - | KCL | |
Calcium Chloride Dihydrate | - | CaCL2 x 2H2O | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | - | MgSO4 x 7H2O | |
RO Water | - | - | |
1X E3 working solution | |||
60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
RO Water | - | - | |
1% Methylene Blue (optional) | - | C16H18ClN3S |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved