A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

Abstract

דג זברה הוא אורגניזם מודל מסקרן הידוע ביכולת התחדשות הלב המרשימה שלו. חקר הלב המתכווץ in vivo חיוני להשגת תובנות לגבי שינויים מבניים ותפקודיים בתגובה לפציעות. עם זאת, השגת תמונות 4 ממדיות ברזולוציה גבוהה ובמהירות גבוהה (4D, 3D מרחבי + 1D טמפורלי) של לב דג הזברה כדי להעריך את ארכיטקטורת הלב ואת התכווצות נותר מאתגר. בהקשר זה, מיקרוסקופ אור פנימי (LSM) וניתוח חישובי מותאם אישית משמשים כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה. אסטרטגיה זו, הכוללת בניית מערכת LSM, סנכרון רטרוספקטיבי, מעקב אחר תא בודד וניתוח מכוון משתמש, מאפשרת לחקור את מבנה המיקרו ואת תפקוד ההתכווצות על פני הלב כולו ברזולוציה של תא בודד בזחלי דגי הזברה Tg (myl7:nucGFP) הטרנסגניים. בנוסף, אנו מסוגלים לשלב מיקרו-הזרקה של תרכובות מולקולות קטנות כדי לגרום לפגיעה לבבית באופן מדויק ומבוקר. בסך הכל, מסגרת זו מאפשרת לעקוב אחר שינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, כמו גם אחר המכניקה האזורית ברמת התא הבודד במהלך מורפוגנזה והתחדשות לבבית.

Introduction

דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם מודל נפוץ לחקר התפתחות הלב, הפיזיולוגיה והתיקון שלו בשל השקיפות האופטית שלו, יכולת הגמישות הגנטית שלו ויכולת ההתחדשות שלו 1,2,3,4. עם אוטם שריר הלב, בעוד שינויים מבניים ותפקודיים משפיעים על פליטת הלב והמודינמיקה, מגבלות טכניות ממשיכות לעכב את היכולת לחקור את התהליך הדינמי במהלך התחדשות הלב ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. לדוגמה, לשיטות הדמיה קונבנציונליות, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי, יש מגבלות במונחים של עומק הדמיה, רזולוציה טמפורלית או פוטוטוקסיות ללכידת השינויים הדינמיים ולהערכת תפקוד התכווצות הלב במ....

Protocol

אישור למחקר זה ניתן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טקסס בדאלאס, תחת פרוטוקול מספר #20-07. Tg(myl7:nucGFP) זחלי זברה טרנסגניים12 שימשו במחקר הנוכחי. כל איסוף הנתונים ועיבוד התמונה לאחר מכן בוצעו באמצעות תוכנות קוד פתוח או פלטפורמות עם רישיונות מחקר או חינוך. המשאבים זמינים מהמחברים על פי בקשה סבירה.

1. גידול דגי זברה ומיקרו-הזרקה של עוברים

תזמון: יומיים

  1. לשמור ולגדל דגי זברה בוגרים באמצעות טיפול סטנדרטי ונהלי גזע. לקבלת שיטות מפורטות, עיין בדוח הקודם13.
  2. בצע מיקרו-הזרקה בהתאם לפרוטוקול<....

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי מורכב משלושה שלבים עיקריים: הכנה ומיקרו-הזרקה של דגי זברה, הדמיה של יריעות אור ושחזור תמונה 4D, ומעקב אחר תאים ואינטראקציית VR. דגי זברה בוגרים הורשו להזדווג, הביציות המופרות נאספו וביצעו מיקרו-הזרקה לפי הצורך עבור הניסויים המוצעים (איור 1). שלב זה מספק נקודת ?.......

Discussion

השילוב של מודל דג הזברה עם שיטות הנדסיות טומן בחובו פוטנציאל עצום לחקר in vivo של אוטם שריר הלב, הפרעות קצב ומומי לב מולדים. תוך מינוף השקיפות האופטית, יכולת ההתחדשות והדמיון הגנטי והפיזיולוגי לבני אדם, עוברים וזחלים של דגי זברה הפכו בשימוש נרחב במחקר 1,2,4

Disclosures

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מביעים את תודתנו לד"ר קרוליין ברנס מבית החולים לילדים בבוסטון על כך שחלקה בנדיבות את דג הזברה המהונדס. אנו מודים לגב' אליזבת איבנז על עזרתה בגידול דגי זברה ביוטה דאלאס. אנו מעריכים גם את כל ההערות הבונות המסופקות על ידי חברי החממה D ב- UT Dallas. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RESOURCESOURCE/ReferenceIDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafishBurns Lab in Boston Children's HospitalZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLABThe MathWorks Inc.R2023a
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
PythonThe Python Software Foundation3.9.0
Fiji-ImageJSchneider et al.181.54f
3DeeCellTrackerChentao Wen et al.15v0.5.2
UnityUnity Software Inc.2020.3.2f1
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
3D SlicerAndriy Fedorov et al.175.2.1
ITK SNAPPaul A Yushkevich et al.164
Light-sheet system
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
4X Illumination objectiveNikonMRH00045
20X Detection objectiveOlympus1-U2M585
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Motorized XYZ stageThorlabsPT3/M-Z8
Two-axis tilt stageThorlabsGN2/M
Rotation stepper motorPololu1474
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
473nm DPSS LaserLaserglowR471003GX
532nm DPSS laserLaserglowR531003FX
Microinjector and vacuum pump
MicroinjectorWPIPV850
Vacuum pumpWelch2522B-01
Pre-Pulled Glass PipettesWPITIP10LT
Capillary tip for gel loadingBio-Rad2239912
Virtual reality hardware
VR headsetMetaQuest 2
30mg/L PTU solution
PTUSigma-AldrichP7629
1X E3 working solution--
1% Agarose--
Low-melt agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
10g/L Tricaine stock solution
TricaineSyndelSYNC-M-GR-US02
Deionized water--
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution--
Deionized water--
60X E3 stock solution
Sodium ChlorideLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at DallasNaCl
Potassium Chloride-KCL
Calcium Chloride Dihydrate-CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate-MgSO4 x 7H2O
RO Water--
1X E3 working solution
60X E3 stock solutionLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas-
RO Water--
1% Methylene Blue (optional) -C16H18ClN3S

References

  1. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  2. Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE2034DVR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved