JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.

Abstract

בניית וקטורים של ביטוי גנים היא מרכיב חשוב בעבודת מעבדה בביולוגיה ניסויית. עם פיתוחים טכניים כמו Gibson Assembly, הבנייה הווקטורית הופכת לפשוטה ויעילה יחסית. עם זאת, כאשר הגנום באורך מלא של וירוס הרבייה והנשימה החזירי (PRRSV) אינו יכול להיות מוגבר בקלות על ידי תגובת שרשרת פולימראז יחידה (PCR) מ- cDNA, או שקשה לרכוש וקטור ביטוי גנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית של תוספות מרובות במבחנה, טכניקת הרכבת גיבסון הנוכחית אינה מצליחה להשיג מטרה זו.

כתוצאה מכך, מטרתנו הייתה לחלק את גנום PRRSV למספר מקטעים ולהכניס אתרי הגבלה מתאימים לתוך הפריימר ההפוך לקבלת מקטעים מוגברים PCR. לאחר חיבור מקטע הדנ"א הקודם לווקטור על ידי טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית, הווקטור החדש רכש את אתר המחשוף של אנזים ההגבלה. לפיכך, אנו יכולים ליצור ליניאריזציה של הווקטור באמצעות אתר מחשוף האנזים החדש שנוסף ולהציג את מקטע הדנ"א הבא במורד הזרם של מקטע הדנ"א במעלה הזרם.

אתר המחשוף של אנזים ההגבלה שהוכנס בקצה 3' של מקטע הדנ"א במעלה הזרם יבוטל, ואתר מחשוף חדש יוכנס לקצה 3' של מקטע הדנ"א במורד הזרם. בדרך זו אנו יכולים לחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה. שיטה זו ישימה לבנייה מוצלחת של וקטור ביטוי PRRSV והיא שיטה יעילה להרכבת מספר רב של שברים לווקטור הביטוי.

Introduction

כטכניקה חיונית לבניית כלים ניסיוניים מבוססי דנ"א לביטוי בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים, שיבוט מולקולרי הוא מרכיב חשוב מאוד בביולוגיה הניסויית. שיבוט מולקולרי כרוך בארבעה תהליכים: רכישת DNA מוחדר, קשירת האינסרט לווקטור המתאים, טרנספורמציה של הווקטור הרקומביננטי ל- Escherichia coli (E. coli), וזיהוי השיבוטים החיוביים1. עד כה אומצו שיטות רבות לצירוף מולקולות DNA באמצעות אנזימי הגבלה 2,3 ורקומבינציה בתיווך PCR 4,5,6. רקומבינציה הומולוגית, הידועה בשם טכנולוגיית שיבוט חלק, היא קבוצת שיטות שיבוט, המאפשרת החדרה בלתי תלויה ברצף וללא צלקת של מקטע DNA אחד או יותר לתוך וקטור. טכנולוגיה זו כוללת שיבוט בלתי תלוי ברצף וקשירה (SLIC), תמצית שיבוט קשירה חלקה (SLiCE), In-Fusion והרכבת גיבסון. הוא משתמש באקסונוקלאז כדי לפרק גדיל אחד של האינסרט ובווקטור כדי ליצור קצוות מלוכדים, או תיקון in vivo או רקומבינציה במבחנה כדי לצרף באופן קוולנטי את התוספת לווקטור על ידי יצירת קשרי פוספודיסטר. היכולת לחבר תוספת בודדת לווקטור בכל רצף ללא צלקות מושכת מאוד. יתר על כן, לטכנולוגיה יש את היכולת לחבר 5-10 שברים בסדר קבוע מראש ללא מגבלות רצף.

כאחת מטכניקות דנ"א רקומביננטיות רבות, טכניקת הרכבת גיבסון, כיום שיטת השיבוטהיעילה ביותר 7,8, היא שיטה חזקה ואלגנטית מבוססת אקסונוקלאז להרכבת מקטע DNA ליניארי אחד או יותר בצורה חלקה. תגובת הרכבת גיבסון מבוצעת בתנאים איזותרמיים באמצעות תערובת של שלושה אנזימים, כלומר אקסונוקלאז 5', פולימראז בנאמנות גבוהה וליגאז DNA תרמויציב. תעלות חד-גדיליות 3' שנוצרו על ידי אקסונוקלאז 5'-3' תורמות לחישול של שברים בעלי משלימות בקצה אחד. הפולימראז בעל הנאמנות הגבוהה ממלא ביעילות את הפערים באזורים החד-גדיליים המחושלים על ידי הוספת dNTPs, וליגאז הדנ"א התרמו-יציב אוטם את הניקים ליצירת מולקולות DNA משותפות8. לפיכך, שיטה טכנית זו כבר בשימוש נרחב לבניית וקטורים ביטוי גנים.

תסמונת הרבייה והנשימה של חזירים (PRRS) היא מחלה נגיפית המובילה לפגיעה במערכת הרבייה וכשל נשימתי בחזירים הנגרמת על ידי PRRSV בכל גיל9. התסמונת מתבטאת בחום, אנורקסיה, דלקת ריאות, עייפות, דיכאון ומצוקה נשימתית. יתר על כן, סימנים קליניים, כולל שינוי צבע אדום / כחול של האוזניים, נצפו בכמה מגיפות. כחבר בנגיף העורקים המשפחתי, PRRSV מועבר באופן נרחב למדינות המייצרות בשר חזיר על ידי מגע ישיר והחלפת נוזלים, כולל שתן, קולוסטרום ורוק. בשל התפשטות PRRSV בארצות הברית, סך ההפסדים הכלכליים של תעשיית בשר החזיר הוערך בכ -664 מיליון דולר בשנה, בהתבסס על היקף הרבייה של 5.8 מיליון זורעים ו -110 מיליון חזירים 10,11. דו"ח השירות לפיקוח על בריאות בעלי חיים וצמחים מראה כי 49.8% מהחזירים הלא מחוסנים מראים נוכחות של PRRSV בסרום12 ורמות נמוכות של PRRSV בחזירים נגועים מופרשות דרך רוק, הפרשות מהאף, שתן וצואה13. אסטרטגיות מרובות יושמו כדי לשלוט בהתפשטות PRRSV 14,15,16. בנוסף להליכי חיסול ליצירת אוכלוסיות שליליות לחלוטין לנגיף או שיפור הבטיחות הביולוגית והניהול, מתן חיסונים הוא אמצעי יעיל לשליטה ב- PRRS.

PRRSV הוא נגיף RNA עטוף, חד-גדילי, בעל חוש חיובי באורך של כ-15 קילו-בסיסים (kb). גנום PRRSV מורכב מלפחות 10 מסגרות קריאה פתוחות (ORFs), אזור קצר 5' לא מתורגם (5' UTR), וזנב פולי(A) במסוף 3' (איור 1A)17. הגנום של נגיף RNA בעל גדיל שלילי אינו מדבק ואילו הגנום של נגיפי RNA בעלי גדיל חיובי הוא מדבק. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות עבור RNA ו DNA transfection ליצירת צאצאים וירוס18. עם זאת, שיבוט המקטע באורך מלא המתאים לגנום הרנ"א הוא חיוני לבניית שיבוטים זיהומיים. בשל אופיו הארוך והמורכב של גנום PRRSV, לא ניתן להשיג בקלות את הגנום באורך מלא באמצעות PCR בבת אחת. בנוסף, למרות שהסינתזה המלאכותית של גנים PRRSV היא פתרון יעיל, סינתזה של מקטעים ארוכים היא לעתים קרובות יקרה. לפיכך, כדי לקבל את וקטור הביטוי באורך מלא PRRSV, ניסינו ליצור אותו על ידי שיטת הרקומבינציה ההומולוגית19,20 של הוספות מרובות. למרבה הצער, לא הצלחנו להשיג את וקטור ביטוי הגנים באורך מלא. לכן, במחקר זה, הוספנו אתרי הגבלה מתאימים לפריימר ההפוך והשגנו בהצלחה את וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי מספר סבבים של תגובות רקומבינציה הומולוגיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה גם להשיג מחיקה או מוטציה של גני המטרה ולצרף ביעילות מספר רב של מקטעי DNA לווקטור הביטוי.

Protocol

1. הכנת תבנית הגן PRRSV

  1. הפשיר את מלאי הנגיף ב 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).
  2. מוסיפים 0.2 מ"ל כלורופורם ומערבבים היטב. דוגרים במשך 3 דקות.
  3. צנטריפוגה את התערובת במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 ° C.
    הערה: התערובת מחולקת לשלושה שלבים, כלומר, שלב מימי חסר צבע, שלב בין-פאזי ושלב פנול-כלורופורם אדום.
  4. מוציאים את הפאזה המימית חסרת הצבע החוצה ומעבירים אותה לצינור חדש.
  5. מערבבים היטב את הפאזה המימית עם 0.5 מ"ל איזופרופנול ודגרים במשך 10 דקות ב-4°C.
  6. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-12,000 × גרם ב-4°C.
    הערה: בתחתית הצינור יש משקע RNA לבן.
  7. השתמש micropipette כדי להשליך את supernatant של הצינור.
  8. הוסף 1 מ"ל של אתנול 75% כדי להשעות מחדש את הגלולה ואת המערבולת לזמן קצר.
  9. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-7,500 × גרם ב-4°C. השתמש micropipette כדי להשליך את supernatant של הצינור.
  10. יבשו את הרנ"א למשך 5 דקות, הוסיפו 20-50 מיקרוליטר מים נטולי RNase כדי להשהות מחדש את הרנ"א, וערבבו היטב.
  11. המשך לביצוע תמלול הפוך; הגדר את התגובות לביצוע שעתוק לאחור כפי שמוצג בטבלה 1.
    הערה: כדי להבטיח שעתוק לאחור מוצלח, השתמש בתבניות RNA באיכות גבוהה.
  12. השתמש cDNA שנוצר עבור PCR או לאחסן אותו ב -20 ° C.

2. עיצוב פריימר PCR

  1. עיצוב הפריימר הקדמי
    1. פתח את התוכנה ובחר קובץ DNA חדש.
    2. הדבק את רצף הגנים PRRSV (GenBank: FJ548852.1) מ- NCBI לתוך התוכנה. לחץ על OK ליצירת קובצי הרצף.
    3. נתח את הרצף וסמן את צמתי השברים. עצבו את פריימר הרצף הספציפי קדימה של השברים. ברוב המקרים, טמפרטורת ההתכה העדיפה (Tm) היא בין 55 °C (55 °F) ל 62 °C (75 °F), ותכולת GC היא 40-60%.
    4. לחץ על פריימרים ובחר הוסף פריימר.
    5. הדבק את הרצף הספציפי והוסף רצפים חופפים של הווקטור לנוקלאוטיד 5' הראשון של פריימר הרצף הספציפי. ליד כל צומת, בחר 20-40 bp כדי לשמש כאזור החפיפה בין שני השברים הסמוכים.
    6. תן שם לפריימר הקדמי המכיל את התלויות ואת הרצף הספציפי (ראה איור משלים S1).
    7. לחץ על הוסף פריימר לתבנית.
  2. עיצוב פריימר הפוך
    1. נתח את הרצף וסמן את צמתי השבר בתוכנה. עצבו את פריימר הרצף הספציפי ההפוך של השברים.
    2. לחץ על פריימרים ובחר הוסף פריימר.
    3. הדבק את הרצף הספציפי והוסף את אתר ההגבלה לנוקלאוטיד 5' הראשון של פריימר הרצף הספציפי.
      הערה: אתרי ההגבלה שנוספו חייבים להיעדר מקטע ההוספה ומהווקטור, למעט אתרי השכפול המרובים.
    4. הוסף רצפים של 20-40 bp של וקטורים לנוקלאוטיד 5' הראשון של אתר ההגבלה.
    5. תן שם לפריימר ההפוך המכיל את התלויות ואת הרצף הספציפי (ראה איור משלים S1).
    6. לחץ על הוסף פריימר לתבנית.

3. PCR להגברת שברים

  1. הגדר שש תגובות PCR נפרדות (טבלה 2): עבור מקטע 1, השתמש בפריימרים P1 ו- P2 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 2, השתמש בפריימרים P3 ו- P4 (ראה איור משלים S2); עבור מקטע 3, השתמש בפריימרים P5 ו- P6 (ראה איור משלים S2); עבור מקטע 4, השתמש בפריימרים P7 ו- P8 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 5, השתמש פריימרים P9 ו P10; והשתמשו בפריימרים P11 ו-P12 כדי להגביר את קטע 6 (ראו איור משלים S2).
    הערה: הפשרה, ערבב וצנטריפוגה קצרה כל רכיב לפני השימוש.
  2. הפעל את ה- PCR באמצעות פרוטוקול שלושת השלבים בטבלה 2.
  3. הוסף 1 μL של מאגר טעינת DNA 6x ל 5 μL של מוצר PCR, ערבב וצנטריפוגה קצרה את התכולה.
  4. נתח את הדגימות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.

4. טיהור שברי PCR

הערה: טיהור מוצרי PCR מג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראה טבלת חומרים) חשוב לבניית וקטור.

  1. הוסף 9 μL של מאגר טעינת DNA 6x ל- 45 μL של מוצרי PCR, ערבב וצנטריפוגה קצרה את התכולה.
  2. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז / גולדוויו 1% כדי להפריד את מקטעי ה- DNA.
    הערה: אין לעשות שימוש חוזר במאגר פועל TAE מכיוון שערך ה- pH שלו ישפיע על שחזור מקטע DNA.
  3. לאחר הפרדה נאותה של להקות, השתמש באזמל חד כדי להסיר בזהירות את רצועות ה- DNA.
    הערה: מזערו את גודל פרוסת הג'ל על ידי חיתוך עודפי אגרוז.
  4. שוקלים את פרוסת הג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מ"ל, מוסיפים נפח שווה של חיץ קשירה לפרוסת הג'ל (למשל, 0.3 מ"ל לפרוסה של 0.3 גרם), ודגרים בטמפרטורה של 60°C למשך 7 דקות.
  5. הכנס עמודה קטנה בצינור איסוף של 2 מ"ל. הוסף 700 μL של תמיסת DNA/agarose משלב 4.4 לעמודה הקטנה.
  6. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.
  7. הוסף 300 μL של חיץ קישור וצנטריפוגה ב 13,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.
  8. הוסף 700 μL של חיץ כביסה וצנטריפוגה ב 13,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.
  9. סובב את העמודה הקטנה הריקה למשך 2 דקות במהירות מרבית כדי לייבש את מטריצת העמודות. מניחים את העמוד הקטן בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.
  10. הוסף 20 μL של מים deionized ישירות למרכז קרום עמוד ולתת לשבת בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות. צנטריפוגה במהירות של 13,000 × גרם למשך דקה.
  11. אחסן את ה- DNA ב -20 ° C.

5. הכנת וקטור ליניארי

הערה: לאחר הכנת הפלסמיד, ניתן להשתמש באנזימים שנבחרו כדי לחתוך אותו. עיכול ארוך או עיכול אנזימי כפול חיוניים להבטחת העיכול של כל הדנ"א. זה יפחית את מספר השיבוטים החיוביים הכוזבים בניסויים הבאים.

  1. ליניאריזציה של pVAX1
    1. הכינו את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר בסדר המצוין (טבלה 3).
      הערה: יש להוסיף את נפח המים כדי לשמור על נפח התגובה הכולל שצוין. כאן, 1 מיקרוגרם של פלסמיד התעכל עם אנזימים בתערובת התגובה. בהתאם לריכוז הפלסמיד, ניתן להתאים את נפח הפלסמיד בתערובת התגובה.
    2. מערבבים בעדינות; ואז לסובב למטה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום או בתרמוסטט מים למשך 60 דקות.
    3. בצע טיהור ג'ל בדומה לטיהור שברי PCR בסעיף 4 באמצעות ערכת מיצוי הג'ל (ראה טבלת חומרים).
  2. ליניאריזציה של pVAX1-F1
    הערה: pVAX1-F1 הוא הווקטור המתקבל מהסבב הראשון של pVAX1 (NdeI ו-HindIII) ומקטע 1 מחדש. pVAX1-F2 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F1 (NdeI) ומקטע 2 רקומבינציה. pVAX1-F3 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F2 (NdeI) ומקטע 3 רקומבינציה. pVAX1-F4 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F3 (NdeI) ומקטע 4 רקומבינציה. pVAX1-F5 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F4 (EcoRV ו-NtoI) ומקטע 5 רקומבינציה.
    1. עבור כל וקטור, הכינו את תערובת התגובה בנפרד בטמפרטורת החדר בסדר המצוין (טבלה 3).
    2. מערבבים בעדינות; ואז לסובב למטה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום או בתרמוסטט מים למשך 60 דקות.
    3. בצע טיהור ג'ל בדומה לטיהור שברי PCR בסעיף 4 באמצעות ערכת מיצוי הג'ל (ראה טבלת חומרים).

6. שיבוט לווקטור חדש

הערה: ניתן להשיג יעילות שיבוט טובה בעת שימוש ב- 50-200 ng של וקטור ותוספות.

  1. הגדר את תגובת השכפול וההרכבה החלקה של ExonArt (טבלה 4). התאם את נפח התגובה הכולל ל- 10 μL באמצעות H2O מעוקר ומערבב.
  2. לדגור את התגובה thermocycler במשך 15-60 דקות ב 50 ° C. אחסנו את הדגימות על קרח.
    הערה: הארכת הדגירה עד 60 דקות עשויה לשפר את יעילות ההרכבה.
  3. הפשירו DH5α תאים בעלי כשירות כימית על קרח.
  4. להוסיף 10 μL של מוצר הרכבה לתאים המוסמכים; לאחר מכן, מערבבים בעדינות על ידי פיטום למעלה ולמטה.
  5. מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות.
  6. יש לחמם ב-45°C למשך 45 שניות ולהעביר את הצינורות לקרח למשך 3 דקות.
  7. הוסף 900 μL של מדיום SOC לצינור.
  8. נערו את הצינור במהירות 225 סל"ד למשך שעה באינקובטור רעד בטמפרטורה של 37°C.
  9. צנטריפוגה את תגובת הטרנספורמציה ב 6,000 × גרם במשך 2 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של תווך SOC טרי.
  10. פזרו את תרחיף התא שעבר טרנספורמציה על צלחת LB נפרדת עם קנמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל.
  11. לדגור על כל הצלחות למשך הלילה ב 37 ° C. בחר מושבות בודדות בודדות מכל צלחת ניסוי.

7. ניתוח הטרנספורמטורים

  1. בחר שמונה מושבות לתוך 20 μL של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin.
  2. הגדר את תגובת ה-PCR של המושבה והפעל את ה-PCR (טבלה 5).
    הערה: עבור תגובת PCR של המושבה עבור קטע 1, השתמש בפריימרים P1 ו- P2 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 2, השתמש בפריימרים P3 ו- P4 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 3, השתמש בפריימרים P5 ו- P6 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 4, השתמש בפריימרים P7 ו- P8 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 5, השתמש פריימרים P9 ו P10; והשתמשו בפריימרים P11 ו-P12 כדי לזהות את מקטע 6 (ראו איור משלים S2).
  3. הוסף 1 μL של 6x מאגר טעינת DNA ל 5 μL של מוצר PCR, לערבב, ו צנטריפוגה קצרה את התוכן.
  4. נתח את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.
  5. בחר מושבה חיובית אחת לתוך 5 מ"ל של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ולגדול בן לילה ב 37 ° C.
  6. יש להשיג את הפלסמיד באמצעות ערכת מיני פלסמיד DNA (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  7. דמיינו את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.

תוצאות

במאמר זה אנו מציגים מערכת רקומבינציה במבחנה להרכבה ותיקון של מולקולות דנ"א חופפות באמצעות פריימר הפוך באמצעות אתרי הגבלה שמוצגים ללא הרף (איור 1B). מערכת זו היא הליך פשוט ויעיל הכולל את הכנת הווקטור הליניארי ואת קטעי ההוספה המכילים שלוחות שהוכנסו על ידי PCR עם פריימרים ב...

Discussion

טכניקת ההרכבה של גיבסון (באנגלית: Gibson assembly technique) היא שיטת שיבוט מולקולרי מבוססת רקומבינציה חוץ גופית להרכבת מקטעי DNA8. שיטה זו מאפשרת הרכבה של מקטעי דנ"א מרובים לפלסמיד מעגלי בתגובה איזותרמית של צינור יחיד. עם זאת, אחד המכשולים לטכניקת הרכבת גיבסון הוא רכישת מקטעים ארוכים ...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי התמיכה הכספית של קרנות ייזום מחקר דוקטורט שסופקו על ידי אוניברסיטת סין מערב נורמלי (מס '20E059).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

References

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
  5. Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
  6. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55 (2007).
  7. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
  10. Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
  11. Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500 (2020).
  12. Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45 (2012).
  13. Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
  14. Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
  15. Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
  16. Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
  17. Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
  18. Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
  19. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  20. Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
  21. Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720 (2022).
  22. Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
  23. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  24. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  25. Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410 (2011).
  26. Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PRRSVPCRDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved