אבחון מבוסס קריספר נקודתי עם ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה

Summary

כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.

Abstract

אבחון מולקולרי על ידי זיהוי מבוסס Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) הוא בעל דיוק אבחוני גבוה ותכונות המתאימות לשימוש בנקודות טיפול, כגון זמני אספקה מהירים לתוצאות, קריאות פשוטות נוחות וללא צורך במכשירים מסובכים. עם זאת, התגובות יכולות להיות מסורבלות לביצוע בנקודת הטיפול בשל מרכיביהן הרבים ושלבי הטיפול הידניים. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב לזיהוי חזק של פתוגנים וסמנים גנטיים של מחלות עם הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז וריאגנטים מבוססי קריספר, אשר מעורבבים מראש ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בפורמטים קלים לאחסון ומוכנים לשימוש. ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה ניתנים להתייבשות לשימוש מיידי ושומרים על יעילות הגברה וזיהוי גבוהה. אנו מספקים גם מדריך לפתרון בעיות נפוצות בעת הכנה ושימוש בריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה לאבחון מבוסס קריספר, כדי להפוך את פלטפורמת הזיהוי לנגישה יותר לקהילות האבחון/בדיקות גנטיות רחבות יותר.

Introduction

אבחון מבוסס קריספר לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין דווח לראשונה בשנת 2017 1,2,3,4, ומאז, הוכח כאבחון הדור הבא עם בדיקות שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), במיוחד לזיהוי RNA של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2), במספר מדינות 5,6,7,8 . מעבר למחלת הקורונה 2019 (COVID-19), הטכנולוגיות הוכחו כיעילות לאיתור וירוסים וחיידקים מגוונים

Protocol

1. הכנת ריאגנטים מעורבים מראש RT-RPA lyophilized

1. הכנת ציוד
   1. הכינו דיואר חנקן נוזלי או מגש להקפאת הבזק של תגובות. מלאו את הדיואר או המגש בחנקן נוזלי.
   2. מייבש בהקפאה
      1. בדוק מים מרוכזים בצינורות ניקוז ואת פנים החדר; מוציאים את המים במידת הצורך.
      2. נקו את פנים התא ואת מתלה המתכת צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם תמיסת טיהור RNase, ואחריה 70% אתנול.
      3. סגור את דלת התא ואת שסתום שחרור הוואקום.
      4. הפעילו את מייבש ההקפאה.
      5. הגדר ידנית את טמפרטורת המדף ל -30 ° C.
   3. ציוד ביולוגיה מולקולרית
      1. נקו את הדברים הבאים עם תמיסת טיהור RNase:....

תוצאות

אנו מדגישים את הקינטיקה של יצירת אותות פלואורסצנטיים FAM מהזיהוי המשולב של s ו-n גנים של SARS-CoV-2, וכיצד המידע שימש לקביעת תנאים אופטימליים עבור ניסוחי תגובה ליופיליים ומעורבבים מראש. בכל המקרים, כללנו דגימות עם ערכי C_t היטב בתוך מגבלת הזיהוי שנקבעה (LoD) (C_t .......

Discussion

ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. להפרדת אזורים, מומלץ להשתמש בחללים נפרדים למיצוי חומצות גרעין, הכנת מאסטרמיקס (אזור טרום הגברה), הוספת דגימה וזיהוי אמפליקון (אזור לאחר הגברה). כל אזור צריך להיות מוגדר באמצעות קבוצה נפרדת של כלים וציוד. אין להכניס כלים מאזור אחד לאזור אחר,.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC