A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.

Abstract

אבחון מולקולרי על ידי זיהוי מבוסס Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) הוא בעל דיוק אבחוני גבוה ותכונות המתאימות לשימוש בנקודות טיפול, כגון זמני אספקה מהירים לתוצאות, קריאות פשוטות נוחות וללא צורך במכשירים מסובכים. עם זאת, התגובות יכולות להיות מסורבלות לביצוע בנקודת הטיפול בשל מרכיביהן הרבים ושלבי הטיפול הידניים. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב לזיהוי חזק של פתוגנים וסמנים גנטיים של מחלות עם הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז וריאגנטים מבוססי קריספר, אשר מעורבבים מראש ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בפורמטים קלים לאחסון ומוכנים לשימוש. ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה ניתנים להתייבשות לשימוש מיידי ושומרים על יעילות הגברה וזיהוי גבוהה. אנו מספקים גם מדריך לפתרון בעיות נפוצות בעת הכנה ושימוש בריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה לאבחון מבוסס קריספר, כדי להפוך את פלטפורמת הזיהוי לנגישה יותר לקהילות האבחון/בדיקות גנטיות רחבות יותר.

Introduction

אבחון מבוסס קריספר לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין דווח לראשונה בשנת 2017 1,2,3,4, ומאז, הוכח כאבחון הדור הבא עם בדיקות שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), במיוחד לזיהוי RNA של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2), במספר מדינות 5,6,7,8 . מעבר למחלת הקורונה 2019 (COVID-19), הטכנולוגיות הוכחו כיעילות לאיתור וירוסים וחיידקים מגוונים

Protocol

1. הכנת ריאגנטים מעורבים מראש RT-RPA lyophilized

  1. הכנת ציוד
    1. הכינו דיואר חנקן נוזלי או מגש להקפאת הבזק של תגובות. מלאו את הדיואר או המגש בחנקן נוזלי.
    2. מייבש בהקפאה
      1. בדוק מים מרוכזים בצינורות ניקוז ואת פנים החדר; מוציאים את המים במידת הצורך.
      2. נקו את פנים התא ואת מתלה המתכת צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם תמיסת טיהור RNase, ואחריה 70% אתנול.
      3. סגור את דלת התא ואת שסתום שחרור הוואקום.
      4. הפעילו את מייבש ההקפאה.
      5. הגדר ידנית את טמפרטורת המדף ל -30 ° C.
    3. ציוד ביולוגיה מולקולרית
      1. נקו את הדברים הבאים עם תמיסת טיהור RNase:....

תוצאות

אנו מדגישים את הקינטיקה של יצירת אותות פלואורסצנטיים FAM מהזיהוי המשולב של s ו-n גנים של SARS-CoV-2, וכיצד המידע שימש לקביעת תנאים אופטימליים עבור ניסוחי תגובה ליופיליים ומעורבבים מראש. בכל המקרים, כללנו דגימות עם ערכי Ct היטב בתוך מגבלת הזיהוי שנקבעה (LoD) (Ct .......

Discussion

ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. להפרדת אזורים, מומלץ להשתמש בחללים נפרדים למיצוי חומצות גרעין, הכנת מאסטרמיקס (אזור טרום הגברה), הוספת דגימה וזיהוי אמפליקון (אזור לאחר הגברה). כל אזור צריך להיות מוגדר באמצעות קבוצה נפרדת של כלים וציוד. אין להכניס כלים מאזור אחד לאזור אחר,.......

Disclosures

M.P. ו- C.U. הגישו פטנט בתאילנד על פורמולציות לזיהוי מרובב של RNA SARS-CoV-2. ר.ק. מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

C.U. מודה במימון מהבנק המסחרי סיאם תחת VISTEC-Siriraj Frontier Research Center, ומ-Thailand Science Research and Innovation (TSRI), קרן פונדמנטלית, שנת הכספים 2024, מענק מספר FRB670026/0457. R.K. ו- M.P. נתמכים על ידי קרנות סטודנטים ועוזרי מחקר מ- VISTEC, בהתאמה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Betaine solutionSigma-AldrichB0300-1VL
DEPC-Treated waterInvitrogenAM9915G
Dithiothreitol (DTT)Merck3870-25GM
EpiScript reverse transcriptaseLucigenERT12925K
Gly-Gly-Gly Sigma-AldrichSIA-50239-1G
LwaCas13aProducing in-houseStrain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1MSigma-AldrichM1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymeraseLucigen30223-2
Poly(ethylene glycol)Sigma-Aldrich81300-1KG
Potassium acetate solution, 5MSigma-Aldrich95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution MixNEBN0466L
RNase HNEBM0297L
SucroseTCITCI-S0111-500G
Trehalose DihydrateSigma-AldrichSIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194-100ML
TwistAmp Basic kitTwistDxTABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminatorBio-HelixBP001CU
Dry Bath Dual BlockELITE4-2-EL-02-220Model: EL-02
Fluorescence microplate readerTecan30050303Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryerLABCONCO794001030FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-wellGreinerGDE0784076F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)Bio-Rad185-5201Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGGTTTCAAAC
TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primerIDTTCCTAGGTTGAAGA
TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGAACTTCTC
CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primerIDTCAGACATTTTGCTCTC
AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s geneSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAAC
GAAGGGGACUAAAACGCAGCA
CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n geneSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAACG
AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG
AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporterIDT56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGTACGGATGAACCATA
CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primerIDTAAGATCCATAGTAGATTC
CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah IDTGCGCATCCATATTCTTCAT
CTGCATTTAGTTTTAGTCC
CCTTCGTTTTTGGGGTA
GTCTAAATCCCCTATAGT
GAGTCGTATTAATTTC

References

  1. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  2. Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved