A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.
אבחון מולקולרי על ידי זיהוי מבוסס Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) הוא בעל דיוק אבחוני גבוה ותכונות המתאימות לשימוש בנקודות טיפול, כגון זמני אספקה מהירים לתוצאות, קריאות פשוטות נוחות וללא צורך במכשירים מסובכים. עם זאת, התגובות יכולות להיות מסורבלות לביצוע בנקודת הטיפול בשל מרכיביהן הרבים ושלבי הטיפול הידניים. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב לזיהוי חזק של פתוגנים וסמנים גנטיים של מחלות עם הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז וריאגנטים מבוססי קריספר, אשר מעורבבים מראש ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בפורמטים קלים לאחסון ומוכנים לשימוש. ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה ניתנים להתייבשות לשימוש מיידי ושומרים על יעילות הגברה וזיהוי גבוהה. אנו מספקים גם מדריך לפתרון בעיות נפוצות בעת הכנה ושימוש בריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה לאבחון מבוסס קריספר, כדי להפוך את פלטפורמת הזיהוי לנגישה יותר לקהילות האבחון/בדיקות גנטיות רחבות יותר.
אבחון מבוסס קריספר לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין דווח לראשונה בשנת 2017 1,2,3,4, ומאז, הוכח כאבחון הדור הבא עם בדיקות שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), במיוחד לזיהוי RNA של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2), במספר מדינות 5,6,7,8 . מעבר למחלת הקורונה 2019 (COVID-19), הטכנולוגיות הוכחו כיעילות לאיתור וירוסים וחיידקים מגוונים
1. הכנת ריאגנטים מעורבים מראש RT-RPA lyophilized
אנו מדגישים את הקינטיקה של יצירת אותות פלואורסצנטיים FAM מהזיהוי המשולב של s ו-n גנים של SARS-CoV-2, וכיצד המידע שימש לקביעת תנאים אופטימליים עבור ניסוחי תגובה ליופיליים ומעורבבים מראש. בכל המקרים, כללנו דגימות עם ערכי Ct היטב בתוך מגבלת הזיהוי שנקבעה (LoD) (Ct .......
ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. להפרדת אזורים, מומלץ להשתמש בחללים נפרדים למיצוי חומצות גרעין, הכנת מאסטרמיקס (אזור טרום הגברה), הוספת דגימה וזיהוי אמפליקון (אזור לאחר הגברה). כל אזור צריך להיות מוגדר באמצעות קבוצה נפרדת של כלים וציוד. אין להכניס כלים מאזור אחד לאזור אחר,.......
M.P. ו- C.U. הגישו פטנט בתאילנד על פורמולציות לזיהוי מרובב של RNA SARS-CoV-2. ר.ק. מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.
C.U. מודה במימון מהבנק המסחרי סיאם תחת VISTEC-Siriraj Frontier Research Center, ומ-Thailand Science Research and Innovation (TSRI), קרן פונדמנטלית, שנת הכספים 2024, מענק מספר FRB670026/0457. R.K. ו- M.P. נתמכים על ידי קרנות סטודנטים ועוזרי מחקר מ- VISTEC, בהתאמה.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material | |||
Betaine solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
DEPC-Treated water | Invitrogen | AM9915G | |
Dithiothreitol (DTT) | Merck | 3870-25GM | |
EpiScript reverse transcriptase | Lucigen | ERT12925K | |
Gly-Gly-Gly | Sigma-Aldrich | SIA-50239-1G | |
LwaCas13a | Producing in-house | Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a | |
Magnesium chloride solution, 1M | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
NxGenT7 RNA polymerase | Lucigen | 30223-2 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
Potassium acetate solution, 5M | Sigma-Aldrich | 95843-100ML-F | |
Riobnucleotide Solution Mix | NEB | N0466L | |
RNase H | NEB | M0297L | |
Sucrose | TCI | TCI-S0111-500G | |
Trehalose Dihydrate | Sigma-Aldrich | SIA-90210-50G | |
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194-100ML | |
TwistAmp Basic kit | TwistDx | TABAS03KIT | |
Equipment | |||
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator | Bio-Helix | BP001CU | |
Dry Bath Dual Block | ELITE | 4-2-EL-02-220 | Model: EL-02 |
Fluorescence microplate reader | Tecan | 30050303 | Model: Infinite 200 Pro |
Freeze dryer | LABCONCO | 794001030 | FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer |
Microplate 384-well | Greiner | GDE0784076 | F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black |
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System) | Bio-Rad | 185-5201 | Model: CFX Connect Optics Module |
Oligonucleotide | |||
s-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA | |
s-gene reverse RPA primer | IDT | TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG | |
n-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG | |
n-gene reverse RPA primer | IDT | CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC | |
LwaCas13a-crRNA for the s gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG | |
LwaCas13a-crRNA for the n gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC | |
FAM-polyU-IABkFQ reporter | IDT | 56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ | |
O-hannah_cytb_F RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG | |
O-hannah_cytb_R RPA primer | IDT | AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA | |
synT7crRNA13a_ O_hannah | IDT | GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved