הערכת פינוי אינסולין בעכברים באמצעות זלוף כבד באתרו

Summary

פינוי אינסולין בכבד הוא קריטי לוויסות הומאוסטזיס של גלוקוז. מאמר זה מתאר הליך זלוף כבד ידידותי למשתמש להערכה ישירה של קצב פינוי האינסולין בכבד באתרו בעכברים.

Abstract

פינוי אינסולין בכבד חיוני לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז וקשור קשר הדוק להפרעות מטבוליות כגון השמנת יתר, עמידות לאינסולין וסוכרת. מדידה מדויקת של פינוי האינסולין חיונית להבנת המנגנונים הבסיסיים של מצבים אלה. פרוטוקול זה מציג הליך זלוף כבד פשוט וידידותי למשתמש בעכברים, שתוכנן במיוחד כדי להעריך ישירות את קצב פינוי האינסולין בכבד. השיטה כוללת קנולציה מדויקת של וריד הפורטל והווריד הנבוב התחתון העל-הפטי כדי ליצור מערכת זלוף באתרה המחקה תנאים פיזיולוגיים. הפרוטוקול מנחה את החוקרים בכל שלב של ההליך, מהכנה כירורגית והקמת מערכת הזלוף ועד לאיסוף וניתוח דגימות. ניתנות הוראות מפורטות, יחד עם תוצאות מייצגות וטיפים חשובים לייעול ההליך. סרטון הדרכה מלווה את הפרוטוקול הכתוב, המציע הוראות ואיורים מעמיקים מבחינה ויזואלית, מה שהופך אותו להתייחסות נגישה ומקיפה למדענים החוקרים את המנגנונים המולקולריים מאחורי חילוף החומרים ופינוי האינסולין בכבד.

Introduction

גילוי האינסולין הפך לאחת מאבני הדרך של המאה הקודמת. הרבה ידוע על ויסות סינתזת האינסולין, הפרשת האינסולין ותפקודיו הפיזיולוגיים ברקמות מטבוליות. עם זאת, יש פחות התמקדות בפירוק האינסולין ובמנגנוני הרגולציה שלו. ניתן להבין את חילוף החומרים של אינסולין כיחסי הגומלין בין תפקוד תאי בטא, תנגודת לאינסולין (IR) או רגישות, ופינוי אינסולין. לצד הפרשת אינסולין, פינוי אינסולין בכבד ממלא תפקיד מכריע בשמירה על הרמה ההומאוסטטית של האינסולין הדרושה להגעה לרקמות היעד ההיקפיות ולהקלה על פעולת אינסולין תקינה¹. מחקרים מרובים זיהו פגיעה בפינוי אינסולין כגורם מכריע בפתוגנזה של היפראינסולינמיה בתסמונת מטבולית, כמו גם במצבים אחרים^{כגון סוכרת} מסוג ^2,3, דלקת כבד לא אלכוהולית⁴ ותסמונת השחלות הפוליציסטיות⁵. לפיכך, היפראינסולינמיה משנית לפינוי מופחת עשויה לשחק תפקיד בפתוגנזה של מחלה מטבולית. לאסטרטגיות המשפרות את פינוי האינסולין יש פוטנציאל להפוך את ההשפעות השליליות של היפראינסולינמיה אצל אנשים אלה.

לאינסולין יש דפוס הפצה ייחודי. רמת האינסולין בפלזמה במחזור תלויה בשיווי המשקל בין הפרשת האינסולין להוצאתו. הלבלב מפריש אינסולין לווריד הפורטלי בצורה פועמת, ומכוון אותו אל הפטוציטים. כאיבר הראשון שנתקל בהפרשת אינסולין, הכבד מפרק את רוב האינסולין במהלך המעבר הראשון שלו, ומהווה 60%-70% מסך האינסולין⁶. האינסולין הנותר יוצא מהכבד דרך וריד הכבד, ונכנס למחזור הדם המערכתי, שם הוא מנוצל בחלקו על ידי רקמות היקפיות (בעיקר שריר, רקמת שומן וכליות) לפני שהוא מופק עוד על ידי הכבד במהלך המעבר השני שלו דרך עורק הכבד⁷.

המדידה המדויקת של פינוי האינסולין היא קריטית. מדידה ישירה של פינוי אינסולין בכבד במחקרים בבני אדם היא מאתגרת מכיוון שקשה להשיג דגימות דם מהפורטל ומוורידי הכבד. שיטות ישירות ועקיפות משמשות להערכת פינוי אינסולין בבני אדם ובמודלים של בעלי חיים. כשלוש אסטרטגיות משמשות למדידת פינוי אינסולין בעקיפין. ההערכות הנפוצות ביותר בפרקטיקה הקלינית כוללות שיטות המבוססות על יחס C-פפטיד/אינסולין מולארי⁸. גישה זו מבוססת על הפרשת שיווי המשקל של שני הפפטידים והיעדר מיצוי פפטיד C על ידי הכבד⁹. קבוצת השיטות השנייה תלויה בניתוח מתמטי של עקומות דעיכת הפלזמה של אינסולין לאחר כניסה ידועה וספציפית של ההורמון למחזור הדם ^2,10,11. השיטה השלישית מבוססת על העובדה שעירוי אינסולין בקצב קבוע מוביל לרמות יציבות של ההורמון בדם, כאשר קצב ההסרה תואם את קצב המתן¹². שיטות עקיפות אלו משקפות בעיקר את פינוי האינסולין הכללי בגוף. בהתחשב בכך שהכבד הוא האתר העיקרי של פינוי אינסולין וממלא תפקיד מכריע בתהליך זה, חיוני להעריך ישירות את פינוי האינסולין בכבד.

מחקרים קודמים מדדו ישירות את מיצוי האינסולין בכבד בכלבים בריאים^13,14. מחקרים השתמשו גם במודל כבד חולדה מבודד כדי להעריך את מיצוי האינסולין מהכבד^15,16. בשל הזמינות הגבוהה של זנים מהונדסים גנטית, עכברים משמשים כמודלים חשובים לחקירת מסלולים מולקולריים. כמה מחקרים¹⁷ השתמשו בזילוף כבד כדי להעריך ישירות את פינוי האינסולין בכבד במודל עכבר. במחקרים אלה, פרפוזה המכילה אינסולין אנושי מוזרקת לווריד הפורטלי ונאספת מהווריד הנבוב התחתון. שיעור האינסולין הנספג בכבד מעיד על פינויו. טכניקת זלוף הכבד שומרת על הכבד בתנאים כמעט פיזיולוגיים על ידי זרימת פרפוזה חמה, מחומצנת ומועשרת בחומרים מזינים דרך כלי הדם של הכבד. עם זאת, אין מספיק הדרכה מעשית וטיפים חיוניים לקידום והפצה של טכניקה זו.

לפיכך, בעוד שפינוי אינסולין בכבד זכה לתשומת לב הולכת וגוברת, תפקידו בהפרעות, כמו גם המנגנונים המולקולריים שלו, נותר לא ברור¹⁸. לכן, יש צורך רב בטכניקות מתקדמות בתחום המחקר המדעי. פרוטוקול זה קובע הליך זלוף כבד מותאם מפורט בעכברים להערכת פינוי אינסולין בכבד. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור את ההשפעות של תרופות על הכבד, כולל אפקט המעבר הראשון, תהליכי הובלת תרופות והיבטים שונים אחרים.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג (IACUC-2105018) ופעל בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. כל עכברי C57BL/6N נשמרו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים. עכברים בני שישה שבועות חולקו באופן אקראי לקבוצת דיאטת צ'או (CD) וקבוצת דיאטה עתירת שומן (HFD). קבוצת ה-HFD הוזנה בתזונה עתירת שומן של 60% והמשיכה בדיאטה זו עד גיל 10 שבועות. משקל הגוף הממוצע היה 28.55 גרם ±-1.2 גרם בקבוצת HFD ו-24.3 גרם ±-0.48 גרם בקבוצת הביקורת. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה

1. בצע עיקור הכרחי של מכשירים כירורגיים וחומרים מתכלים באמצעות חיטוי.
2. הניחו את מכשירי הניתוח, תפר משי 6-0, מוליך כותנה קטן וסטרילי, הזרקת נתרן כלורי (500 מ"ל), צמר גפן וספוגים כראוי על שולחן הניתוחים.
3. יש להכין 30 מ"ל של תמיסת מלח הפרינית בריכוז סופי של 200 יחב"ל/מ"ל.
4. הכן שני צינורות סיליקון בקוטר פנימי של 0.31 מ"מ וקוטר חיצוני של 0.64 מ"מ; האחד באורך 4 ס"מ לשימוש כקטטר וריד הפורטל, והשני באורך 10 ס"מ לשימוש כקטטר הווריד הנבוב התחתון.
5. הכן את מאגר הזלוף Krebs-Henseleit (KRBH) המכיל 5.0 ממול/ליטר גלוקוז ו-0.25% BSA.
6. הכן את מאגר הזלוף Krebs-Henseleit (KRBH) המכיל 5.0 מילימול/ליטר גלוקוז, 0.25% BSA ו-4.0 ננוגרם/מ"ל אינסולין אנושי.
7. הגדר את מערכת הזלוף בכבד. איור 1 מציג את המרכיבים העיקריים של מערכת הזלוף בכבד.

2. צנתור כירורגי

1. הכן את תערובת ההרדמה על ידי ביצוע השלבים הבאים:
   1. יש לדלל את Zoletil 50 (250 מ"ג/5 מ"ל) 10 פעמים עם תמיסת נתרן כלורי 0.9%.
   2. יש לדלל קסילזין הידרוכלוריד (200 מ"ג/2 מ"ל) 10 פעמים עם תמיסת נתרן כלורי 0.9%.
   3. מערבבים את תמיסת זולטיל 50 0.5% עם תמיסת 1% קסילזין הידרוכלוריד ביחס של 1:1.
2. להרדים את העכברים.
   1. בדוק ורשום את משקל גופו של העכבר. יש לתת את תערובת ההרדמה באמצעות הזרקה תוך-צפקית במינון של 5 מ"ל/ק"ג משקל גוף (2.5 מ"ג/מ"ל זולטיל 50; 5 מ"ג/מ"ל קסילזין הידרוכלוריד). תחילת ההרדמה מתרחשת בדרך כלל תוך 5-10 דקות לאחר ההזרקה, מה שמסומן על ידי אובדן רפלקס היישור ותגובה מופחתת לגירויים חיצוניים.
   2. העבר את העכבר לטבלת הניתוחים. אבטח את הגפיים באמצעות סרט דבק. יש לתת 2.5 U/g heparin תוך צפקי כדי להשיג הפריניזציה.
   3. השתמש במכונת גילוח חשמלית כדי לקצץ את הפרווה על עור הבטן ולחטא את האזור בתמיסת פובידון-יוד.
3. ביצוע צנתור וריד פורטל.
   1. בצע חתך אורכי של 4 ס"מ מהבטן התחתונה לכיוון תהליך ה-xiphoid לאורך קו אמצע הבטן. חותכים בזהירות את הצפק במספריים כדי למנוע פגיעה באיברים הקרביים. הכנס את מפסק הבטן של העכבר כדי לחשוף את שדה הניתוח.
   2. הזיזו את המעיים ימינה כדי לחשוף את וריד הפורטל, את הכליה הימנית ואת הווריד הנבוב התחתון (איור 2A). השתמש במלקחיים עורקיים כדי להדק את הווריד הנבוב בקצה העליון של הכליה.
   3. בודד את וריד הפורטל (איור 2A) וקשר את הקצה הדיסטלי עם תפר משי 6-0. קושרים באופן רופף תפר נוסף בקצה הפרוקסימלי של הכלי החשוף.
   4. בצע חתך ליד הקצה הקשור במספריים קפיציים והכנס את הקטטר. קדם את הקטטר דרך החתך עד לרמת התפצלות הפורטל.
   5. אבטח את שתי הקשרים סביב הצנתר ואשר דגימה נכונה על ידי חיבור הקצה החופשי של הצנתר למזרק דגימה. יש לשטוף עם מי מלח הפריניים ולהדק את הקטטר (איור 2C).
   6. הסר את מכשיר המתיחה ואפס את המעיים. מכסים את אזור הניתוח בגזה סטרילית ספוגה במי מלח או כותנה.
4. בצע צנתור וריד נבוב תחתון סופרהפטי.
   1. בצע חתך לאורך עצם החזה מתהליך ה- xiphoid וחשוף את עצם החזה.
   2. חותכים אנכית את עצם החזה וחותכים את הסרעפת לאורך שולי הצלעות כדי לחשוף את חלל בית החזה.
   3. חשוף ובודד את הווריד הנבוב התחתון העל-הפטי (איור 2B). קשור בזהירות את הקצה הדיסטלי עם תפר משי 6-0. קושרים באופן רופף תפר נוסף בקצה הפרוקסימלי של הכלי.
   4. בצע חתך ממש מתחת לקצה הקשור עם מספריים קפיציים והכנס קטטר 10 ס"מ. קדם את הקטטר עד שקצה הצנתר קרוב לכבד וקשר את שתי הקשירה היטב. אשר דגימה נכונה והדק את הקצה החופשי של הצנתר (איור 2D).
   5. שטפו את אזור הניתוח בתמיסת מלח. מכסים את המשטח בגזה סטרילית ספוגה במי מלח.

3. זלוף כבד

1. המתת חסד של העכבר על ידי שימוש במנת יתר של חומרי הרדמה וכריתת בית החזה בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים, תוך הבטחה שכל ההליכים מבוצעים באופן שממזער את הסבל.
2. הגדר את מערכת הזלוף בכבד, הכוללת מחמצן, מכשיר אפנון טמפרטורה, משאבת עירוי וצינורות עירוי, כפי שמוצג באיור 1.
3. ספק זרימת גז רציפה של 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני לחמצן.
4. הפעל את אמבט המים וחמם את תא האיברים ל -37 מעלות צלזיוס.
5. הכן את מאגר הזלוף KRBH עם ובלי אינסולין. יש להניח את מערכת הצינורות עם מאגר הזלוף המודגר באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: ה-KRBH נקי מ-BSA וגלוקוז. מאגר הזלוף KRBH ללא אינסולין אנושי מכיל 5.0 מילימול לליטר גלוקוז ו-0.25% BSA, בעוד שמאגר הזלוף KRBH עם אינסולין אנושי מכיל 5.0 מילימול לליטר גלוקוז, 0.25% BSA ו-4.0 ננוגרם/מ"ל אינסולין אנושי.
6. הנח את העכבר במיכל כאשר טמפרטורת הסביבה נשמרת על כ-37 מעלות צלזיוס. השתמש בכרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס.
7. החדירו את מאגר ה-KRBH דרך צנתר וריד הפורטל. הגדר את קצב העירוי על 0.2 מ"ל/דקה באמצעות משאבה מיני.
8. שימו לב שהכבד מחוויר תוך שניות, מה שמצביע על כך שמאגר הזלוף זורם דרך הכבד. כדי לשטוף יותר תאי דם שנותרו בכבד, השהה את העירוי למשך דקה אחת בנקודות הזמן של 4 דקות ו-8 דקות, והתחל את התזמון בתחילת הזלוף.
9. החדרת הכבד עם מאגר KRBH למשך 10 דקות בסך הכל (לא כולל שתי הפסקות של דקה), המייצגות את תקופת שיווי המשקל. אסוף את דגימת הבסיס מצנתר הווריד הנבוב התחתון.
10. יש לטפטף את הכבד באותה תמיסה מועשרת באינסולין (4.0 ננוגרם/מ"ל אינסולין אנושי) למשך 30 דקות נוספות.
11. אסוף את כל הדגימות מצינור הווריד הנבוב התחתון כל 2 דקות.
12. רשום את משקל הכבד לאחר הזלוף. אוספים דגימות כבד מאונות שונות, מקפיאים אותן מיד בחנקן נוזלי ואז מעבירים ל-80 מעלות צלזיוס לאחסון.
13. כל הצנטריפוגות אספו דגימות זלוף ב-~1,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנטים ומעבירים אותם ל-80 מעלות צלזיוס לאחסון.
    הערה: ריכוז האינסולין בדגימות זלוף נמדד באמצעות ערכות בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים אינסולין אנושי (ELISA).
14. לאחר ההליך, ודא שכל הפסולת הביולוגית מסולקת בהתאם לתקנות הבטיחות.

4. ניתוח נתונים

1. הצג את הנתונים בגרפים XY המציגים את תפוקת ריכוז האינסולין לאורך זמן.
2. חשב את שיעור פינוי האינסולין הממוצע בכבד (HICR_AVE) באמצעות הנוסחה הבאה:
   HICR_AVE = (1−C_f/C_i) × 100%
   כאשר C_i = ריכוז אינסולין ראשוני של מאגר העירוי, C_f = ריכוז האינסולין הממוצע הסופי ב-10 הדקות האחרונות מהווריד הנבוב התחתון העל-הפטי.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לעירוי כבד לחישוב פינוי אינסולין בכבד ישירות. דגם זה אמין וניתן לשחזור. דוגמה לתוצאות שהתקבלו מניסוי מוצגת באיור 3. לאחר תקופת שיווי משקל של 10 דקות, מאגר KRBH בתוספת אינסולין אנושי של 4.0 ננוגרם/מ"ל הוזרם דרך וריד הפורטל למשך 30 דקות. נ?...

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
יש לבצע את ההליכים הכירורגיים שתוארו לעיל בזהירות עדינה כדי למנוע היווצרות נגעים בכבד. יתר על כן, המבנה השברירי של דופן כלי הדם של וריד הכבד הופך אותו לפגיע לניקוב ולדימום שלאחר מכן אם לא מטפלים בו בזהירות במהלך הקנולציה. צינורות סיליק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60% high-fat diet	Research Diets, USA	D12492
Alanine aminotransferase Assay Kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C009-2-1
Anhydrous Glucose	Sangon Biotech	50-99-7	500 G
Aspartate aminotransferase Assay Kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C010-2-1
Bovine Serum Albumin	GeminiBio	700-107P	Fatty Acid-Free
Contour TS Blood Glucose Meter	Bayer	PH220800019
Contour TS Blood Glucose Test Strips	Bayer	DP38M3F05A
Heparin Sodium	Changzhou Qian hong Bio-pharma	H32022088	12500 U/2mL
Human insulin	Novo Nordisk	S20191007	300 U/3mL
Human insulin immunoassay kit	Ezassay Biotechnology	HM200
KRBH buffer (Sugar, BSA free)	coolaber	SL65501	500 mL
Membrane oxygenator	Xi'an Xijing Medical Appliance	5
Microscopic scissors	Shanghai Jinzhong	YBC020
Micro-serrefine clamp	Ningbo Medical Needle	180709
Microsurgery forceps	Shanghai Jinzhong	WA3010, WA3020
Needle type filter	N-buliv	LG05-133-2
Povidone-iodine Solution	Shanghai likang Disinfectant Hi-Tech	20231016J
pump 11 Elite	Harvard Apparatus	PC5 70-4500
Retractor	Globalebio (Beijing) Technology	GEKK-10mm	10 mm
Silicone Tubing	scientific commodities	#BB518-12	0.31 mm × 0.64 mm
Silicone Tubing	Fisher Scientific	#11-189-15A	ID 0.5 mm
Sodium Chloride Injection	Baxter	S2402023	4.5 g/500 mL
Surgical silk suture	Yangzhou Huanyu Medical Equipment	6-0
Temperature modulation	Xi'an Xijing Medical Appliance	6
Thermostatic water bath	Jiaxing Junsi Electronics	HIH-1	220 V 50 HZ
Three-way Joint	YISAI	AQTCY1.6	ID 0.4 mm
Xylazine Hydrochloride Injection	ShengXin	20240106	200 mg/2mL
Zoletil 50	Virbac	WK001	250 mg/5mL