ייצור ואפיון מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה של אקסוזומים

Summary

אקסוזומים הם בעלי פוטנציאל קליני משמעותי, אך היישום המעשי שלהם מוגבל בשל פינוי קל in vivo ויציבות ירודה. מיקרו-מחטים מציגות פתרון בכך שהן מאפשרות אספקה מקומית על ידי ניקוב מחסומים פיזיולוגיים ושימור מצב יבש, ובכך נותנות מענה למגבלות מתן האקזוזום ומרחיבות את התועלת הקלינית שלהן.

Abstract

אקסוזומים, כטיפולים ביולוגיים מתפתחים של "הדור הבא" ווקטורים של אספקת תרופות, טומנים בחובם פוטנציאל עצום בתחומים ביו-רפואיים מגוונים, החל ממתן תרופות ורפואה רגנרטיבית ועד אבחון מחלות ואימונותרפיה של גידולים. עם זאת, הפינוי המהיר על ידי הזרקת בולוס מסורתית ויציבות ירודה של אקסוזומים מגבילים את היישום הקליני שלהם. מיקרו-מחטים משמשות כפתרון המאריך את זמן השהייה של האקסוזומים באתר הניהול, ובכך שומר על ריכוז התרופה ומקל על השפעות טיפוליות מתמשכות. בנוסף, microneedles גם יש את היכולת לשמור על יציבות של חומרים ביו-אקטיביים. לכן, אנו מציגים מדבקת מיקרו-מחט לטעינה והעברה של אקסוזומים וחולקים את השיטות, כולל בידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של מדבקות מיקרו-מחטים עמוסות אקסוזומים. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו באמצעות טרהלוז וחומצה היאלורונית כחומרי קצה ופוליוויניל פירולידון כחומר הגיבוי בשיטת יציקה דו-שלבית. המיקרו-מחטים הפגינו חוזק מכני חזק, עם קצוות המסוגלים לעמוד ב-2 N. עור חזיר שימש להדמיית עור אנושי, וקצות המיקרו-מחטים נמסו לחלוטין תוך 60 שניות לאחר ניקוב העור. האקסוזומים ששוחררו מהמיקרו-מחטים הציגו מורפולוגיה, גודל חלקיקים, חלבוני סמן ותפקודים ביולוגיים דומים לאלה של אקסוזומים טריים, מה שאיפשר לתאים הדנדריטיים להיקלט ולקדם את הבשלתם.

Introduction

אקסוזומים, שהם שלפוחיות קטנות המשתחררות על ידי תאים לתוך המטריצה החוץ תאית, הוצעו כטיפולים ביולוגיים פוטנציאליים ווקטורים למתן תרופות לטיפול במספר מחלות וסרטן¹. במהלך תהליך הביוגנזה שלהם, אקסוזומים עוטפים מולקולות ביולוגיות פעילות שונות מתוך התאים, כולל חלבונים פונקציונליים וחומצות גרעין². כתוצאה מכך, כאשר הם נלקחים על ידי התאים המקבלים במהלך תהליך ההובלה, לאקסוזומים יש את היכולת לווסת את ביטוי הגנים ואת תפקודי התאים בתאי היעד³. כסוג של שליח מידע טבעי, אקסוזומים נוצלו במלואם בהתחדשות רקמות, ויסות חיסוני, וכמוביל משלוח⁴. באמצעות טכניקות הנדסיות, ליגנדות ספציפיות יכולות להיות....

Protocol

מחקר זה אינו דורש אישור אתי מכיוון שעור החזיר ששימש לניסויים המתוארים בסעיף 3 נרכש כאוזני חזיר אכילות מהשוק ולא מקורו בחיות ניסוי.

1. בידוד של אקסוזומים

1. תרבית תאים
   1. טפחו תאי סרטן אפיתל בשחלות של עכברים ID8 במדיום תרבית מסוג DMEM (Modified Eagle Medium) של דולבקו המכיל 10% נסיוב בקר עוברי ותמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1% (100×) (ראו טבלת חומרים) בצלחות פטרי בקוטר של 15 ס"מ.
   2. לדגור על תאי ID8 באינקובטור_CO2 (ראה טבלת חומרים) ב 37 ° C ו 5% CO₂ עד צפיפות התא מגיע 90%.
2. בידוד אקסוזומים
   1. הסירו את מדיום התרבית מכלי הפטרי ושטפו....

תוצאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של טלאי exo@MN. איור 1 מדגים את תרשים הזרימה של התהליך לייצור טלאי exo@MN. האקסוזומים עורבבו עם טרהלוז וחומצה היאלורונית, ולאחר מכן הוסיפו את התערובת לתבנית המיקרו-מחטים והצנטריפוגות. תהליך זה הקל על הצטברות האקסוזומים בקצו.......

Discussion

נכון לעכשיו, השיטות העיקריות לבידוד אקסוזומים כוללות אולטרה-צנטריפוגה, צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, אולטרה-סינון, משקעים, חרוזים מגנטיים של זיקה חיסונית ומיקרופלואידיקה²⁴. בשל יכולת ההעמסה המוגבלת של מיקרו-מחטים הנגרמת על ידי שטח קצה המחט הקטן שלהם, יש צורך להגדיל את ריכוז האקסו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x penicillin-streptomycin solutions	Jrunbio Scientific	MA0110	Cell culture
180 kDa pre-stained protein marker	Thermo	26616	Western blotting
3% Uranyl acetate	Henan Ruixin Experimental Supplies	GZ02625	Morphological characterization of exosomes
3D printer	BMF technology	nanoArch S130	Mold preparation
4%–20% precast gel	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	Western blotting
5× SDS-PAGE loading buffer	Titan	04048254	Western blotting
Anti-mouse Alix antibody	Biolegend	12422-1-AP	Western blotting
Anti-mouse CD63 antibody	Biolegend	ab217345	Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibody	Biolegend	104713	Antibody
Auto fine coater	ZIZHU	JBA5-100	Morphological characterization of microneedle
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Centrifuge	Thermo Fisher	Muitifuge X1R pro	Cell centrifuge
Circulating water vacuum pump	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	Filtration
CO2 incubator	Eppendorf	CellXpert C170	Cell culture
Confocal laser scanning microscope	Nikon	A1HD25	Fluorescence imaging
Copper mesh	Beijing Zhongjingkeyi Technology	JF-ZJKY/300	Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrate	Aladdin	5138-23-4	Fabrication of microneedle
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Meilunbio	MA0212	Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered saline	Meilunbio	MA0010	Cell culture
Electrophoresis system	Bio-rad	PowerPac-basic	Western blotting
Fetal bovine serum	Jrunbio Scientific	JR100	Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibody	Biolegend	117305	Antibody
Flow cytometry	BD	LSR Fortessa	Fluorescence detection
Gel imager	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	CST	7074S	Western blotting
HTL resin	BMF technology		Mold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	Fabrication of microneedle
Immersion oil	Nikon	MXA22168	Fluorescence imaging
Ion cleaner	JEOL	EC-52000IC	Morphological characterization of exosomes
Microscope	Olympus	CKX53	Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8	MeisenCTCC	CC90105	Cell culture
Nanoparticle tracking analysis	Particle Metrix	ZetaView	Size analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend	107619	Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime	ST507	Protease inhibitors
Plasma cleaner	Hefei Kejing Material Technology	PDC-36G	Fabrication of microneedle
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	9016-00-6	Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)	Aladdin	9003-39-8	Fabrication of microneedle
Prism	GraphPad	Version 9	Statistical analysis
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Western blotting
Quick-snap centrifuge	Beckman	344619	Exosomes extraction
RIPA lysis buffer	Applygen	C1053	Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640	Meilunbio	MA0548	Cell culture
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-IT800	Morphological characterization of microneedle
Stereo microscope	Olympus	SZX16	Characterization of morphology
Super ECL detection reagent	Applygen	P1030	Western blotting
Tensile meter	Instron	68SC-05	Mechanical testing
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-2100plus	Morphological characterization of exosomes
Tris buffered saline	Sangon Biotech	JF-A500027-0004	Western blotting
Tween-20	Beyotime	ST825	Western blotting
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosomes extraction
Ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096	Exosomes concentration
Vacuum drying oven	Shanghai Yiheng Technology	DZF-6024	Fabrication of microneedle
Vacuum filtration system	Biosharp	BS-500-XT	Filtration