A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אקסוזומים הם בעלי פוטנציאל קליני משמעותי, אך היישום המעשי שלהם מוגבל בשל פינוי קל in vivo ויציבות ירודה. מיקרו-מחטים מציגות פתרון בכך שהן מאפשרות אספקה מקומית על ידי ניקוב מחסומים פיזיולוגיים ושימור מצב יבש, ובכך נותנות מענה למגבלות מתן האקזוזום ומרחיבות את התועלת הקלינית שלהן.

Abstract

אקסוזומים, כטיפולים ביולוגיים מתפתחים של "הדור הבא" ווקטורים של אספקת תרופות, טומנים בחובם פוטנציאל עצום בתחומים ביו-רפואיים מגוונים, החל ממתן תרופות ורפואה רגנרטיבית ועד אבחון מחלות ואימונותרפיה של גידולים. עם זאת, הפינוי המהיר על ידי הזרקת בולוס מסורתית ויציבות ירודה של אקסוזומים מגבילים את היישום הקליני שלהם. מיקרו-מחטים משמשות כפתרון המאריך את זמן השהייה של האקסוזומים באתר הניהול, ובכך שומר על ריכוז התרופה ומקל על השפעות טיפוליות מתמשכות. בנוסף, microneedles גם יש את היכולת לשמור על יציבות של חומרים ביו-אקטיביים. לכן, אנו מציגים מדבקת מיקרו-מחט לטעינה והעברה של אקסוזומים וחולקים את השיטות, כולל בידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של מדבקות מיקרו-מחטים עמוסות אקסוזומים. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו באמצעות טרהלוז וחומצה היאלורונית כחומרי קצה ופוליוויניל פירולידון כחומר הגיבוי בשיטת יציקה דו-שלבית. המיקרו-מחטים הפגינו חוזק מכני חזק, עם קצוות המסוגלים לעמוד ב-2 N. עור חזיר שימש להדמיית עור אנושי, וקצות המיקרו-מחטים נמסו לחלוטין תוך 60 שניות לאחר ניקוב העור. האקסוזומים ששוחררו מהמיקרו-מחטים הציגו מורפולוגיה, גודל חלקיקים, חלבוני סמן ותפקודים ביולוגיים דומים לאלה של אקסוזומים טריים, מה שאיפשר לתאים הדנדריטיים להיקלט ולקדם את הבשלתם.

Introduction

אקסוזומים, שהם שלפוחיות קטנות המשתחררות על ידי תאים לתוך המטריצה החוץ תאית, הוצעו כטיפולים ביולוגיים פוטנציאליים ווקטורים למתן תרופות לטיפול במספר מחלות וסרטן1. במהלך תהליך הביוגנזה שלהם, אקסוזומים עוטפים מולקולות ביולוגיות פעילות שונות מתוך התאים, כולל חלבונים פונקציונליים וחומצות גרעין2. כתוצאה מכך, כאשר הם נלקחים על ידי התאים המקבלים במהלך תהליך ההובלה, לאקסוזומים יש את היכולת לווסת את ביטוי הגנים ואת תפקודי התאים בתאי היעד3. כסוג של שליח מידע טבעי, אקסוזומים נוצלו במלואם בהתחדשות רקמות, ויסות חיסוני, וכמוביל משלוח4. באמצעות טכניקות הנדסיות, ליגנדות ספציפיות יכולות להיות....

Protocol

מחקר זה אינו דורש אישור אתי מכיוון שעור החזיר ששימש לניסויים המתוארים בסעיף 3 נרכש כאוזני חזיר אכילות מהשוק ולא מקורו בחיות ניסוי.

1. בידוד של אקסוזומים

  1. תרבית תאים
    1. טפחו תאי סרטן אפיתל בשחלות של עכברים ID8 במדיום תרבית מסוג DMEM (Modified Eagle Medium) של דולבקו המכיל 10% נסיוב בקר עוברי ותמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1% (100×) (ראו טבלת חומרים) בצלחות פטרי בקוטר של 15 ס"מ.
    2. לדגור על תאי ID8 באינקובטורCO2 (ראה טבלת חומרים) ב 37 ° C ו 5% CO2 עד צפיפות התא מגיע 90%.
  2. בידוד אקסוזומים
    1. הסירו את מדיום התרבית מכלי הפטרי ושטפו....

תוצאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של טלאי exo@MN. איור 1 מדגים את תרשים הזרימה של התהליך לייצור טלאי exo@MN. האקסוזומים עורבבו עם טרהלוז וחומצה היאלורונית, ולאחר מכן הוסיפו את התערובת לתבנית המיקרו-מחטים והצנטריפוגות. תהליך זה הקל על הצטברות האקסוזומים בקצו.......

Discussion

נכון לעכשיו, השיטות העיקריות לבידוד אקסוזומים כוללות אולטרה-צנטריפוגה, צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, אולטרה-סינון, משקעים, חרוזים מגנטיים של זיקה חיסונית ומיקרופלואידיקה24. בשל יכולת ההעמסה המוגבלת של מיקרו-מחטים הנגרמת על ידי שטח קצה המחט הקטן שלהם, יש צורך להגדיל את ריכוז האקסו.......

Disclosures

H. C., F.L.Q ו- S.J.M הם ממציאים בבקשת פטנט שהוגשה על סמך הנתונים בכתב יד זה. H.C. הוא המייסד המדעי של Medcraft Biotech. בע"מ

Acknowledgements

פ.ל.ק. מעריכה את התמיכה הנתמכת על ידי תוכנית המחקר והפיתוח החלוצית של ג'ג'יאנג (2022C03031), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2021YFA0910103), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (22274141, 22074080), הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2022ZD28) ותוכנית המלגות טאישאן של מחוז שאנדונג (tsqn201909106). H.C. מכירה בתמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82202329). המחברים מודים על השימוש במכשירים במתקן הליבה של המכשור המשותף במכון האנגג'ואו לרפואה (HIM), האקדמיה הסינית למדעים.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100x penicillin-streptomycin solutionsJrunbio ScientificMA0110Cell culture
180 kDa pre-stained protein markerThermo26616Western blotting
3% Uranyl acetateHenan Ruixin Experimental SuppliesGZ02625Morphological characterization of exosomes
3D printerBMF technologynanoArch S130Mold preparation
4%–20% precast gelGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern blotting
5× SDS-PAGE loading bufferTitan04048254Western blotting
Anti-mouse Alix antibodyBiolegend12422-1-APWestern blotting
Anti-mouse CD63 antibodyBiolegendab217345Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibodyBiolegend104713Antibody
Auto fine coaterZIZHUJBA5-100Morphological characterization of microneedle
BCA assay kitBeyotimeP0012Protein concentration assay
CentrifugeThermo FisherMuitifuge X1R proCell centrifuge
Circulating water vacuum pumpYuhua InstrumentSHZ-D(III)Filtration
CO2 incubatorEppendorfCellXpert C170Cell culture
Confocal laser scanning microscopeNikonA1HD25Fluorescence imaging
Copper meshBeijing Zhongjingkeyi Technology JF-ZJKY/300Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrateAladdin5138-23-4Fabrication of microneedle 
Dulbecco’s modified Eagle’s mediumMeilunbioMA0212Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered salineMeilunbioMA0010Cell culture
Electrophoresis systemBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Fetal bovine serumJrunbio ScientificJR100Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibodyBiolegend117305Antibody
Flow cytometryBDLSR FortessaFluorescence detection
Gel imagerCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgGCST7074SWestern blotting
HTL resinBMF technologyMold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9Fabrication of microneedle 
Immersion oilNikonMXA22168Fluorescence imaging
Ion cleanerJEOLEC-52000ICMorphological characterization of exosomes
MicroscopeOlympusCKX53Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8MeisenCTCC CC90105Cell culture
Nanoparticle tracking analysisParticle MetrixZetaViewSize analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibodyBiolegend107619Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotimeST507Protease inhibitors
Plasma cleanerHefei Kejing Material TechnologyPDC-36GFabrication of microneedle 
PolydimethylsiloxaneDow Corning9016-00-6Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)Aladdin9003-39-8Fabrication of microneedle 
Prism GraphPadVersion 9Statistical analysis
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western blotting
Quick-snap centrifugeBeckman344619Exosomes extraction
RIPA lysis bufferApplygenC1053Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640MeilunbioMA0548Cell culture
Scanning electron microscopeJEOLJSM-IT800Morphological characterization of microneedle
Stereo microscopeOlympusSZX16Characterization of morphology
Super ECL detection reagentApplygenP1030Western blotting
Tensile meterInstron68SC-05Mechanical testing
Transmission electron microscopeJEOLJEM-2100plusMorphological characterization of exosomes
Tris buffered salineSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosomes extraction
Ultrafiltration tubeMilliporeUFC910096Exosomes concentration
Vacuum drying ovenShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Fabrication of microneedle
Vacuum filtration systemBiosharpBS-500-XTFiltration

References

  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved