שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O

Summary

כאן, אנו מציגים את מבחן השינוי התרמי, טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות בעלת תפוקה גבוהה המשמשת לחקר הקישור של מולקולות קטנות לחלבונים בעלי עניין.

Abstract

הגדרת חשיבותם הביולוגית של חלבונים בעלי תפקידים לא ידועים מציבה מכשול משמעותי בהבנת תהליכים תאיים. אף על פי שתחזיות ביואינפורמטיות ומבניות תרמו לחקר חלבונים לא ידועים, אימותים ניסיוניים במבחנה נפגעים לעתים קרובות על ידי התנאים האופטימליים וקו-פקטורים הדרושים לפעילות ביוכימית. קשירת קו-פקטור חיונית לא רק לפעילות של אנזימים מסוימים, אלא גם עשויה לשפר את היציבות התרמית של החלבון. אחד היישומים המעשיים של תופעה זו טמון בניצול השינוי ביציבות התרמית, כפי שנמדד על ידי שינויים בטמפרטורת ההתכה של החלבון, כדי לבחון את קשירת הליגנד.

בדיקת שינוי תרמי (TSA) יכולה לשמש לניתוח הקישור של ליגנדות שונות לחלבון המעניין או למצוא מצב מייצב לביצוע ניסויים כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. כאן נתאר פרוטוקול עבור TSA המשתמש בפסאודוקינאז, Selenoprotein O (SelO), לשיטה פשוטה ובעלת תפוקה גבוהה לבדיקת קשירת מתכת ונוקלאוטידים. בניגוד לקינאזות קנוניות, SelO קושר ATP בכיוון הפוך כדי לזרז את העברת AMP לשרשראות הצד ההידרוקסיל של חלבונים בשינוי פוסט-תרגומי המכונה AMPylation חלבון. על ידי מינוף השינוי בטמפרטורות ההתכה, אנו מספקים תובנות חיוניות לגבי האינטראקציות המולקולריות העומדות בבסיס פונקציית SelO.

Introduction

חלק גדול מהפרוטאום האנושי נותר מאופיין בצורה גרועה. "אפקט תאורת הרחוב" המתואר על ידי דנהם וקוסטצ'ר ואחרים מתייחס לתופעה שבה חלבונים שנחקרו בהרחבה מקבלים תשומת לב רבה יותר, ומשאירים חלבונים שלא נחקרו מספיק מתעלמים^מ-1,2. גורמים התורמים להשפעה זו כוללים את החשיבות הביולוגית ואת הרלוונטיות של מחלות של חלבונים מסוימים. יתר על כן, מחקר קודם המציע ידע בסיסי, כמו גם את הזמינות של כלים לניתוח פונקציונלי, עוד יותר מגרה מחקר על חלבונים נחקרים מאוד ^1,2. פרויקטים כגון Understudied Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium ו-Enzyme Function Initiative שואפים לאפיין חלבונים שלא נחקרו מספיק באמצעות פרוטאומיקה מבנית ותפקודית ^2,3,4. גישה משלימה לזיהוי הפונקציות המולקולריות של חלבונים שלא נחקרו מספיק היא לבחון את האינטראקציות של חלבונים אלה עם מולקולות קטנות כדי לקבל תובנות חשובות לגבי הוויסות וספציפיות המצע.

קשירה של מולקולות קטנות יכולה להגביר את היציבות התרמית של חלבון⁵. תופעה זו, הידועה בשם ייצוב קונפורמציה המושרה על ידי ליגנד, גורמת לעיתים קרובות לעלייה בטמפרטורת ההתכה של חלבון, ומספקת אינדיקציה מדידה לקשירת ליגנד⁶. ניתן למדוד את היציבות התרמית של חלבון באמצעות פלואורימטריה של סריקה דיפרנציאלית (DSF), הידועה גם בשם Thermofluor, או Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10. ב- TSA, דגימת חלבון נתונה לטמפרטורות עולות בנוכחות צבע רגיש לסביבה⁶. כאשר החלבון מתפתח ומתפרק, הצבע נקשר לאזורים ההידרופוביים החשופים של החלבון ופולט פלואורסצנטיות. צבעים פלואורסצנטיים חיצוניים, או צבעים רגישים לסביבה, חסרים פלואורסצנטיות פנימית ובמקום זאת פלואורסצנטיים באינטראקציה עם מולקולת המטרה שלהם ^9,11,12. הצבע הנפוץ ביותר, SYPRO Orange, מציע מספר יתרונות כגון יציבות משופרת ופלואורסצנטיות רקע מינימלית ^8,9,12. יש לציין כי SYPRO Orange תואם למערכות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) בהתחשב באורכי גל העירור והפליטה שלו סביב 470 ננומטר ו-570 ננומטר, בהתאמה. תכונה ייחודית זו מאפשרת מדידות בעלות תפוקה גבוהה, מדויקות ורגישות התואמות למערכות גילוי פלואורסצנטיות הנפוצות במערכות RT-PCR⁸.

TSA הוא כלי רב-תכליתי לחקר אינטראקציות חלבונים עם גורמים משלימים או תרופות פוטנציאליים ולזיהוי תנאים מייצבים לקריסטלוגרפיה. חלק מיתרונותיו על פני שיטות סינון אחרות הם פשטות ההתקנה היחסית שלו והתפוקה הגבוהה שלו עם לוחות 96 או 384 בארות 13,14,15. הפיתוח של טכניקה זו היה טרנספורמטיבי עבור מחקרים גילוי תרופות, מציע נוחות ומאפשר מחקר של תוספים מגוונים כגון יונים, ליגנדות, ותרופות ^6,16. יתר על כן, יכולת ההסתגלות של TSA עודדה מדענים להרחיב את התועלת שלה, מה שמקל על מדידת זיקות מחייבות לצד מבחני הסינון ^17,18. TSA הוא כלי יעיל במחקרי ביולוגיה מבנית לזיהוי תנאים המקדמים את ייצוב החלבון המעניין להתגבשות¹⁹. לפיכך, גמישותו וקלילותו היחסית מיצבו את TSA כטכניקת אבן פינה באפיון חלבונים. כאן, נשתמש ב- TSA כדי לנתח את הקישור של מתכות ונוקלאוטיד לפסאודוקינאז שלא נחקר, Selenoprotein O (SelO), כדוגמה.

קינאזות הן אחת ממשפחות החלבונים הממוקדות ביותר בגילוי תרופות²⁰. כ -10% מהקינאזות האנושיות צפויות להיות לא פעילות ונקראות פסאודוקינזות מכיוון שהן חסרות שאריות קטליטיות, הדרושות לקטליזה ^21,22. Selenoprotein O (SelO) הוא פסאודוקינאז משומר אבולוציונית שחסר את האספרטט השמור במוטיב HRD הקטליטי²³. באיקריוטים, SelO מתמקם במיטוכונדריה ומגן על התאים מפני עקה חמצונית ^24,25. ניתוחים מבניים וביוכימיים מראים כי SelO מעביר אדנוזין מונופוספט (AMP) מ-ATP למצעים חלבוניים בשינוי פוסט-תרגומי המכונה AMPylation²⁵. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאנזימים המזרזים AMPylation עשויים לקשור נוקלאוטידים חלופיים כגון UTP in vitro ^26,27. יש לציין כי מחקרים הוכיחו כי הומולוג SelO מסלמונלה טיפימוריום מזרז את החלבון UMPylation, או העברת UMP, באופן תלוי מנגן²⁸. לאור התצפיות המסקרנות הללו, אנו בודקים את הקישור של SelO ל-ATP ול-UTP בנוכחות מגנזיום ומנגן, ומשמשים דוגמה מייצגת ליישומים של TSA. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול הבא כדי לייעל ולבחון את האינטראקציות של חלבונים ותוספים אחרים בעלי עניין.

Protocol

1. מערך ניסיוני

1. השתמש במחזור תרמי שיכול לזהות פלואורסצנטיות, כגון מכשיר RT-PCR, כדי לבצע את הפרוטוקול המתואר. אם אתה משתמש ב- SYPRO Orange, כמתואר בפרוטוקול זה, השתמש במצב סריקה המאפשר עירור סביב 470 ננומטר וזיהוי פליטה סביב 570 ננומטר. תכנת את thermocycler להחזיק את הדגימה ב 20 ° C במשך 2 דקות, ואחריו עלייה בטמפרטורה של 0.5 ° C / 1 דקה עד 95 ° C; למדוד עוצמת פלואורסצנטיות כל 1 °C.
   הערה: אנו ממליצים על שלב אופציונלי בסוף המחזור כדי להחזיר את בלוק הדגימה ל- 20°C (איור 1).
2. כל תגובה מכילה ארבעה מרכיבים: חיץ, חלבון מעניין, תוסף וצבע פלואורסצנטי חיצוני. תכנן את הניסוי כך שיכלול בקרות כגון ללא חלבון, ללא צבע, חלבון ללא תוספים, ותוספים בלבד כדי לקבוע כל פלואורסצנטיות רקע שעשויה להשפיע על פרשנות התוצאות. אם זמין, לכלול בקרה חיובית כגון תוסף הידוע לקשור ולייצב את החלבון המעניין.
3. השתמש חלבון מטוהר עבור הבדיקה. כדי לעקוב אחר דוגמה זו, השתמש E. coli SelO, מבוטא ומטוהר כפי שתואר קודם לכן^25,29. בקצרה, לבטא את הסומו שלו המתויג SelO (E. coli SelO ppSumo) בתאי Rosetta DE3 ולטהר אותו באמצעות זיקה Ni²⁺-NTA. חותכים את תג הסומו שלו באמצעות פרוטאז Ulp ומטהרים את SelO עוד יותר על ידי כרומטוגרפיית סינון ג'ל.
4. הפלואורסצנטיות של SYPRO Orange תהיה תלויה באינטראקציה שלה עם החלבון המעניין. מכיוון שאינטראקציות אלה ישתנו מחלבון לחלבון, מטבו את ריכוז החלבון והצבע לקבלת האות המרבי לרעש של אות פלואורסצנטי.
   הערה: SYPRO Orange אינו תואם לחלבונים ותוספים מסוימים כגון דטרגנטים^11,30. ניתן לבדוק צבעים חיצוניים נוספים המפורטים ^ב-12 לפי הצורך.

2. קביעת ריכוז הצבע האופטימלי (איור 2A)

1. הכינו דילולים של 20 μL של 50x, 40x, 30x, 20x ו-10x SYPRO Orange מתמיסת המלאי, המסופקת ב-5,000x ב-DMSO.
2. יש לחלק 8 μL של חלבון 6.25 מיקרומטר המדולל במאגר TSA לשש בארות נפרדות של צלחת PCR של 384 בארות.
   הערה: בדוגמה שלנו, השתמשנו במאגר TSA הבא כדי לבצע את הדילולים: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl ו- 1 mM DTT. ניתן להריץ דגימות בשלוש כדי לשפר את אמינות התוצאות.
3. הוסף 1 μL של חיץ TSA לכל באר.
   הערה: נפח חיץ זה יוחלף בתוספת של מולקולות קטנות לאחר אופטימיזציה של צבע וריכוז חלבון.
4. הוסף 1 μL מכל דילול סדרתי של תמיסת צבע SYPRO Orange לכל באר. הוסף 1 μL של חיץ ללא צבע לבאר הסופית עבור שליטה ללא צבע.
5. מכסים את הצלחת בסרט דבק אופטי שקוף.
6. סובבו לזמן קצר את הצלחת במהירות של 1,000 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחית PCR.
7. הניחו את הצלחת במכשיר RT-PCR והתחילו את פרוטוקול התרמו-מחזור המתואר בשלב 1.1.

3. קביעת ריכוז החלבון האופטימלי (איור 2B)

1. הכינו 20 μL של דילולים טוריים של 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM ו-1.56 μM של חלבון באמצעות מאגר TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl ו-1 mM DTT).
2. יש לחלק 8 מיקרוליטר של דילול סדרתי של החלבון לחמש בארות נפרדות של צלחת בת 384 בארות.
3. יש לחלק חיץ רק^{ב-6 וגם} בקרה ללא חלבון.
4. הוסף 1 μL של חיץ TSA לכל באר.
   הערה: נפח חיץ זה יוחלף בתוספת של מולקולות קטנות לאחר אופטימיזציה של צבע וריכוז חלבון.
5. הוסף 1 μL מכל תמיסת צבע תפוז 50x SYPRO לכל באר.
6. מכסים את הצלחת בסרט דבק אופטי שקוף.
7. סובב לזמן קצר את הצלחת במהירות של 1,000 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחית PCR.
8. הניחו את הצלחת במכשיר RT-PCR והתחילו את פרוטוקול התרמו-מחזור המתואר בשלב 1.1.

4. הגדרת ניסוי TSA (איור 3A)

הערה: לאחר אופטימיזציה של ריכוזי החלבון והצבע הכתום SYPRO, ניתן לבצע את הבדיקה בתוספת המולקולות הקטנות הרצויות לניתוח הקשירה.

1. הגדר את מספר התנאים על ידי התחשבות בעותקים המשוכפלים ובבקרות המתאימות.
   הערה: לדוגמה, נבדוק את הכריכה של SelO לשמונה תנאים במשולש. כולל קבוצת הביקורת (ללא תוסף, ללא חלבון וללא צבע), יש לנו 11 תגובות x 3 (משולש) = 33 תגובות בסך הכל.
2. בהתבסס על הריכוז האופטימלי של חלבון וצבע שנצפה עבור SelO, ודא שכל תגובה מכילה 8 μL של חלבון 6.25 μM, 1 μL של תוספת, ו 1 μL של 50x צבע כתום SYPRO עבור נפח תגובה כולל של 10 μL. לפיכך, הריכוז הסופי המשמש הוא חלבון 5 מיקרומטר וצבע כתום 5x SYPRO.
3. הכן 288 μL של תמיסת חלבון 6.25 מיקרומטר באמצעות מאגר TSA. נפח זה של תמיסת עבודה חלבונית מהווה 36 תגובות (33 תגובות עם תוספת של 10% עבור וריאציות בפיפט).
4. יש לפזר 8 μL של חלבון 6.25 מיקרומטר לבארות נפרדות של צלחת 384 בארות. יש לחלק את החיץ רק עבור בקרה ללא חלבון.
5. הוסף 1 μL של מולקולות קטנות בריכוז 10x כדי להשיג 1x סופי. כדי לעקוב אחר דוגמה זו, הוסף 1 μL של 20 mM MgCl₂ כדי להשיג ריכוז סופי של 2 mM. יש לחלק מאגר רק עבור הבקרה ללא תוספים.
6. הוסף 1 μL מכל תמיסת צבע תפוז 50x SYPRO לכל באר.
7. מכסים את הצלחת בסרט דבק אופטי שקוף.
8. סובב לזמן קצר את הצלחת במהירות של 1,000 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחית PCR.
9. הניחו את הצלחת במכשיר RT-PCR והתחילו את פרוטוקול התרמו-מחזור המתואר בשלב 1.1.

5. ניתוח נתונים

1. ייצוא נתונים ממכשיר RT-PCR עבור יחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU) ביחס לטמפרטורה (°C).
2. השתמש בתוכנה הנבחרת כדי לחלץ ולהתוות נקודות נתונים עד לעוצמה הגבוהה ביותר שנמדדה עבור כל עקומת התכה. חשוב לציין כי בקרות ללא חלבון וללא צבע מציגות פלואורסצנטיות רקע נמוכה ללא עלייה תלוית טמפרטורה בפלואורסצנטיות (איור 3A,B וטבלה משלימה S1). בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנות נגישות באופן חופשי כגון MoltenProt³¹ או DSFWorld³².
3. קבע את טמפרטורת ההתכה באמצעות Boltzmann Sigmoidal Fit עבור הנתונים. טמפרטורת ההתכה (T_m) מוגדרת כטמפרטורה שבה נצפית דנטורציה של 50% או חצי עוצמה מקסימלית (איור 3C).
4. שינוי תרמי בעקומת ההיתוך עשוי להצביע על ייצוב או ערעור של תוספים. כדי לחשב את השינוי בטמפרטורת ההתכה (T_m), השתמש בנוסחה: T_m = T_m additive_- T_m buffer. ערך חיובי מתאר מצב מייצב או תוסף אינטראקציה; ערך שלילי מתאר מצב מערער יציבות (איור 3D).

תוצאות

SelO אאוקריוטי מורכב מרצף מיקוד מיטוכונדריאלי N-טרמינלי, תחום דמוי קינאז, וסלנוציסטאין שמור מאוד במסוף C של החלבון²³. אנזים תושב מיטוכונדריה זה מקודד תחום פסאודוקינאז הנשמר מחיידקים לבני אדם²³. ניתוח מבני של הומולוג SelO ממזרקי Pseudomonas גילה שינוי?...

Discussion

בדיקת השינוי התרמי (TSA) משמשת כשיטה יעילה לסינון אינטראקציות חלבון-ליגנד, כולל אלה עם גורמים משלימים ומעכבים. בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-TSA כדי למדוד את הקישור של הפסאודוקינאז SelO לנוקלאוטידים ולקטיונים דו-ערכיים. הממצאים שלנו מראים כי SelO מציג יציבות תרמית מוגברת בנוכחות ATP ו-...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA