פרמקולוגיה ברשת ואימות המנגנונים נוגדי הדיכאון של צ'יאנגז'יפאנג במודל עכברוש דיכאון המושרה על ידי ריסון כרוני

Summary

מחקר זה העריך את היעילות נוגדת הדיכאון של Qiangzhifang במודל עכברוש של דיכאון כרוני הנגרם על ידי מתח והבהיר את השפעתו הרגולטורית על מסלולי HIF-1 ו-JAK-STAT על ידי פרמקולוגיה של רשת וניתוח עגינה מולקולרית.

Abstract

דיכאון הוא הפרעה פסיכיאטרית מורכבת המציבה אתגרי טיפול משמעותיים. Qiangzhifang (QZF), תרכובת המשמשת ברפואה הסינית המסורתית, מדגימה יעילות קלינית פוטנציאלית בטיפול בדיכאון. עם זאת, מנגנוני הפעולה והחומרים הפעילים של QZF לא הובהרו במלואם. המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה להבהיר את החומרים הפעילים היעילים והמנגנונים המולקולריים הפוטנציאליים של QZF להקלה על דיכאון על ידי שילוב תחזיות פרמקולוגיה ברשת עם אימות ניסיוני.

אימצנו מודל עכברושים של איפוק כרוני (CRS) וערכנו מבחנים התנהגותיים כגון מבחן שדה פתוח (OFT), מבחן העדפת סוכרוז (SPT) ומבחן שחייה כפויה (FST) כדי להעריך את ההשפעות הטיפוליות של QZF על דיכאון. לגבי פרמטרים התנהגותיים, קבוצת QZF הראתה מסת גוף גבוהה משמעותית, יחס העדפת סוכרוז וזמן שהייה באזור המרכזי בהשוואה לקבוצת המודל (P < 0.01, P < 0.01, P < 0.01), וזמן קיבוע מופחת משמעותית במבחן השחייה הכפויה (P < 0.001). מחקרי פרמקולוגיה של רשת ועגינה מולקולרית מצביעים על כך של-QZF עשויות להיות השפעות נוגדות דיכאון על ידי אפנון מסלולי HIF-1 ו-JAK-STAT, עם גני מטרה מרכזיים כולל AKT1, IL-6, MTOR ו-TP53, המעורבים בדלקת, הגנה עצבית ואפופטוזיס. לסיכום, מחקר זה מציע תובנות חדשות לגבי המודרניזציה והפיתוח של תרכובות הרפואה הסינית לטיפול מקיף בדיכאון.

Introduction

דיכאון, אתגר בריאותי עולמי נפוץ, מאופיין במצב רוח ירוד מתמשך, ירידה בעניין ובהנאה וליקויים קוגניטיביים ונוירולוגיים¹. כפי שדווח על ידי ארגון הבריאות העולמי, דיכאון משפיע על כ-380 מיליון אנשים ברחבי העולם, ונתון זה צפוי לגדול^{פי 2}. כהפרעה נפשית מורכבת ורב-גורמית, דיכאון משפיע על איכות חייהם של החולים ומהווה נטל כלכלי ורפואי ניכר על החברה, המאופיין בשכיחות גבוהה, שיעורי הישנות ושיעורי נכות³.

האטיולוגיה של דיכאון היא מורכבת, כאשר המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. ככל שהמחקר בתחום זה מתקדם, גורמים כמו דלקת עצבית, מתח חמצוני ואפופטוזיס זכו לתשומת לב משמעותית. מחקרים מצביעים על כך שחולים עם דיכאון מציגים רמות גבוהות של ציטוקינים מעודדי דלקת כמו TNF ואינטרלוקין-1β בהשוואה לאנשים בריאים, ושכיחות גבוהה יותר של דיכאון נצפתה אצל אנשים עם מצבים דלקתיים⁴. בעקה חמצונית, זני חמצן פעילים (ROS) מיוצרים יתר על המידה בתגובה לגירויים מזיקים, מכריעים את ההגנות נוגדות החמצון של הגוף ומובילים לחוסר איזון בין מערכות חמצון ונוגדי חמצון, ובכך גורמים לנזק לרקמות. מתח חמצוני מוגבר בדיכאון יכול להגביר את חמצון השומנים ולהחמיר את הנזק לגנים ולחלבונים תאיים, להשפיע על תפקוד העצבים ולתרום לניוון עצבי, אפופטוזיס ופגיעה בפלסטיות⁵. בנוסף, השינויים שנצפו במצגות קליניות, סמנים ביוכימיים ומבני מוח בחולים עם דיכאון קשורים לאפופטוזיס. מחקרי הדמיה חושפים ירידה בנפח ההיפוקמפוס וניוון בחולים עם דיכאון, כאשר אפופטוזיס עצבי עשוי לשחק תפקיד מרכזי בשינויים אלה⁶.

נכון לעכשיו, טיפול תרופתי הוא הגישה העיקרית לניהול דיכאון, כאשר מעכבי ספיגה חוזרת סלקטיביים של סרוטונין (SSRI) ומעכבי ספיגה חוזרת של נוראדרנלין (NRI) משמשים לעתים קרובות בפרקטיקה הקלינית⁷. עם זאת, תרופות אלו מלוות בתופעות לוואי משמעותיות. בנוסף לתסמינים של מערכת העצבים המרכזית כמו כאבי ראש ונדודי שינה, רוב התרופות נוגדות הדיכאון מציגות בדרך כלל גם תופעות לוואי במערכת העיכול, כולל בחילות ושלשולים^. חלק מהתרופות נוגדות הדיכאון עלולות גם לגרום להפרעות בתפקוד המיני¹⁰, מה שמשפיע קשות על תוצאות הטיפול ומפחית את ההיענות לתרופות בקרב חולים עם דיכאון¹¹. יתר על כן, יעילותן של תרופות אלו מוגבלת עבור חלק מהחולים. מחקרים מטבולומיים אחרונים הצביעו על כך שהבדלים אינדיבידואליים במיקרוביוטת המעיים עשויים להשפיע על יעילות התרופה¹². לכן, פיתוח טיפולים בטוחים ויעילים יותר נותר מוקד קריטי בחקר הדיכאון.

ניסוחים של רפואה סינית מסורתית (TCM) הוכיחו פוטנציאל משמעותי בטיפול בדיכאון, המיוחס להשפעות הסינרגטיות שלהם הכוללות מרכיבים, מטרות ומסלולים^{מרובים 13}. הרפואה הסינית המסורתית מניחה כי יאנג צ'י נמרץ חיוני לשמירה על חיוניות הגוף. לכן, פרופסור יואן-צ'ינג דינג, תוך מינוף העקרונות הייחודיים של אבחון וטיפול ברפואה סינית מסורתית וניסיון קליני רב, הציע כי "יאנג יו שן טוי" הוא הפתוגנזה הבסיסית של דיכאון. בהתבסס על תפיסה זו, הוא פיתח את Qiangzhifang (QZF) כדי לטפל באופן ספציפי בפתוגנזה זו¹⁴. היישום הקליני של QZF בטיפול בדיכאון הוכיח יעילות משמעותית, עם שיעור אפקטיבי כולל של 71.43%¹⁵. QZF מורכב מחומרים רפואיים סיניים מסורתיים שונים, כולל רמולוס קינמומי (gui zhi, GZ), Polygala tenuifolia (יואן ג'י, YZ), Alpinia oxyphylla miq (יי ג'י רן, YZR), Paeonia lactiflora (באי שאו, BS), Fritillariae cirrhosae bulbus (צ'ואן ביי מו, CBM), ג'ינסנג קוריאני (רן שן, RS), רודיולה רוזאה L (הונג ג'ינג טיאן, HJT) וליקריץ (gan cao, GC) (קובץ משלים 1 ). מחקרים הראו כי Polygala tenuifolia עשיר בספונינים ומציג השפעות נוירו-פרוטקטיביות¹⁶. באופן דומה, זוג עשבי המרפא Ramulus Cinnamomi-Paeonia lactiflora מדגים יעילות פוטנציאלית בהקלה על כאב ודיכאון¹⁷. בנוסף, סך הספונינים של הג'ינסנג יכול להפחית את רמות הציטוקינים הפרו-דלקתיים בהיפוקמפוס, לשפר התנהגות דיכאונית ולהחליש את הנזק העצבי בהיפוקמפוס בחולדות¹⁸. ליקוריץ מכיל בעיקר טריטרפנואידים ופלבונואידים. סך הפלבונואידים (LF) של ליקוריץ יכול למלא תפקיד נוגד דיכאון על-ידי שיפור התנהגות דיכאונית, ויסות מסלול האיתות BDNF/TrkB ושיפור הפלסטיות הסינפטית¹⁹. עם זאת, המנגנונים הספציפיים העומדים בבסיס ההשפעות נוגדות הדיכאון של QZF נותרו לא ברורים, ובכך מגבילים את היישום הנרחב שלו.

לכן, המחקר שלנו נועד לבסס מודל חולדות דיכאון CRS, להדגים את ההשפעה הטיפולית של QZF על דיכאון בחולדות באמצעות ניסויים התנהגותיים, ולהעריך באופן שיטתי את המנגנון נוגד הדיכאון של QZF באמצעות פרמקולוגיה ברשת וטכנולוגיית עגינה מולקולרית²⁰. על ידי הבהרת המרכיבים הפעילים והמטרות הפוטנציאליות של QZF, ניתן לאתר במדויק את יעדי הליבה של דיכאון. אנו מאמינים כי על ידי חקירה מעמיקה של מנגנון הפעולה של QZF, אנו יכולים לא רק לספק אפשרויות טיפול בטוחות ויעילות יותר לחולים עם דיכאון, אלא גם לספק בסיס מדעי ליישום הרפואה הסינית המסורתית בטיפול בדיכאון.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שאנדונג לרפואה סינית מסורתית (מספר אישור: YYLW2023000327) ועמדו במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שהונפק על ידי המכונים הלאומיים לבריאות. בניסוי הזה השתמשנו ב-40 חולדות Wistar זכרים בריאים, בדרגת SPF, עם משקל גוף ממוצע של (140 ±-10) גרם (איור 1). עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של כל החומרים, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה.

1. מודל דיכאון עכברים

1. דיור וקיבוץ בעלי חיים
   1. היכנסו לחדר הרבייה עם בעלי החיים ומספור אותם באמצעות מכשיר לסימון זנב.
   2. שיכנו את החולדות בנפרד בכלובים, תוך שמירה על טמפרטורה של 21 ± 2 מעלות צלזיוס ומחזור אור / חושך של 12 שעות / 12 שעות.
   3. אקלום החולדות במעבדה למשך 7 ימים, ומספק גישה אד ליביטום למזון ומים תוך טיפול יומיומי בהם לצורך הסתגלות.
   4. לאחר תקופת ההתאקלמות, יש למדוד את משקל הגוף, ולבצע את מבחני העדפת הסוכרוז (SPT) ומבחני השדה הפתוח (OFT).
   5. בהתבסס על נתוני הניסוי, חלקו את החולדות לארבע קבוצות, וודאו שכל קבוצה מורכבת מ-10 חולדות: קבוצת הביקורת (CON), קבוצת המודל (CRS), קבוצת QZF וקבוצת הפלואוקסטין (F).
2. הקמת מודל עכברושים לריסון כרוני (CRS)
   1. בנה את התקן ריסון החולדות. בחרו צינור פלסטיק שקוף בקוטר ובאורך המתאימים לגודל²¹ של החולדה, המאפשר לחולדה לעמוד ולהסתובב פנימה תוך מניעת בריחה. השתמש במנקב חורים מברזל הלחמה חשמלי כדי ליצור חורים בצידי צינור הפלסטיק ועל המכסה כדי להבטיח זרימת אוויר תקינה.
   2. הנח בעדינות את החולדות בהתקני הריסון (למעט אלה בקבוצה C) שעה אחת לאחר מתן תוך-קיבה יומי של התרופה, וודא שהן במצב נוח.
   3. מנע מכל קבוצות החולדות מזון ומים בתקופת האיפוק. לאחר סיום תקופת הריסון יש לספק להם מזון ומים בשפע באופן אחיד. קבעו את משך הריסון היומי ל-6 שעות (מ-9:30 עד 15:30) ושמרו עליו במשך 28 ימים רצופים.

2. התערבות תרופתית

1. מתן באמצעות גבאז': 1 מ"ל תמיסה/100 גרם משקל גוף, פלואוקסטין (2.7 מ"^ג-ק"ג-1·^{יום-1) ו-QZF} (2 גרם·ק"^ג-1·^יום-1)²². ספק לקבוצות C ו-CRS תמיסת מלח נורמלית שווה ערך לבקרה של משתנה יחיד.
   הערה: מתן תרופות יומי בוצע בשעה 08:00, החל באופן סינכרוני עם הקמת המודל ונמשך לאורך כל תקופת הדוגמנות של 28 יום.

3. מבחן העדפת סוכרוז (SPT)

1. מנעו מהחולדות מזון ומים למשך 24 שעות לפני תחילת הניסוי.
2. הכינו תמיסת סוכרוז מימית 1% ומלאו את התמיסה והמים הטהורים בבקבוקי השתייה של חיות הניסוי לשקילה. מדוד את צריכת המים הטהורים ומי הסוכרוז על ידי שקילת הבקבוקים לפני ואחרי הניסוי.
3. הניחו בקבוק אחד של תמיסת סוכרוז ובקבוק אחד של מים טהורים בצריכת המים של כל מכסה כלוב חולדות, אחד משמאל ואחד מימין, לגישה חופשית לשתייה. כדי למנוע מחולדות להעדיף צד אחד לצריכת מים, החליפו את מיקומי בקבוקי המים משמאל ומימין לאחר 30 דקות לתוך הניסוי.
4. לאחר שעה אחת של הניסוי, הסר את כל בקבוקי המים, שקול אותם מיד ורשום את צריכת תמיסת הסוכרוז ומים טהורים. חשב את יחס העדפת הסוכרוז השבועי באמצעות הנוסחה:
   ערך העדפת סוכרוז = × 100%

4. מדידת משקל גוף

1. שקלו את החולדות מדי שבוע עם כניסתן למעבדה וקבעו את השעה הקבועה לשקילה בשעה 7:00 בבוקר. קבע לוח זמנים זה כדי להקל על התבוננות בשינויים במשקל הגוף.

5. מבחן שדה פתוח (OFT)

1. לפני תחילת הניסוי, התאקלמו את החולדות בחדר ההתנהגותי למשך שעה אחת והתאימו את התאורה בתיבת השדה הפתוח כדי להבטיח פיזור אחיד. ודא שהחולדות נראות בבירור בתוכנת המעקב.
2. השתמש במערכת המעקב והניתוח של הווידאו כדי לחלק את המשטח התחתון של תיבת השדה הפתוח (50 ס"מ x 50 ס"מ x 50 ס"מ) לתשע רשתות מרובעות בעלות שטח שווה. ייעד את שמונה הרשתות הסמוכות לקירות כאזור ההיקפי ואת הגריד המרכזי כאזור המרכזי.
3. מקם את החולדה באזור המרכזי של תיבת השדה הפתוח. הקלט את תנועת החולדה במשך 5 דקות באמצעות מערכת מעקב הווידאו.
4. לאחר בדיקת כל חולדה, נקו את החדר עם 75% אתנול כדי להסיר ריח שיורי ולמנוע הפרעה להתנהגות החולדה הבאה. הזן את המרחק הכולל (מ"מ) של פעילויות שדה פתוח ואת מספר הערכים ברשת המרכזית ברשומות OFT.

6. מבחן שחייה כפוי (FST)

הערה: ניסוי השחייה הכפויה של חולדות כולל ניסוי מקדים וניסוי פורמלי. ערכו את הניסוי המקדים 24 שעות לפני הניסוי הפורמלי, בהתאם לאותו הליך, כאשר החולדה שוחה במשך 15 דקות.

1. העבירו את חיות הניסוי לחדר ההתנהגות לפחות 30 דקות לפני הניסוי כדי לאפשר להן להתאקלם בסביבה.
2. מכינים גליל פרספקס גלילי שקוף (50 ס"מ גובה, 20 ס"מ קוטר) וממלאים אותו במים בטמפרטורה של 23-25 מעלות צלזיוס. התאם את עומק המים על סמך משקל החיה, וודא שזנב החיה יישאר במרחק מסוים מתחתית הגליל.
3. הכניסו את החולדות לאט לתוך גליל המים ושמרו על שקט לאורך כל הניסוי. הפעל את המצלמה ומערכת רכישת האותות. התבונן ורשום את משך חוסר התנועה הצף תוך 300 שניות. הוציאו מיד את החולדות מהמים וייבשו אותן בסוף הניסוי.
4. לאחר כל מפגש, החלף את המים כדי למנוע כל השפעה על החולדה הבאה.

7. חיזוי פרמקולוגי ברשת

1. אוסף תרכובות QZF ומטרות משוערות
   1. גש למסד הנתונים של פרמקולוגיה של מערכות הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/)²³, למסד הנתונים HERB²⁴ ולמסד הנתונים TCMID (https://www.bidd.group/TCMID/). השתמשו בשמונת שמות הרפואה הסינית המסורתית ב-QZF, כולל GZ, YZ, YZR, BS, CBM, RS, HJT ו-ZGC, כמילות מפתח כדי לחפש תרכובות פעילות ומטרות של צמחי המרפא. אסוף יעדים מ-TCMSP ומחיזוי היעדים השוויצרי (http://www.swisstargetprediction.ch/). הגדר את ערך המסנן להסתברות* > 0.
      הערה: בדרך כלל, המרכיבים נכללו כמרכיבים פעילים על סמך המאפיינים הפרמקוקינטיים שלהם: זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 30% ומאפיינים דמויי תרופה (DL) ≥ 0.18²⁵.
2. חיזוי יעדי מחלה
   1. חפשו את מילת המפתח "דיכאון" במסד הנתונים של GeneCards (https://www.genecards.org/), השיגו מטרות גנים הקשורות לדיכאון, הורידו את הגיליון האלקטרוני של מטרות המחלה, סננו את ציוני הגנים הגבוהים מהערך הממוצע והרכיבו רשימה של מטרות דיכאון²⁶.
3. רשת תרופה-רכיב-מחלה-מטרה
   1. צור גיליון אלקטרוני חדש ואכלס אותו ביעדים הקשורים לדיכאון ומטרות תרופות באותה עמודה. לחץ על התחל בשורת התפריטים | עיצוב מותנה | כללי הדגשת תאים | ערכים כפולים. בחר תבנית (לדוגמה, "מילוי אדום בהיר") בתיבת הדו-שיח המופיעה²⁷, לחץ על OK כדי להציג את התוצאות.
   2. הפעל את תוכנת ניתוח הרשת וייבא את קובץ הגיליון האלקטרוני על ידי לחיצה על קובץ בשורת התפריטים | יבוא | רשת. מטב את מראה הרשת על-ידי התאמת הגודל והצבע של הצמתים בחלונית Style הממוקמת בלוח הבקרה השמאלי. בצע ניתוח טופולוגיית רשת על ידי לחיצה על כלים בשורת התפריטים | נתח את רשת²⁷.
4. רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)
   1. גש לכלי Jvenn (https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html), העלה את מטרות התרכובת ויעדי המחלה בנפרד, שרטט את הגנים החופפים (OGE) בין המטרות המשוערות של התרכובת ויעדי המחלה. לחץ על המספרים בתמונה והעתק אותם לגיליון אלקטרוני והורד את תמונת דיאגרמת ון.
   2. גש למסד הנתונים STRING (https://stringdb.org/)²⁸ והזן את ה-OGEs מהגיליון האלקטרוני למסד הנתונים. באופן ספציפי, הדבק את רשימת היעד החופפת למניעת דיכאון QZF בתיבת הדו-שיח רשימת שמות . בחר הומו ספיינס בקטע אורגניזמים ולחץ על חיפוש | המשך. בחר באפשרות ייצוא משורת הכותרת והורד את טבלת הסיכום של רשת PPI בפורמט PNG ו-TSV²⁹.
5. סינון חלבוני ליבה
   1. הפעל את תוכנת ניתוח הרשת (https://cytoscape.org/). לאחר מכן, בשורת התפריטים, לחץ על קובץ | יבוא | רשת | קובץ לייבוא קובץ בפורמט TSV שנוצר בשלב^{הקודם 30}.
   2. בחרו 'נתח רשת' בשורת התפריטים ולחצו על הלחצן 'נתח '. לאחר מכן, צפה בתוצאות הניתוח והבין את המאפיינים המבניים הכוללים של הרשת, כגון מספר הצמתים, מספר הקצוות והדרגה הממוצעת.
   3. בחר אפליקציות | מנהל האפליקציות בשורת התפריטים. חפש את MCODE, התקן את התוסף והפעל את התוסף כדי לקבל את יעד הרכזת. לאחר מכן, חפש את CytoNCA, התקן את התוסף והתמקד בשלושת ערכי הפרמטרים של מעלות, מרכזיות קרבה (CC) ומרכזיות בין (BC). על פי הערכים של פרמטרים אלה, צמתים מסננים עם דרגה גבוהה יותר, CC ו-BC, הנחשבים בדרך כלל לחלבוני ליבה³¹.
6. ניתוח העשרה של אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG)
   1. פתח את פלטפורמת הביואינפורמטיקה (https://www.omicshare.com/). לחץ על תפריט כלים , מצא את כלי המרת הגנים של המזהה ולחץ עליו. לאחר מכן, לחץ על כפתור העלאת הקובץ , בחר את השלב שנוצר בליבת גני היעד והורד את רשימת מזהי הקבצים שהומרו.
   2. בתפריט כלים , לחץ על הכלי ניתוח העשרה דינמי של KEGG . העלה את רשימת מזהי הגנים. באפשרות מינים , בחר הומו ספיינס ולחץ על כפתור שלח .
   3. בתפריט כלים, לחץ על הכלי ניתוח העשרה דינמי GO | אפשרות גן | אפשרות העלאת קובץ. בחר ברשימת מזהה הגן ובאפשרות Species, בחר Homo sapiens. בחר את סוג ה-GO לניתוח, כולל תהליך ביולוגי, תפקוד מולקולרי ורכיב תאי.
   4. לתוצאות ניתוח העשרה של KEGG ו-GO, הגדר את סף הסינון כ-p <-0.05. סדר את הספירות בסדר יורד.

8. אימות עגינה מולקולרית

1. בקר באתר האינטרנט של PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). הזן את תרכובות היעד בסרגל החיפוש. לחץ על המבנה הדו-ממדי והורד אותו.
2. פתח את מסד הנתונים PDB (https://www.Rcsb.org/). בחר את מבנה הגביש ברזולוציה גבוהה ומכיל את הליגנד המקורי. הורד את קובץ PDB.
3. לאופטימיזציה של מבנה החלבון, פתח את תוכנת ההדמיה המולקולרית. טען את קובץ ה-PDB שהורדת. הסר מולקולות מים ושמור את קובץ ה-PDB המותאם.
4. פתח את תוכנת העגינה המולקולרית וייבא את קובץ ה-PDB המותאם. ב-AutoDockTools, לוחצים על עריכה | מחק מים כדי למחוק מולקולות מים. לחץ על ערוך | הוספת מימן | הוסף כדי להוסיף אטומי מימן לחלבון וליגנד²⁹.
5. ב - AutoDockTools, הגדר את סרגל הקולטן ל- receptor.pdbqt ואת סרגל הליגנד ל- ligand.pdbqt. פתח את ה-pdbqt. file כדי להציג את אתרי הקישור של החלבון והליגנד ולהגדיר את הגודל והמיקום של תיבת העגינה כדי להבטיח שהיא יכולה לסגור לחלוטין את חלבון הקולטן ואת תרכובת הליגנד. ב-AutoDockTools, לחץ על רשת | הגדר תיבת רשת לקביעת הקואורדינטות והממדים המרכזיים של התיבה והשתמש בערכי ברירת מחדל לעגינה מולקולרית. מסגרות העגינה ימוינו אוטומטית בסדר יורד של אנרגיות קשירה.
6. פתח את התוצאה file ורשום את ערך אנרגיית הכריכה האופטימלי. אנרגיות קשירה נמוכות יותר מעידות על קשירה יציבה יותר. השתמש בתוכנת ההדמיה המולקולרית כדי לטעון את קובץ התוצאה. התאם את view וצבע כדי להציג בבירור את האינטראקציה בין ליגנד-קולטן.

9. ניתוח סטטיסטי

1. לבצע ניתוח סטטיסטי בתוכנת ניתוח הנתונים המדעיים והדמיה ולהציג את כל הנתונים כממוצע ± SEM. להשתמש ב-ANOVA דו-כיווני חוזר להשוואה בין קבוצות לפני ואחרי מתן תרופה. השתמש ב-ANOVA חד-כיווני לצורך השוואות בין יותר משתי קבוצות.
2. ניקח את הערך של P < 0.05 כמובהק סטטיסטית.

תוצאות

תוצאות מבחן התנהגותי במודל דיכאון עכברושים המושרה על ידי CRS

תוצאות בדיקת העדפת סוכרוז
בנקודת ההתחלה, לא היה הבדל במקדם העדפת הסוכרוז בין הקבוצות (P > 0.05). לאחר 28 ימי התערבות, מקדם העדפת הסוכרוז של קבוצת ה-CRS היה נמוך משמעותית מזה של קבוצת ה-CON (P < 0.05), בעוד שקבוצות F ו-QZF הראו מקדמים גבוהים משמעותית בהשוואה לקבוצת CRS ( שניהם P < 0.01). התוצאות הצביעו על כך שחולדות לחוצות הראו תסמינים אנהדוניים אופייניים, שהוקלו על ידי טיפול ב-F ו-QZF (איור 2A).

תוצאות משקל גוף
לפני השראת CRS, לא נצפו הבדלים משמעותיים בין הקבוצות (P > 0.05). לאחר 4 שבועות של לחץ, קצב גדילת משקל הגוף של קבוצת CRS היה נמוך משמעותית מזה של קבוצת CON (P < 0.01), בעוד שקבוצות F ו-QZF הראו שיעורי גדילה גבוהים משמעותית מקבוצה M (P < 0.001, P < 0.01). הממצאים האלה מצביעים על כך שסטרס שיבש את חילוף החומרים הפיזיולוגי הנורמלי בחולדות, כאשר קבוצות F ו-QZF הראו שיפורים ותיקונים משמעותיים בפרופילים המטבוליים החריגים שלהם (איור 2B).

תוצאות בדיקת שדה פתוח
לאחר 28 ימי התערבות, לא היה הבדל משמעותי במרחק הכולל של מבחן שדה פתוח בין ארבע הקבוצות (P > 0.05) (איור 2D). בהשוואה לקבוצת CON, זמן השהות באזור המרכזי של קבוצת CRS הצטמצם באופן משמעותי (P < 0.01). בהשוואה לקבוצת CRS, זמן השהות באזור המרכזי של קבוצות F ו-QZF גדל באופן משמעותי (שניהם P < 0.01). לא היה הבדל משמעותי בין קבוצות הטיפול (P > 0.05) (איור 2C,E).

תוצאות בדיקת שחייה כפויה
לאחר 28 ימי התערבות, קבוצת ה-CRS הראתה זמן חוסר תנועה מוגבר משמעותית בהשוואה לקבוצת CON (P < 0.0001). בהשוואה לקבוצת CRS, קבוצות F ו-QZF הראו זמני חוסר תנועה מופחתים באופן משמעותי (P < 0.05, P < 0.001) (איור 2F).

חיזוי פרמקולוגיה של רשת

התמקדות ברשתות עם הנחות מורכבות
כדי לבנות את רשת המטרה ההיפותטית-מורכבת QZF, סיננו תחילה 1,020 מטרות היפותטיות של QZF, שנאספו והודגמו כמטרות מורכבות על ידי תוכנת ניתוח הרשת. הרשת הראתה 1,184 צמתים ו-8,728 קצוות (איור 3)³².

QZF ובדיקת יעד דיכאון
בסך הכל 17,947 מטרות הקשורות לדיכאון אוחזרו ממסד הנתונים של GeneCards, והציגו ציון רלוונטיות ממוצע של 1.105. יעדים עם ציון רלוונטיות העולה על 1.105 (n = 5,048) נבחרו לאחר מכן לניתוח נתונים נוסף. דיאגרמת ון נבנתה עם 1,020 מטרות מ-QZF כדי להשיג 612 מטרות משותפות (OGEs) (איור 4A). 612 המטרות הנפוצות יובאו למסד הנתונים של STRING לניתוח, ורשת ה-PPI הכילה 607 צמתים ו-14,375 קצוות (איור 4B), וה-OGEs יובאו לתוכנת ניתוח הרשת כדי להשיג את רשת האינטראקציה.

סינון של גני מטרה מרכזיים
ניתוח מודול באמצעות תוסף MCODE זיהה את מודול האשכול עם הציון הגבוה ביותר, שהיה לו ציון MCODE של 54.19029³¹. זיהינו 64 מטרות מפתח בתוך מודול רכזת האשכול שהן קריטיות להשפעות נוגדות הדיכאון של QZF (איור 4C). באמצעות התוסף CytoNCA, סיננו צמתים מחוברים מאוד על סמך שלושה מדדי מרכזיות: מרכזיות דרגה (DC), מרכזיות קרבה (CC) ומרכזיות בין (BC). באופן ספציפי, מרכזיות דרגה מודדת את מספר החיבורים הישירים שיש לצומת בתוך הרשת. מרכזיות הקרבה מכמתת את ההדדיות של אורך הנתיב הקצר ביותר הממוצע בין צומת לכל הצמתים האחרים, ומציינת עד כמה יעיל צומת יכול לגשת לאחרים. מרכזיות הביניים מעריכה את התדירות שבה צומת מופיע בנתיבים הקצרים ביותר בין כל זוגות הצמתים, ומשקפת את תפקידו המתווך. בהתבסס על מדדים אלה, בנינו את רשת הליבה וזיהינו את 10 הצמתים המחוברים ביותר: BCL2, AKT1, IL6, BCL2L1, MTOR, CASP3, TP53, STAT3, NFKB1 ו-HIF1A (איור 4D). לאחר סינון הנתונים, ביצענו ניתוח העשרה פונקציונלי על 10 גני המטרה העיקריים הללו כדי להבהיר עוד יותר את התפקודים הביולוגיים שלהם.

ניתוח העשרה GO
ניתוח ההעשרה של GO הניב בסך הכל 2,783 פריטים מוערים, כאשר 2,385 הראו מובהקות סטטיסטית. ניתוח זה השפיע בעיקר על קטגוריות התהליך הביולוגי (BP), התפקוד המולקולרי (MF) והמרכיב התאי (CC). באופן ספציפי, קטגוריית GO-BP כללה 2,450 פריטים, מתוכם 1,926 נחשבו מובהקים סטטיסטית. קטגוריית הפונקציה המולקולרית (GO-MF) זיהתה 184 פריטים, כאשר 117 הראו מובהקות סטטיסטית. קטגוריית הרכיב התאי (GO-CC) חשפה 149 פריטים, ומתוכם, 59 היו מובהקים סטטיסטית (איור 5).

ניתוח העשרה של KEGG
ניתוח העשרת מסלולי KEGG זיהה בסך הכל 156 מסלולים הקשורים ל-10 היעדים המרכזיים, כאשר 119 מהמסלולים הללו מדגימים מובהקות סטטיסטית. הנתונים ממחישים את 20 המסלולים המובילים עם ציוני ההעשרה הגבוהים ביותר (איור 6). הסרת כמה מחלות נלוות הותירה שני מסלולי איתות, HIF-1 ו-JAK-STAT, שנחזו להיות מסלולי מפתח ל-QZF ודיכאון.

רשתות נתיב מטרה עיקריות ל-QZF ודיכאון
כדי להבהיר את הקשר המכניסטי בין QZF והשפעותיו על דיכאון, פיתחנו רשת אינטראקציה מרכזית בין תרכובת TCM למסלול מטרה (איור 7). תוך שימוש בתוכנת ניתוח רשת, דמיינו את מסלול האיתות עם ערך ה-p המשמעותי ביותר יחד עם היעדים הקשורים אליו. גרף הרשת שהתקבל כלל 93 צמתים ו-218 קצוות. יתר על כן, יצרנו דיאגרמת Sankey כדי לייצג גנים מרכזיים והתרכובות הפעילות המתאימות להם, תוך התמקדות ספציפית במסלולי איתות הליבה HIF-1 ו-JAK-STAT (איור 8).

עגינה מולקולרית
ניתוח עגינה מולקולרית אומץ כדי לבסס את ספציפיות המטרה של התרכובת. טכניקה זו מעריכה את זיקת הקישור בין ליגנד למטרת החלבון שלו, כאשר גדלים נמוכים יותר של אנרגיית קשירה מצביעים על אינטראקציה חזקה יותר וקרבה יותר של הליגנד לאתר הקישור שלו³³. התוצאות הראו כי אנרגיות הקישור היו -8.7 קק"ל/מול עבור HIF1A ו-Glycyrrhiza flavonol A, -8.5 קק"ל/מול עבור STAT3 וג'ינסנוזיד rh2, -7.6 קק"ל/ממול עבור BCL2 ואיזוליקופלבונול, -6.8 קק"ל/מול עבור MTOR וליקוקלקון B, -6.7 קק"ל/מול עבור AKT1 וקמפפרול, ו-5.2 קק"ל/מול עבור IL6 וחומצה לינולנית.

בסך הכל, תוצאות העגינה המולקולרית הראו כי התרכובות הראו זיקה חזקה למטרותיהן. אנרגיית הקישור של כל חלבון מוצגת באופן הבא: דפוס הקריקטורה הלבן מייצג את קולטן החלבון, הכחול הוא ליגנד המולקולה הקטנה, הקו המקווקו הצהוב מציין את קשר המימן שנוצר בין הליגנד לקולטן, הירוק מייצג את אתר ההתקשרות של קשר המימן בין קולטן החלבון לליגנד המולקולה הקטנה, והמספרים מסמלים את מרחקי קשרי המימן, מה שמרמז על כך שהקישור בין הליגנד לקולטן יציב ביותר (איור 9)³⁴.

איור 1: תרשים זרימה של מבחני קיבוץ והתנהגות עבור חולדות ניסוי. קיצורים: CRS = מתח איפוק כרוני; QZF (Q) = qiangzhifang; F = פלואוקסטין; OFT = מבחן שדה פתוח; FST = מבחן שחייה כפוי; SPT = מבחן העדפת סוכרוז. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעות QZF על מודל דיכאון עכברושים המושרה על ידי CRS. (A) רמת צריכת סוכרוז (%) ביום 0 וביום 28. (B) משקל גוף (g) ביום 0 וביום 28. (C) תרשים מסלולי חולדות במבחן השדה הפתוח בשבוע 4. (D) המרחק הכולל של השדה הפתוח בימים 0 ו-28. (ה) משך השהות באזור המרכזי של OFT בכל קבוצה בשבוע 4. ** P < 0.01 מצביע על הבדל משמעותי בין קבוצות F ו-QZF בהשוואה לקבוצת CRS. (F) זמן חוסר התנועה של FST (%) בכל קבוצה בשבוע 4. * P < 0.01 מצביע על הבדל משמעותי בין קבוצת F בהשוואה לקבוצת CRS. P < 0.001 מצביע על כך שקבוצת QZF הראתה הבדלים משמעותיים בהשוואה לקבוצת CRS. קיצורים: CRS = מתח איפוק כרוני; QZF = qiangzhifang. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: רשת QZF-Compound-Target. המשולשים הירוקים מציינים את התרופות הסיניות המסורתיות ב-QZF; העיגולים מציינים את מרכיבי התרופות הסיניות המסורתיות; המעוינים מציינים את המטרות. החיצים הוורודים מציינים את המרכיבים המשותפים של מספר תרופות צמחיות סיניות. A (MOL000211) מתייחס לבאי-שאו וג'י גאן צאו; B (MOL000358) מזוהה עם באי שאו, צ'ואן ביי מו, גו ג'י ורן שן; C (MOL000359) מתחבר עם Bai shao, Chuan bei mu ו-Gui zhi; D (MOL000422) מתייחס לבאי שאו, ג'י גאן צאו ורן שן; E (MOL000492) רלוונטי לבאי-שאו וגו ג'י. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זיהוי יעדי הצטלבות וסינון יעדי הליבה. (A) דיאגרמת ון של המטרות הנפוצות של QZF ודיכאון. עיגולים ירוקים בהירים מייצגים את חלבוני המטרה של החומרים הפעילים ב-QZF; עיגולים כחולים מציינים חלבונים הקשורים לדיכאון. האזורים החופפים, שבהם שני הצבעים מצטלבים, ממחישים את החלבונים המשותפים, בסך הכל 612. (B) רשת PPI של QZF ודיכאון. (ג) ניתוח MCODE. (ד) 10 יעדי הליבה המובילים. קיצורים: QZF = qiangzhifang; PPI = אינטראקציה בין חלבון לחלבון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: היסטוגרמה לניתוח העשרת GO של מטרות נפוצות. הפסים הירוקים מייצגים תהליכים ביולוגיים; הפסים האדומים מייצגים פונקציות מולקולריות; הפסים הכחולים מייצגים רכיבים תאיים. הגובה של כל עמודה משקף את ספירת הגנים המשויכת למונח ה-GO המתאים. קיצור: GO = אונטולוגיה של גנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מסלולי העשרה של KEGG של המטרות הטיפוליות של QZF בדיכאון. (A) תרשים עמודות של 20 המסלולים המובילים, מדורגים לפי ערך P. (B) תרשים בועות של 20 המסלולים העליונים: גודל הנקודה מציין את מספר הגן; עוצמת הצבע משקפת משמעות של ערך P. (ג) ביאור פונקציונלי של מסלולי KEGG. קיצור: KEGG = אנציקלופדיה של קיוטו לגנים וגנומים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: רשת אינטראקציה של מסלול מטרה-תרכובת-תרכובת TCM. אדום מציין QZF ודיכאון, סגול מציין מסלולי איתות, ירוק מדגיש חלבוני מסלול ליבה, צהוב מזהה תרופות סיניות מסורתיות בתוך QZF, וכחול מציין תרכובות צמחיות מרכיבות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: דיאגרמת Sankey של מסלול תרכובת-מטרה-TCM עבור ההשפעה נוגדת הדיכאון של QZF בהתבסס על מסלולי איתות HIF-1 ו-JAK-STAT. קיצורים: QZF = qiangzhifang; TCM = רפואה סינית מסורתית; HIF-1 = גורם השראת היפוקסיה-1; JAK-STAT = מפעילי אותות קינאז המופעלים על ידי ג'אנוס ומפעילי שעתוק. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: תוצאות אימות עגינה מולקולרית. (A) מפת חום של אנרגיית קשירה (kcal/mol) בין רכיבים מייצגים של QZF ומולקולות חלבון מטרה (B) הדמיה של מצב העגינה. קיצור: QZF = qiangzhifang. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: הכנת גרגירי הרפואה הסינית המסורתית QZF. קיצור: QZF = qiangzhifang. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

CRS היא שיטה בשימוש נרחב לביסוס מודלים של דיכאון בבעלי חיים. מודל זה מחקה את הלחץ הפסיכולוגי הכרוני שנתקל בו בחיי אדם וגורם להתנהגויות דמויות דיכאון בחולדות³⁵. במחקר זה, צינור הריסון של החולדה נבנה מפלסטיק שקוף, מה שמבטיח את בטיחות בעלי החיים תוך מתן אפשרות לתצפית ברורה במהלך הניסוי. הצינור השקוף נמדד באורך של כ-18 ס"מ ובקוטר של 6 ס"מ וכלל חורי אוורור מרובים, כל אחד בקוטר של 1 ס"מ, המפוזרים באופן אחיד לאורך הצדדים והמכסה כדי לספק זרימת אוויר מספקת לחולדות. החולדות הלחוצות הראו תסמיני דיכאון כמו עייפות ועיניים מזוגגות, יחד עם שינויים התנהגותיים האופייניים לדיכאון. באופן ספציפי, שינויים אלה כללו ירידה בפעילות המוטורית ב-OFT, זמן חוסר תנועה ממושך ב-FST וצריכת סוכרוז מופחתת ב-SPT. ביטויים התנהגותיים אלה דומים מאוד לברדיקינזיה, אנהדוניה ואובדן עניין שנצפו בחולים עם דיכאון קליני.

בהקשר של חקר המנגנונים הפתולוגיים המורכבים של דיכאון, השילוב של פרמקולוגיה ברשת וטכנולוגיית עגינה מולקולרית מספק אסטרטגיה חדשנית לניתוח המנגנונים המולקולריים של תרכובות הרפואה הסינית המסורתית בטיפול בדיכאון. מחקר זה זיהה את HIF1A, STAT3, BCL2, MTOR, AKT1 ו-IL6 כמטרות הליבה של QZF בטיפול בדיכאון. מטרות אלה הועשרו בעיקר במסלולי האיתות HIF-1 ו-JAK-STAT. שני מסלולי האיתות הללו ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכים הפתולוגיים העיקריים של דיכאון, כגון דלקת עצבית, מתח חמצוני ואפופטוזיס.

מסלול האיתות HIF-1, המשמש כמנגנון הבקרה המרכזי למטבוליזם של חמצן תאי, ממלא תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל הגנה עצבית, תגובות עקה נוגדות חמצון ואנגיוגנזה³⁶. מחקרים מצביעים על כך שרקמת המוח של אנשים עם דיכאון מציגה מיקרו-סביבה היפוקסית בולטת ופגיעה בעקה חמצונית, הקשורים קשר הדוק להפעלת תגובות נוירו-דלקתיות וחוסר איזון של נוירוטרנסמיטורים³⁷. המחקר של סמנזה מדגים כי בתנאים היפוקסיים, HIF-1α מווסת גנים הקשורים למטבוליזם של חמצן ומנגנוני הגנה נוגדי חמצון, כולל גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), אריתרופויטין (EPO) וגנים מיטוכונדריאליים. כתוצאה מכך, זה משפר את תפקוד המיטוכונדריה, מקדם היווצרות של מיקרו-כלי דם במוח, מגביר את אספקת החמצן לרקמת המוח ומפחית הצטברות מיני חמצן תגובתיים (ROS)³⁸.

מחקרים ניסיוניים נוספים מראים כי מחסור ב-HIF-1α משפר באופן ניכר את הרגישות העצבית למתח חמצוני, ובכך מעורר הפעלה חריגה של מסלול האיתות האפופטוטי³⁹. זה מוביל לעלייה משמעותית באפופטוזיס עצבי ולירידה קוגניטיבית מתקדמת. לעומת זאת, ביטוי יתר של HIF-1α ספציפי לנוירונים במודלים של עכברים טרנסגניים מגביר משמעותית הן את ההישרדות העצבית והן את הצפיפות הסינפטית⁴⁰. ממצאים אלה לא רק מבססים את התפקיד הקריטי של HIF-1α במנגנון ההגנה נוגד החמצון, אלא גם מדגישים את המשמעות הטיפולית הפוטנציאלית שלו בשיפור תפקוד המוח באמצעות קידום פלסטיות עצבית, עיצוב מחדש ואופטימיזציה של הארכיטקטורה הסינפטית. יתר על כן, מסלול האיתות HIF-1 נוגד את מסלול העברת האותות NF-κB, מה שמוביל להפחתה בייצור הציטוקינים הדלקתיים IL-6 ו-TNF-α, דיכוי דלקת עצבית והצגת השפעות נוירו-פרוטקטיביות ונוגדות דיכאון^{פוטנציאליות 41}.

יש לציין כי Glycyrrhiza flavonol A, אחד המרכיבים הפעילים של QZF, אושר כבעל תכונות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות. במחקר זה, נתוני עגינה מולקולרית מגלים כי ליקיריטיגנין A מפגין זיקה גבוהה לחלבון HIF-1α, המגיע ל-8.7 קק"ל/מול. ממצא זה מצביע בבירור על כך ש-Glycyrrhiza flavonol A, עשוי לכוון ישירות ל-HIF-1α, ומווסת את יציבות החלבון או את פעילות השעתוק שלו. כתוצאה מכך, הוא מווסת את ביטוי הגנים המעורבים במטבוליזם של חמצן והגנה נוגדת חמצון במסלול האיתות HIF-1, ובכך משפר את ההישרדות העצבית בתנאים היפוקסיים ומקל על נזק עצבי הקשור לדיכאון.

מסלול האיתות JAK-STAT משמש כמרכז מרכזי להעברת אותות ציטוקינים וממלא תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל ויסות דלקת, אפנון תגובה חיסונית והישרדות עצבית^42,43. מחקר מקיף הוכיח כי הפתוגנזה של דיכאון קשורה באופן מורכב לחוסר ויסות של מסלול האיתות JAK-STAT⁴⁴. מטא-אנליזה שבוצעה על ידי Dowlati et al. גילתה כי בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה, רמות הסרום של ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון IL-6 ו-TNF-α היו מוגברות באופן משמעותי בחולים עם דיכאון והיו בקורלציה חיובית עם חומרת תסמיני הדיכאון⁴⁵. באופן ספציפי, גורמים פרו-דלקתיים אלה מסוגלים להפעיל את מסלול JAK-STAT, ובכך לעורר תגובה דלקתית. תהליך זה לא רק גורם נזק ישיר לתאי עצב ותאי גליה, אלא גם פוגע במבנה ובתפקוד הסינפטי, ובסופו של דבר מחמיר ליקויים קוגניטיביים ורגשיים^{אצל חולים}.

יתר על כן, הפעלה מוגזמת של מסלול JAK-STAT קשורה מאוד לאפופטוזיס עצבי. זרחון מתמשך של STAT3 מווסת את הביטוי של גנים פרו-אפופטוטיים, כולל חברים ממשפחת ה-Caspase, ובסופו של דבר גורם לאובדן עצבי. בנוסף, ההפעלה החריגה של מסלול זה פוגעת בנוירוגנזה באזור ההיפוקמפוס ומפחיתה את הפלסטיות הסינפטית, ובכך מחמירה ליקויים נוירו-תפקודיים⁴⁷. במחקר זה, ג'ינסנוסיד Rh2, מרכיב פעיל חשוב ב-QZF, הפגין זיקה קשירה משמעותית עם חלבון STAT3 בניתוח העגינה המולקולרית. בהתבסס על ממצאים אלה, ג'ינסנוסיד Rh2 עשוי להקל ביעילות על תגובות נוירו-דלקתיות על ידי עיכוב ספציפי של הפעלת STAT3 ובכך להפחית את הייצור והשחרור של ציטוקינים פרו-דלקתיים⁴⁸.

בנוסף לשני מסלולי האיתות המרכזיים, HIF-1 ו-JAK-STAT, מחקר זה זיהה את האינטראקציות הסינרגטיות בין רכיבים ומטרות פעילים אחרים במהלך הפעולה נוגדת הדיכאון של QZF. BCL2, חלבון אנטי-אפופטוטי קנוני, ממלא תפקיד חיוני בשמירה על הישרדות התאים ודיכוי מסלולי איתות אפופטוטיים⁴⁹. ב-QZF, איזוליקופלבונול מפגין תכונות נוגדות חמצון ואנטי-אפופטוטיות על ידי התמקדות ספציפית בחלבון BCL2 והפעלה, ובכך מעכב ביעילות אפופטוזיס עצבי, מגן על נוירונים ומשפר שינויים נוירו-פתולוגיים הקשורים לדיכאון. יתר על כן, מסלול איתות ה-MTOR החריג בחולים עם דיכאון קשור מאוד לתפקוד לקוי של תאי העצב⁵⁰. מחקרים הראו כי ליקוקלקון B מקדם צמיחה והישרדות של תאי עצב, משפר את הפלסטיות הסינפטית והקישוריות התפקודית על ידי ויסות מסלול איתות MTOR⁵¹, ובכך מפעיל אפקט נוגד דיכאון. בנוסף, הפלבנואיד הטבעי קמפפרול, המאופיין בפעילות נוגדת חמצון ואנטי דלקתית עוצמתית, מפעיל באופן ספציפי את מסלול האיתות AKT1. באמצעות ויסות של מולקולות מפתח מרובות במורד הזרם, הוא לא רק מקדם את ההישרדות העצבית אלא גם מאיץ את ההתאוששות התפקודית, ובכך מספק תמיכה מולקולרית נוספת להשפעות נוגדות הדיכאון של QZF.

לסיכום, מחקר זה השתמש בפרמקולוגיה של רשת ועגינה מולקולרית כדי לחזות את המסלולים הטיפוליים, יעדי הליבה והמרכיבים הפעילים היעילים של QZF בטיפול בדיכאון. ההשפעה נוגדת הדיכאון של QZF אומתה במודל של דיכאון בחולדות, מה שמרמז על כך שהוא עשוי להפעיל את ההשפעות נוגדות הדיכאון שלו על ידי ויסות מסלולי איתות מרובים, כולל HIF-1 ו-JAK-STAT, והתמקדות בתהליכים פתולוגיים מרכזיים כגון דלקת עצבית, מתח חמצוני ואפופטוזיס. ממצא זה לא רק מעמיק את הבנתנו את המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיס הדיכאון, אלא גם מספק בסיס תיאורטי ומטרות טיפוליות חדשות ליישום פורמולות הרפואה הסינית המסורתית בטיפול בדיכאון. עם זאת, למחקר זה יש מגבלות מסוימות. המנגנונים הסינרגטיים של רכיבים מרובים ב-QZF עדיין צריכים להיות ברורים במלואם, והתהליכים המטבוליים והאינטראקציות של רכיבים אלה in vivo דורשים חקירה נוספת. מחקר עתידי יכול לשלב ניסויים במבחנה וב-vivo עם טכנולוגיות מתקדמות כגון כרומטוגרפיה נוזלית, ריצוף תפוקה גבוהה ואינטגרציה מולטי-אומיקס כדי לזהות באופן מקיף ומדויק את המטרות והמסלולים העיקריים הקשורים להשפעות נוגדות הדיכאון של QZF, ובכך לאמת ולהרחיב את התחזיות שנעשו באמצעות פרמקולוגיה ברשת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal behavior analysis system	Shanghai Xinsoft Information Technology Co., LTD	XR-SuperMaze
AutoDockTools	The Scripps Research Institute
Cytoscape  software	Cytoscape Consortium	version 3.7.2
Electric soldering iron hole puncher	Nanjing Naiwei Technology Co., Ltd.
Fluoxetine	Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., LTD
Open field experimental system	Shanghai Xinsoft Information Technology Co., LTD	XR-XZ301
PyMol	Schrödinger
Qiangzhifang	Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan, China
Transparent plastic tube	Nantong Baiyang Plastic Products Co., Ltd.