בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Summary

זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים במהלך ההתפתחות. מצאנו כי בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הן שנוצר הרחיב בשליה בתוך נישות microenvironmental ייחודי. כאן אנו מתארים ניסיוני בטכניקות נדרש בידוד להדמיה של HSCs את השליה העכבר.

Abstract

בתאי גזע hematopoietic (HSCs) יש את היכולת העצמית לחדש וליצור כל סוגי תאים של שושלות דם במהלך חייו של הפרט. HSCs כל לצוץ במהלך ההתפתחות העוברית, שלאחריו גודל הבריכה שלהם מתוחזק על ידי עצמית חידוש חלוקות תא. זיהוי המקור האנטומי של HSCs והאירועים התפתחותי קריטי בוויסות תהליך של התפתחות HSC כבר מסובך כמו באתרים אנטומיים רבים להשתתף במהלך hematopoiesis העובר. לאחרונה זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים שבהם HSCs נוצרות והורחב נישות microenvironmental ייחודי (Gekas, et al 2005, רודוס, et al 2008). כתוצאה מכך, השליה מהווה מקור חשוב של HSCs במהלך הופעתה שלהם והרחבת הראשונית.

במאמר זה, אנו מראים טכניקות לנתיחה עבור בידוד של השליה Murine מ E10.5 ו E12.5 עוברים, התואמת את שלבי ההתפתחות של תחילת HSCs ואת שיא בגודל של הבריכה HSC את השליה, בהתאמה. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ניתוק האנזימטית מכנית של רקמת השליה לתוך ההשעיה תא יחיד לשימוש cytometry זרימה או מבחני תפקודית. מצאנו כי השימוש collagenase להשעיה תא בודד של השליה נותן תשואות מספיק HSCs. גורם חשוב המשפיע תשואה HSC מן השליה היא מידת הניתוק מכני לפני, ומשך טיפול אנזימטי.

אנו מספקים גם פרוטוקול להכנת קבוע קפוא סעיפים רקמת השליה להדמיה של פיתוח HSCs ידי אימונוהיסטוכימיה בתוך נישות הסלולר המדויק שלהם. כמו אנטיגנים ספציפיים hematopoietic אינם נשמרים במהלך הכנת סעיפים פרפין מוטבע, אנו משתמשים באופן שגרתי חלקים קפואים קבוע localizing HSCs השליה אבות.

Protocol

1. העובר הסרת לנתיחה השליה

1. כדי להתחיל, עוברים תחילה יש לבודד סכרים בהריון.
2. בעלי חיים מומתים על פי הנהלים שאושרו - במקרה שלנו אנחנו הולכים להשתמש מנה קטלנית של חומר הרדמה isoflurane
3. ראשית, לרסס את הבטן עם אתנול לעשות חתך קטן עם זוג מספריים.
4. לקרוע את העור בשתי הידיים כדי לחשוף את הבטן וחותכים לפתוח את הצפק.
5. בעזרת מלקחיים, להרים את קרני הרחם ולאסוף אותם באמצעות מספריים בכל קצה דיסטלי. מניחים את הקרניים הרחם בצלחת פטרי מלאות PBS ומניחים על קרח. כמו כן, זכרו לשטוף מספר פעמים עם PBS לפני לבודד את השליה. כעת אנו יכולים לבודד את השליה.
6. עם שני מלקחיים, להתחיל בזהירות קילוף רקמת רירית הרחם סביב conceptuses העובר. אדם צריך להיזהר לא לנקב או בכל דרך אחרת לגרום נזק מבני העוברים, כמו זה יסבך צעדים לנתיחה שלאחר מכן.
7. מניחים את conceptuses מבודד בצלחת פטרי חדש עם PBS על הקרח וממשיכים עד שכל conceptuses שוחררו מן רירית הרחם.
8. העברה חד conceptus כדי בצלחת פטרי חדש עם PBS תחת מיקרוסקופ עם שני מלקחיים הקליפה decidua מן השליה. הסר כמה שיותר decidua ככל האפשר לתאים decidua יפריע ההשעיה תא בודד ו cytometry הזרימה. תנועה חלקה פילינג מתמשך מומלץ כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
9. חותכים את שק החלמון מן השליה בצומת בין שני איברים ומשוך בעדינות את שק החלמון וכלי vitelline מן השליה. יש להקפיד לא לשבש את הצלחת כוריוני של השליה, במיוחד עם עוברי מוקדם.
10. בזהירות מחזיק את צלחת כוריוני של השליה עם זוג אחד מלקחיים וחבל הטבור עם אחר, למשוך את חבל הטבור עובר המצורפת מן השליה.
11. הסר את תא עודף רקמה ענק בשולי השליה כדי למזער תא clumping במהלך הכנת ההשעיה תא בודד.
12. אסוף את השליה במיכל מתאים, כגון צינור פלקון 15 מ"ל, עם PBS 5% FCS ועל קרח. האם זה עבור כל השליות גזור.
13. בשלב זה, אתה יכול להמשיך עם הכנת מתלה יחיד תא עבור cytometry זרימה, מבחני פונקציונליים, כגון במבחנה תרבות או השתלה, או להכין השליה שלמה קיבעון רקמות לחסום קפוא קבוע הטבעה עבור אימונוהיסטוכימיה בסופו של דבר.

2. הכנת ההשעיה תא בודד של רקמות השליה

1. אנו כעת להראות לך איך ליצור השעיה תא יחיד מן השליה לניתוח FACS.
2. כדי להכין ההשעיה תא יחיד מן השליה, מכני דיסוציאציה האנזימטית נדרשת. ראשית להכין פתרון collagenase 0.1% ב-PBS עם FCS 10% ו 1% פתרון פניצילין / סטרפטומיצין.
3. הוספת נפח מתאים של תמיסת collagenase את השליות, תלוי כמה יש לך. נפח זה פעמיים את נפח השליה בין 5 מ"ל-2 מומלץ.
4. שימוש במחט 16-G מצויד על מזרק 5 מ"ל ל מכנית לשבש את רקמת ידי passaging הפתרון collagenase ואת השליה באמצעות מחט 3 פעמים. חזור עם מחט 18-G.
5. מניחים את הדוגמה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך 45 דקות.
6. לאחר דגירה 45 דקה, collagenase פתרון מעבר התא באמצעות מחט 20-G, ואת דגירה של 45 דקות נוספות, ב 37 ° C.
7. לאחר דגירה hr 1.5 הכולל, collagenase פתרון מעבר לתא באמצעות 22-G ו-G 25 מחטים 3 פעמים עם מחט אחד.
8. סינון דרך פילטר מדגם 50-מיקרומטר מחוברת צינורית חדש פלקון 15 מ"ל, לשטוף עם PBS FCS 5% ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 300 × ז
9. בשלב זה, יש לנו ההשעיה תא בודד מתאים לניתוח FACS או מבחני תפקודית.

3. רקמות קיבוע עבור סעיפים קפוא

1. מיד לאחר לבודד את השליה מעובר אחד, הם ממוקמים קר 1X PBS. בדרך כלל צלחת 96, עובד הכי טוב עבור השליות צעירים (E8.5-11.5), אך עם השליות מבוגרים, E12.5 ומעלה, צלחת 24 גם עשוי להיות יותר נוח.
2. השליה כל מועבר לתוך חדש מלא היטב עם paraformaldahyde 4% טרי או מופשר PFA. עבור E12.5 שליה, הרקמה מועברת היטב חדשה ביד, אבל עבור E10.5 תוכל להסיר את PBS בזהירות עם טפטפת ולהוסיף את PFA. חשוב השליה הוא שקוע לגמרי בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות, בהתאם לגיל וגודל הרקמה.
3. העברת רקמה לתוך סוכרוז 30%, או אם הרקמות קטנים מאוד שביר, לשאוב PFA ולהוסיף את סוכרוז ישירות. בשלב זה, השליות יהיה צף פתרון. בואו הרקמות ללון בבית 4 ° C.
4. לאחר השלב לילה סוכרוז 30%, רקמות צריך בסופו של דבר לשקוע לתחתית הבאר, מעיד על cryopreservation הנכון. הסר מחצית הפתרון סוכרוז להחליף את נפח עם אוקטובר והמקום רקמות בחזרה 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. זה מאפשר חדירה אוקטובר
5. העברת רקמות 100% עבור אוקטובר 1 שעה, לאחר מכן זה יכול להיות מוטבע.

4. הטבעת רקמות קבוע

1. תבניות פלסטיק עם תווית זיהוי רקמות המתאים (למשל עובש להראות).
2. משוך את רקמת מתוך הפתרון אוקטובר וחתך את השליה במחצית המכוונת על ידי השליה בצורת דיסק עם הצד חבל הטבור כלפי מטה בזהירות לחתוך עם סכין גילוח נקי ולוודא כדי להזיז את הלהב קדימה ואחורה לפני שחרור הלחץ על מנת להבטיח לחתוך אפילו. השליה היא בחצי כדי להשיג את הטוב ביותר prientation מאוחר יותר לדמיין את HSCs השליה.
3. מקום אחד השליה וחצי בתחתית התבנית עם סף לחתוך במגע עם המשטח התחתון של התבנית. חזור עם עובש חדש החצי השני. עבור E10.5 השליות, חצאים שניהם יוטלו לתוך תבנית זהה שימוש באותה טכניקה.
4. כאשר מוזג אוקטובר לתוך התבנית, זה יכול להיות קשה כדי לשמור על השליות בכיוון הנכון. אבטח את השליה במקום על ידי החזקת מחצית רקמת עם מלקחיים. לאט לאט שופכים פתרון אוקטובר לתבנית ולהימנע ייצור כל הבועות. עבור E10.5 השליות, להחזיק חצי רקמה על ידי מלקחיים והשאר חצי רקמות אחרות נגד הצד החיצוני של מלקחיים. לאט לאט שופכים פתרון אוקטובר כפי שתואר עבור E12.5 השליות.
5. לאחר עובש מלא אוקטובר, במהירות למקום עובש על קרח יבש, אוקטובר יהפוך פלאש לבן הקפאת רקמת
6. מניחים את התבנית לתוך שקית פלסטיק קטן המכיל Drierite ומיד חנות ב -80 ° C במקפיא.

Discussion

הפרוצדורות המתוארות פרוטוקול זה יאפשר בידוד הדמיה של רקמות השליה גזע hematopoietic ו ובתאים. לסיכום מקיף על תשואה מספר הסלולר צפוי של HSCs בשליה ושאר איברים hematopoietic העובר לאורך התפתחות העובר אנו מתייחסים Gekas, et al. 2005. עבור לוקליזציה של HSCs בפיתוח תאים hematopoietic אחרים השליה אנו מתייחסים רודוס...

Materials