העבודה של Z ו-Y וואנג יאנג התאפשרה על ידי מענק K02 AR051181 מ NIAMS / NIH, מענקי ניוון שרירים האגודה הארוורד לתאי גזע המכון Y וואנג. העבודה של Q ו-X זנג שו נתמכים על ידי מענק תוכנית הוענק מעבדת דימות אופטי מן בריגהאם ובית החולים לנשים. המחברים מבקשים להודות ליו וון מהמחלקה של הרדמה, BWH, עזרה טכנית בעבודה התא.

תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא הבידוד לווין <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הרדמה, שרירי הגפיים של העכברים הטרנסגניים GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) יוסרו. לאחר חיתוך לחתיכות קטנות, תאים הלוויין ניתק enzymatically הם דוגרים על ידי רקמת טחון עם פתרון 2% dispase collagenase שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את אנזים העיכול עם התקשורת גידול המכיל Ham-F-10 ו - 20% FBS, לנתק את השריר על ידי triturating חזר עם פיפטה פסטר. התאים מסוננים דרך מסננת תא (ø70-100μm) ו מצופה מכן על צלחת הלא מצופה שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את supernatant צלחת אותם על צלחת מצופה קולגן. חזור על צעד 1 שעה לאחר מכן לטהר את myoblasts. (טרום צלחת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת צלחת התאים בזמן. Myoblasts מטוהרים הסופי בתרבית בינוני המכיל Ham-F-10, 20% FBS, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין (מדיום גידול) בשעה 37 ° C עם CO2 5%, 95% אוויר. </li></ol> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולהרחיב את myoblasts העיקרי במדיום הגידול בתוספת של FGF הבסיסי של 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל בניסויים vivo, אנו מזריקים 5x10 5 תאים לכל שריר ת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קצירת myoblasts, אנו לנתק את התאים באמצעות 0.25% טריפסין / EDTA לשטוף אותם עם PBS פעמיים. המספרים תא נספרים עם hemocytometer לבין תאים resuspended ב HBSS בריכוז של 5x10 4 תאים / μl. התאים מרוכזים HBSS ממוקמות על קרח מוזרק בתוך שעה 1 אחרי האוסף. </li></ol> In vivo הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר עכברים MDX בגיל 4-6 שבועות הם שנרכשו ג&#39;קסון מעבדה ומתוחזק במתקן דיור בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כשבוע של התאמה לסביבה, העכברים הם מוכנים להיות מושתל עם תאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השתלת תאים, העכבר הוא מורדם באמצעות זריקה (IP) intraperitoneal תערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו Xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג). ואז השיער מסביב לאזור השריר ת&quot;א יוסר על ידי יישום נאיר ברגל ומחכים 30 שניות כדי למחוק אותו עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סמן העכבר נמצא עדיין תחת הרדמה, 5x10 5 תאים HBSS 10μl מוזרקים לאט 3 נקודות באמצעות מחט מד 30 לתוך כל שריר ת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלב 4, העכבר ניתן הדמיה באופן קבוע על ידי in vivo פלואורסצנציה הדמיה. פלואורסצנציה הדמיה תחנת NightOwl LB981 (ברטולד Technologies, Inc), מצויד במצלמה גבוה תשלום מצמידים רגיש, משמש כדי להשיג תמונות מן לעכב את הרגליים של העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום in vivo הדמיה, אנחנו הראשונים לבדוק את לצמיחה מחודשת שיער על השריר ת&quot;א. אם יש צורך, אנחנו נאיר להחיל מחדש כדי להסיר את השיער כפי שתואר לעיל, לאחר הרדמה העכבר בתערובת של קטמין ו Xylazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סמן העכבר נמצא תחת הרדמה, אנחנו במקום העכבר אפרקדן על פיסת נייר לא פלורסנט שחור (שחור נייר Artagain מ Strathmore). כדי לחשוף באופן מלא את השריר ת&quot;א הדמיה טוב יותר, אנו הקלטת הכפות האחוריות אל הנייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו שמים את העכבר בתא הדמיה עמדת רגל אחורית להיות צילמו במרכז שדה הראייה של המצלמה. אנחנו הראשונים לעבור את מסנן הפליטה לצלם המסורתית אפורים בקנה מידה הצילום של הרגל עם זמן חשיפה של 5 שניות. להתקין מחדש את המיקום של העכבר למקד את המצלמה במידת הצורך. הפרמטרים הדמיה כולל זמן החשיפה (1,250 ms), גובה הדגימה (0.9 ס&quot;מ) וכו &#39;נשמרים קבוע בתהליך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מכן לעבור במסנן פליטה מתאים אורך הגל הירוק חלבון פלואורסצנטי. אנחנו לוקחים תמונה פלואורסצנציה עם זמן חשיפה של 1,250 ms ומספר binning של 1. לאחר הדמיה, עכבר נמחקת תא הדמיה לכלוב לחכות להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח, נעביר האזור של עניין (ROI) על אותות ניאון כדי למדוד את העוצמה שלהם במונחים של פוטונים בשנייה. אנחנו גם למדוד את גודל ההחזר על ההשקעה במונחים של מספר הפיקסלים כערך אחר כימות. הניסויים הדמיה ניתן לחזור כל שבוע או בתדירות גבוהה יותר על פני כמה חודשים, במידת הצורך, לרכוש נתונים האורך. </li></ol> בתום הניסויים, העכבר הוא להרדים את השריר ת&quot;א שנקטפו לניתוח היסטולוגיה.

<ol>
	<li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo.">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li><li>Green, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography.">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li><li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models.">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li><li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography.">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li><li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers.">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 .</li><li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths.">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li><li>Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+of+muscle+regeneration+by+transplanted+eGFP-labeled+myoblasts.">In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts.</a> , (1985).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins.">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li><li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy:+I.+A+histological,+morphometric+and+biochemical+investigation.">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li><li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells.">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li><li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne's+muscular+dystrophy.">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li><li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+current+approaches+and+future+directions.">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li><li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts.">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li><li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells,+bone+marrow+cells,+and+hematopoietic+stem+cells.">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li><li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient,+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles.">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li></ol>

אנו מקימים פלטפורמה אמינה ויציבה הדמיה למעקב אחר הקרינה על התאים המושתלים שכותרתו בשריר השלד מארח במחקר זה. GFP-שכותרתו myoblasts מ-GFP עכבר מהונדס מייצג סוג של בתאי גזע בוגרים שיהיו מועמדים טיפול בתא בעתיד. מניפולציה קבוע כולל מספר התאים, הזרקת תאים, רקע ברור, עמדה הדמיה פרמטר מכונת חשוב להשגת תמונה באיכות גבוהה במיוחד עבור ניתוח כמותי. פלואורסצנטי הדמיה יש יישומים רבים במחקר ביו כפי שהוא אינו פולשני, קל לשימוש, ויש לו קצב העברת נתונים גבוה. בנוסף דימות פלואורסצנטי יכול לספק מדידה כמותית המבוססת על ספירת פוטון, אם כי בשל הנחתה פיזור, קליטה, האור לא יכול לחדור מרחק גדול רקמות, המהווה חיסרון של השיטה. מאמצים כבר בעיצומן להשתמש כתב אדום או קרוב אינפרא אדום כדי להגדיל את עומק החדירה של האור. יתרון נוסף של דימות פלואורסצנטי היא שזה לתרגום למרפאות אם הכתב ניאון ספציפיים מאושר לשימוש האדם. לעומת MRI, CT, ו PET, פלואורסצנציה הדמיה יש גמישות גבוהה כפי שהוא אינו דורש חומרה יקרה וסוכני הדמיה. דוגמה אחת היא הקרינה מבוססי אנדוסקופ מיקרו אנדוסקופ שנוצלו במרפאות. על ידי שילוב של דימות פלואורסצנטי עם שיטות אחרות, אנו מצפים להשיג את היכולת לרכוש גם מידע אנטומי ותפקודי על התהליכים הביולוגיים הבסיסיים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NightOwl LB981</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Berthold Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tracking dynamics of muscle engraftment in small animals by in vivo fluorescent imaging

Dystrophies שרירים הן קבוצה של מחלות שרירים ניוונית המאופיינת אובדן הדרגתי של בתאי שריר התכווצות. נכון לעכשיו, אין טיפול מרפא זמין. התפתחויות אחרונות ביולוגיה של התא גזע יצרו תקוות חדשות לפיתוח טיפולים יעילים תא מבוסס לטיפול במחלות אלה. השתלה של סוגים שונים של בתאי גזע שכותרתו עם חלבוני ניאון לתוך שרירי במודלים של בעלי חיים dystrophic נעשה שימוש רחב בתחום. טכניקה לא פולשנית עם יכולת לעקוב אחר גורל התא המושתל longitudinally יכולים להמשיך ביכולת שלנו להעריך engraftment שריר על ידי התאים המושתלים באופן מדויק יותר וביעילות. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים כי in vivo פלואורסצנציה הדמיה היא שיטה רגישה ואמינה למעקב אחר המושתלים GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) שכותרתו תאים עכבר שרירי השלד. למרות החשש על רקע עקב השימוש של אור חיצוני הכרחי עירור של חלבון פלואורסצנטי, מצאנו כי באמצעות העכבר או עירום או ביטול השיער עם חומרים כימיים להסרת שיער רב של בעיה זו מתבטלת. שימוש במצלמת CCD, האות ניאון ניתן לאתר את השריר הקדמי (ת&quot;א) tibialis לאחר הזרקה של 5 x 10 5 תאים משני העכברים הטרנסגניים GFP או eGFP transduced תרבות myoblast. עבור השרירים השטחיים יותר כגון extensor digitorum longus (אדי), הזרקה של תאים פחות מייצר אות לזיהוי. עוצמת האות ניתן למדוד לכמת כמו מספר של פוטונים הנפלטים בשנייה באזור של עניין (ROI). מאז רכשה את התמונות להראות גבולות ברורים התוחם את האזור engrafted, בגודל של ההחזר על ההשקעה ניתן למדוד גם. אם הרגליים ממוקמות באופן עקבי כל הזמן, השינויים המספר הכולל של פוטונים לשנייה לכל שרירים בגודל של ההחזר על ההשקעה משקפים את השינויים במספר התאים engrafted ואת גודל השטח engrafted. לכן השינויים בשריר אותו לאורך זמן הם לכימות. In vivo טכניקת דימות פלואורסצנטי שימש בעיקר כדי לעקוב אחר הצמיחה של תאים tumorogenic, המחקר שלנו מראה כי זהו כלי רב עוצמה המאפשר לנו לעקוב אחר גורלם של בתאי גזע המושתלים.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging at JoVE.com

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

אנו מתארים<em&gt; In vivo</em&gt; פלואורסצנציה הדמיה פרוטוקול לפקח התחדשות שריר על ידי ה-GFP שכותרתו myoblasts לאחר ההשתלה לתוך שרירי השלד של עכברים בריאים הן dystrophic. פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד התחדשות שריר על ידי השתלה של סוגים אחרים של תאים בתנאים שרירים אחרים גם כן.

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

tracking-dynamics-muscle-engraftment-small-animals-vivo-fluorescent

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

9.7K Views.  Brigham and Woman's Hospital. אנו מתארים In vivo פלואורסצנציה הדמיה פרוטוקול לפקח התחדשות שריר על ידי ה-GFP שכותרתו myoblasts לאחר ההשתלה לתוך שרירי השלד של עכברים בריאים הן dystrophic. פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד התחדשות שריר על ידי השתלה של סוגים אחרים של תאים בתנאים שרירים אחרים גם כן.

Video: Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...