אשכולות קולטן נמצא בכל מקום ולעתים קרובות הכרחי עבור איתות הפעלה מפל. עם זאת, שיטות מעטות זמינות למדידת מידת הקיבוץ באשכולות. אנו משתמשים פלואורסצנטיות השתקפות פנימית מוחלטת, מיקרוסקופיה TIRF, כדי לעקוב אחר דיפוזיה של מולקולות FGFR1-mEGFP בממברנה פלזמה של תאים חיים.
לאחר מכן אנו מיישמים בהירות מספר, ניתוח N&B, כדי לתאר את הדינמיקה של אשכולות קולטן מגורה. TIRF אידיאלי להדמיה זמנית מהירה של אירועים מולקולריים המתרחשים ליד פני התא, בעוד N&B קובע את המצב האוליגומרי הממוצע של מולקולות פלואורסצנטיות בהתבסס על המקום שבו דיפוזיה פנימה ובחוץ את נפח התאורה של המיקרוסקופ. אכן, זהו כלי לחיבור ארגון הזמן המרחבי של הקולטנים על פני התא שבו הם מאותתים.
N&B זקוקה רק לגישה למיקרוסקופ עם מודול רכישה מהירה. אתה יכול לנתח שטח גדול של תאים חיים שיש רק את הידע הבסיסי של שיטות תנודות פלואורסצנטיות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבונים ויוצרים עמעום או אשכולות והוא יכול להיות מתויג stoichiometrically עם צבע פלואורסצנטי.
אם החלבונים נמצאים בתאים תאיים, סוגים אחרים של מיקרוסקופים משמשים לרכישת התמונות. חשוב להכין מבנה המבטא את הצורה המונומרית של הפלואורופור למדידה בתנאים ניסיוניים את הבהירות המונומרית הטהורה כפקד. ביום הראשון, זרע תאי HeLa ב 1.5 מיליליטר של מדיום שלם בריכוז של 100, 000 עד 200, 000 תאים למיליליטר במנות תחתית זכוכית.
זרעים 6-8 משכפלים כלים, ו דגירה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. ביום השני או השלישי, התאים הגיעו תת-מודע. מוסיפים מדיום נטול סרום עם חלבון פלסמיד למחצית מהמנות, ומוסיפים פלסמידים התייחסות עם מונומר ועמעום למחצית השנייה של הכלים כדי לשנות את התאים.
לאחר יום אחד, בדוק כי התאים המבוצפים דבוקים לתחתית הכלים ואת קרום התא הוא פלואורסצנטי. השלך כלים עם תאים מגודלים או עם פלואורסצנטיות נמוכה מאוד. ארבע שעות לפני הניסוי, להפעיל את חממת הטמפרטורה של המיקרוסקופ ב 37 מעלות צלזיוס.
הפעל את המיקרוסקופ, המחשבים והמצלמות, והמתן עד שהמצלמות יגיעו לטמפרטורת העבודה הנכונה של מינוס 75 מעלות צלזיוס. מניחים טיפה קטנה של שמן על העדשה האובייקטיבית. שים צלחת מדגם לתוך החממה של המיקרוסקופ, ולסגור את הדלתות של החממה כדי לאפשר את הטמפרטורה של המנה לצייד במשך 10 דקות.
הפעל את מנורת האפיפלואורסצנטיות ואת לייזר 488 ננומטר. בחר את מצב ניגודיות epifluorescence כדי לחקור את המדגם, חיפוש תא להתמקד מן העדשה העין. בחר את המסנן המתאים לאיסוף הפליטה הירוקה דרך מצלמת המיקרוסקופ עם bandpass Ex 490/20 500 ו bandpass Em 525/50 או דומה.
עבור מן העין לדוח מצלמת במצב epifluorescence. מקד את המוקד ושנה למצב TIRF. לאחר מכן הפעל את היישור האוטומטי בהתאם להוראות המיקרוסקופ TIRF.
בחרו עומק תאורה מתאים, ומטבו את כיוון השדה. עבור למצלמה שנייה. הגדר אזור מעניין של 256 על 256 פיקסלים לפחות.
הגדר את החשיפה לאלפית שנייה אחת ואת הרווח EM ל 1, 000. כוונן את כוח הלייזר ל-0.5 מילי-וואט. יש צורך לקבל קצת מידע על מקדם דיפוזיה של החלבון כי זמן החשיפה חייב להיות קצר יותר מאשר הזמן הממוצע בילה על ידי מולקולות פלואורסצנטי בנפח הזוהר.
הפעל רצף ניסיון ראשון בתנאים ראשוניים, והערך אות לרעש בערך. התנאים מקובלים באות לרעש השווה לשניים עד שלושה או יותר כפי שנמדד בסדרה הראשונה. לאחר מכן השתמשו במ המחוון של מערכת פיצול הפליטה המחברת בין מצלמה מספר שתיים למיקרוסקופ להסוות צד של התמונה.
בחר באפשרות השמירה האוטומטית של קובץ המצלמה. התחל את הרכישה של סדרת התמונות עבור מינימום של 700 מסגרות ביחס אות לרעש מינימלי של שתיים. מבלי להוציא את המנה מהמיקרוסקופ, מוסיפים את הליגנד.
בחר תא עם קרום פלואורסצנטי בהיר, והתחל במהירות את סדרת הפעם הראשונה של הריצה הקינטית. חפש בתא שני ורכוש את נקודת הזמן השנייה של הקינטיקה. לכוד תא חדש עבור כל נקודת זמן של הריצה הקינטית.
עבור כל מנה חדשה, חזור על היישור של קו הלייזר ואופטימיזציה של תאורת TIRF. עכשיו להמיר ולשמור את קבצי התמונה שנרכשו עם תוכנת המצלמה כמו קבצי tif. יבא קבצי tif ב שגרת תוכנת הניתוח על-ידי הפעלת האינטרפארמה הגרפית של N&B MATLAB.
השלך סדרות שעבורן פרופיל האינטנסיביות הממוצע מציג יותר מ- 10%photobleaching וסדרות שבהן היה עיוות או תרגום ברור של קרום התא במהלך הרכישה. חיתוך מסגרות שכנראה אינן בפוקוס. שמור לניתוח רק סדרות עם לפחות 500 מסגרות זמן.
תחילה לקבוע את הפרמטרים המצלמה. הפעל את מצלמת הכיול השגרתית. בחר אזור של לפחות 20 על 50 פיקסלים באזור רעש הגלאי.
בתדירות יומן הרישום לעומת התוויית רמה דיגיטלית, הזז את הסמן האדום ליניארי כדי לתחום את הגאוסיאני בחלק ליניארי של העקומה. הפעל את מקש B. החל binning מינימלי של 2.2 כדי להפחית את פיזור הנתונים כדי ליצור את היסטוגרמה B-I.
השתמש בסמן הריבועי האטרטיבי כדי לבדוק את היסטוגרמת B-I. בחר ROI מרובע עבור הניתוח והפיק את מפת B של ערך ההשקעה שנבחר. לאחר מכן שמרו את קובץ ASCII של ערכי B המשויכים לבחירה.
יבא את ה- ASCII בתוכנת גרפיקה כדי לחשב את התפלגות התדרים של הנתונים ולקבל את ערך ה- B הממוצע פלוס או מינוס S.E.Apply משוואת האפסילון כדי להפיק את הבהירות הממוצעת עבור כל תא בכל נקודת זמן של הריצה הקינטית. לנרמל את הנתונים על פי משוואת הנורמליזציה, כאשר B't הוא ערך B הממוצע שנמדד בזמן t לאחר חיבור ליגנד ו- B'0 הוא ערך ה- B הממוצע הנמדד באותה עת שווה לאפס, שהוא 10 עד 20 שניות לאחר ligand additino. התווה את הבהירות הממוצעת המנורמלת לעומת זמן הרכישה כדי לבנות את הריצה הקינטית.
במחקר זה, תוצאות מייצגות משני תאי HeLa באותה מנה המבטאת mEGFP-FGR1 שנתפסו בזמן אפס ושבע, לאחר תוספת של 20 ננוגרם למיליליטר של FGF2, מוצגים כאן. בהשוואה למבנהי הייחוס, GPI-mEGFP ו- GPI-mEGFP-mEGFP-mEGFP dimer, רצף הניתוח כולו מציג את העוצמה הממוצעת של סדרת הזמן. עלילה של כל ערכי B.
היסטוגרמה בי-איי. B-מפה של ROI שנבחר. והיסטוגרמת הפצת B הקשורה.
לאחר גירוי עם 20 ננוגרם למיליליטר של FGF2, ריצות קינטיות מייצגות המציגות את הבהירות הממוצעת כפונקציית הזמן מתארת את התהליך האיטי של עמעום שנמשך מספר דקות על פני התא. כאשר מגורה עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של NCAM-Fc, הפרופיל הקינטי חושף מעברים מהירים ומ מחזוריים של הקולטן בת תערובות אוליגומריות, אשר מגיע גם לערכי בהירות מעל זה של העמום. ערך ממוצע מנורמל של שלושה נצפה שוב ושוב.
חשוב למזער את הגרסאות הנוספות ללא תנודות מולקולריות והלבנה. ותאים חייבים להיות דבקים היטב בצלחת התחתונה מזכוכית, לא מגודל, ולא נערם. אם אנו מעוניינים בחלבון המתפזר מהר יותר בתוך תאים תאיים, אנו יכולים ליישם אפס פעמים מהירות יותר ולהשתמש בסריקה על מיקרוסקופים מוקדיים או מולטיפוטונים כדי דימוי בתוך התא.
עם הגישה שלנו, אנו למזער את ההשפעות המזיקות של photobleaching כאשר אנו רוצים לחקור את הדינמיקה של אירועים כגון עמעום. אירועים אלה שולטים במגוון תגובות תאיות וקשה מאוד להוכיח אותם בתאים חיים עם טכניקות אחרות.
