1. המדעית Thermo Solaris עיצוב qPCR Assay אלגוריתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האלגוריתם משמש בעיצוב של Solaris qPCR בדיקה / פריימר זוגות אני מתאים את של כל רכיב ובכך לאפשר תנאים אופניים אוניברסלית. התאגדות של מג&quot;ב, או קטין מחייב חריץ, מחצית בתוך החללית מגבירה את אני ומאפשרת בדיקות קצרות להיות מיועד assay גמישות רבה יותר וביצועים. כפי ששמה מרמז, MGBs הם סוג של אנטיביוטיקה שיכולה להשתלב חריץ הקטין של סליל ה-DNA. MGBs המצורפים בסוף 3 או 5 של בדיקה דנ&quot;א. ב פתרון, פלואורסצנציה הכתב FAM של החללית הוא הרווה ידי מרווה Eclipse Dark. כאשר החללית נקשר ברצף היעד, וכתוצאה מכך לשנות קונפורמציה של בדיקה 3-D מאפשר אות ניאון חזק. עקידת לחקור את רצף ה-DNA היעד הוא התייצב על ידי מג&quot;ב, אשר מאפשר את השימוש, בדיקות ספציפיות מאוד קצרים, תוך שמירה על טמפרטורת ההתכה מתאים PCR. לכן, זיהוי אות מתרחשת בשלב חישול של הגברה היעד. במהלך שלב ההארכה, בדיקה מג&quot;ב disassociates ואת הקרינה הוא הרווה שוב. בגלל החללית disassociates, זה לא משפיע על יעילות ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפיין נוסף של האלגוריתם Solaris הוא השימוש Superbases. Superbases משתנים בסיסים שיש להם יכולות משופרות מחייב כדי לשפר את היציבות של AT אג&quot;ח לחסל GG עצמית העמותה רצפים עשירים גואנן. יתר על כן, הם אינם סמוכים להרוות fluorophores מצורף בתחנה הסופית 5. בסיסים אלה ממוקמים באופן סלקטיבי, על פי האלגוריתם, כדי להרחיב את הזמינות של רצפי היעד. זה מאפשר להשתמש רצפים, כגון אזורים GC עשיר, שאחרת היה נמנע בעיצוב primers ו בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, את האלגוריתם Solaris משלבת אזורים אקסון צומת פורש באתר היעד. זה מגדיל סגוליות ידי הימנעות הגברה של הדנ&quot;א הגנומי מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין, האלגוריתם מזהה גם רצף קונצנזוס של כל גרסאות אחוי ידוע, כך שכל מכוסים על ידי בדיקה יחיד / קבוצה פריימר. לכן, רק אחד assay דרוש גן מסוים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, qPCR עיצוב Solaris אלגוריתם Assay מנצל פרמטרים מחמירים מאוד שיקולים עיצוב קריטי כולל תוכן אורך GC, אני, והוא משתרע של נוקלאוטידים הומוגנית. רצפים וכתוצאה מכך הם תפציץ ניתח עבור סגוליות 3 באמצעות מאגרי מידע שונים: גנומי, תמליל, ו pseudogene. </li></ol> 2. קבלת Solaris ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את המתאים Solaris ריאגנטים, בקר <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / Solaris</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם באתר לחץ על &quot;חיפוש GENEius המוצר&quot;. כדי לעבור ישירות לחפש את המוצר GENEius, ללכת <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בתיבת החיפוש חקירה ולבחור את האורגניזם היעד המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיפוש מוצר GENEius יכול לעבד רבים מזהים גנים שונים. הנה, הזן אחד הציע מונחי חיפוש כדי למצוא את הגן של עניין, לרבות שופט Seq ההצטרפות, מזהה ג&#39;ין, סמל ג&#39;ין, תיאור הגן, את מזהה סנגר או מספר ההצטרפות, או מספר קטלוג. לאחר מכן, לחץ על &quot;חיפוש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הגן של עניין ולחץ על &quot;בחר&quot; בצד שמאל. פעולה זו תפתח חלון המציג את המוצרים השונים Thermo Scientific זמין עבור הגן של עניין. תחת &quot;מוצרים&quot; בחר את &quot;qPCR איתור&quot; Tab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;Assay Gene Expression סולאריס&quot; הכותרת, תוכלו לראות את אחד מעוצב בצורה אופטימלית Solaris בדיקה / assay פריימר. זה assay אחד לא לכסות את כל גרסאות אחוי ידוע היעד הגן שלך. בחרו את הכמות הרצויה. הם זמינים 100, 200, 400, ו 1000 X 25 תגובות μl (אם assay מזוהה עשה סדר, אל, את גודל חבילת 100 לא יהיה זמין). לחץ על &quot;הוסף לסל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, בחר את תערובת אב מתאים Cycler התרמית אשר ישמשו. כדי לקבוע איזו תערובת מאסטר יעבדו הכי טוב עם המכשיר זמין, לחץ על &quot;גלה אילו מיקס מאסטר עובד הכי טוב עם Cycler PCR שלך!&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את Cycler qPCR אשר ישמשו בתפריט כדי לקבוע אילו לערבב לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל חלון החיפוש המוצר GENEius, ובחר לערבב מאסטר המתאים. תמהיל המאסטר מגיע 100, 200, 400, ו 1000 גדלים התגובה. לחץ על &quot;הוסף לסל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנים התייחסות המוצעות cDNA Verso ערכות סינתזה יכול להיות גם הורה לניתוח qRT-PCR להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר qPCR ריאגנטים Solaris להגיע, לאחסן אותם ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. ריאגנטים הבאות צריכות להתקבל: פתרון 20X המכיל שני primers סיפק 800 nM כל אחד בדיקה גנים ספציפיים הניתנים 200 ננומטר, sequence מידע עבור בדיקה והן primers, ו-Solaris הביטוי qPCR ג&#39;ין מיקס מאסטר בריכוז 2X. Solaris הביטוי qPCR מבחני ג&#39;ין יציבים עבור מינימום של 12 חודשים. הימנע להקפיא חזר הפשרה. </li></ol> 3. qPCR ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין פרוטוקול qPCR עם cDNA. RNA סה&quot;כ צריך להיות חילוץ באמצעות שיטה טור ספין. מדעי Thermo ערכת cDNA Verso סינתזה מומלץ שעתוק לאחור כדי ליצור cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו qPCR על ידי הפשרת primers, בדיקות, ומערבבים מאסטר על הקרח. כמו כן יש על יד מים PCR כיתה ו אטום צלחות qPCR לבן, אשר יכולים לשפר את הרגישות של ה-PCR בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמהיל מאסטר מכיל את כל הרכיבים בפעם PCR אמיתי כולל: פולימראז Thermo-Start 1) ה-DNA, גרסה חמה ההתחלה של פולימראז הדנ&quot;א Thermoprime. סוג זה של פולימראז משמש למניעת הלא ספציפית הגברה במהלך התגובה, להגדיר דורש שלב ההפעלה על 95 מעלות צלזיוס 15 דקות. 2) dNTPs בתמהיל Solaris הורים, dTTP מחליף dUTP כדי למקסם את היעילות הגברה 3) המאגר התגובה קנייניות, מותאם לעבודה עם Solaris פריימר / מבחני בדיקה. זה חיץ תגובה מכיל צבע כחול כדי להגביר את הניגודיות בין מגיב ופלסטיק. 4) רוקס, אם המכשיר שלך דורש qPCR רוקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פתרונות יש להפשיר, לערבב ידי מצליף הצינור (לא מערבולת). ספין אותם כדי למנוע אובדן של מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין 15 מ&quot;ל סטרילי צינור פלקון להגדיר את תערובת תגובה עבור הגן של עניין, ועוד אחד של הגן התייחסות, קנה המידה בהתאם למספר דוגמאות. הכינו מספיק כאלה כי שלושה משכפל יכול להיות מוכן מדגם זה, כולל שליטה אין תבנית (NTC) דגימות עקומת רגיל, אם שיטת עקומת סטנדרט ישמש לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 96 היטב, לערבב את הדברים הבאים: 5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 0.5 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרונה, פעם cDNA הוא הוסיף יהיה 25 μL. עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 384 לערבב היטב את הדברים הבאים: 12.5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 1.25 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרון, לאחר cDNA הוא הוסיף יהיה 10 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor רב ערוצי, להעביר את תערובת מאסטר בארות המתאים הצלחת. צבע כחול הכלולים לערבב האב יסייע להתקדמות pipetting מעקב על הצלחות הלבנות. לאחר מכן יש להוסיף את תבנית 1-5 cDNA μL (עבור צלחת 96 באר) או 1-2 μL של תבנית cDNA (עבור 384 צלחת היטב). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. מניחים את צלחת בצנטריפוגה ספין למטה כדי להסיר בועות, כמו אלה יפריע בקריאה פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית Cycler תרמי: האנזים חייב להיות מופעל עם 95 מעלות צלזיוס 15 דקות (1 מחזור). ואז 40 מחזורים של 95 ° C, denaturation למשך 15 שניות, חישול והסיומת ב 60 ° C למשך 60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת המכשיר qPCR. הפעל את התוכנית. </li></ol> נציג qPCR התוצאות באמצעות Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מבחני Solaris לתת זיהוי אמין גם בריכוזים נמוכים מאוד קלט, כמו להישפט על ידי היעילות PCR וערכים r2. עשר של פי 10 דילולים של cDNA מסונתז מתוך רצף RNA סינתטי amplicon או amplicon רצף הדנ&quot;א היה מוגבר על מכשיר ABI 7900HT באמצעות Solaris הביטוי qPCR Assay ג&#39;ין עבור F2RL1 או CDC20, בהתאמה. יומן בהיקף העיקולים הגברה ועקומות תקן מוצגים יחד עם הביצועים של כל assay כולל יעילות, ערך r2, טווח דינמי מתוך 10 LOG10 דילולים, ואת הגבול התחתון של זיהוי. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מבחני Solaris לתת תוצאות עקביות אפילו בין חוקרים במעבדות שונות. siRNAs מיקוד ALDOA ו PPIB, כמו גם בקרת Non-מיקוד (NTC), היו transfected לתאי הלה ב nM 100, 10, 1 ו 0.1 ריכוזי הסופי. תאים נקצרו ו-RNA בודד הכולל 48 שעות שלאחר הטיפול. cDNA היה מסונתז באמצעות Thermo Verso מדעי cDNA ערכת סינתזה. Aliquot של cDNA היה מוגבר בשתי מעבדות מופרדים גיאוגרפית באמצעות Solaris הביטוי qPCR מבחני ג&#39;ין לגילוי ALDOA, PPIB ו GAPDH על LightCycler רוש 480 (384 גם) פלטפורמה. מציאה חושבה בשיטת ΔΔCq (מנורמל ל GAPDH התייחסות גנים NTC שטופלו בתאים). רמות אותו מציאה היו הפגינו הן מטרות גנים בין שני החוקרים בשני האתרים.

המחברים של מאמר זה הינם עובדים של Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris מבחני qPCR לספק שיטה פשוטה, משופרת עבור ביצוע ניתוח qPCR. באמצעות אלגוריתם חומרה גבוהה, שילוב מג&quot;ב טכנולוגיה Superbases, אלה קבוצות פריימר ועל בדיקה למקסם את נאמנות וחוסנם של ניסויים qPCR. אחת פריימר ולהגדיר בדיקה מזהה כל גרסאות אחוי ידוע של גן מסוים. אתר היעד, במידת האפשר, כולל אזורים אקסון פורש, על מנת להבטיח כי הדנ&quot;א הגנומי לא מוגבר. תכונות אלה מאפשרות להריץ בו זמנית מספר רב של דגימות, מקטינים מאד את משך הזמן הדרוש כדי לבצע ניסויים מורכבים. מאז לערבב הראשי הוא כחול, אפשר להשתמש בצלחות אטום לבן, לשפר את הרגישות של qPCR, מבלי לאבד את תחושת pipetting. Taken הכל ביחד, את התכונות העיצוב של Assay Solaris qPCR להפוך את זה assay assay qPCR רומן פשוט, אך בעל ביצועים גבוהים, כי הוא גם ספציפי וחזק.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

QPCR הביטוי Solaris Assay ג&#39;ין הוא סוג חדש של קבוצת פריימר / בדיקה, שנועדה לפשט את תהליך qPCR תוך שמירה על רגישות ודיוק של assay. פריימר / בדיקה אלה סטים מוגדרים מראש שנועדו% 98&gt; של הגנום האנושי עכבר ושיפורים תכונה משמעותית מטכנולוגיות זמין קודם לכן. שיפורים אלה התאפשרו בזכות אלגוריתם רומן העיצוב, שפותחו על ידי מומחים Thermo Scientific ביואינפורמטיקה. מספר תכונות נוחות שולבו Assay Solaris qPCR כדי לייעל את תהליך ביצוע כמותי בזמן אמת PCR. ראשית, פרוטוקול דומה חלופות מועסקים בדרך כלל, ולכן השיטות במהלך qPCR צפויים להיות מוכרים. שנית, תמהיל הראשי הוא כחול, מה שהופך את ההגדרה תגובות qPCR קל יותר לעקוב. שלישית, התנאים רכיבה תרמית זהים עבור כל מבחני (גנים), כך שניתן להפעיל דגימות רבות בזמן וצמצום הפוטנציאל לטעויות. לבסוף, בדיקה ורצף מידע פריימר מסופקים, לפשט את תהליך הפרסום. כאן, אנו מדגימים כיצד להשיג את ריאגנטים המתאימים Solaris השימוש במוצר GENEius החיפוש תכונה למצוא באתר האינטרנט של ההזמנה (www.thermo.com / Solaris) ואת אופן השימוש ריאגנטים Solaris לביצוע qPCR בשיטה עקומה סטנדרטית.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

QPCR הביטוי Solaris מבחני ג&#39;ין הם הרומן תוכנן מראש פריימר / בדיקה qPCR שילובים שנועדו לפשט את תהליך qPCR מבלי להקריב את הספציפיות וחוסנם של assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

49.6K Views.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...