Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. לדוגמא חלבון והצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא הכנה: לטהר את החלבונים של עניין ולוודא שכל אגרגטים יוסרו, על ידי הזרקת החלבון לפני הניסוי על עמודת ג&#39;ל סינון או על ידי ultracentrifugation (בדרך כלל 10 דקות ב 100,000 XG הוא מספיק). הערה: למרות הכנות רצויות, טהורות מאוד חלבון אינן חובה. SPR שמש בהצלחה עם purifications פחות מ-מושלם ואפילו עם סך 8,9 תמצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיץ: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ של הניסוי (שמכונה &quot;חיץ ריצה&quot;, או RB). לפרוטוקול מתואר כאן, להשתמש 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl ו 0.05% (w / v) DDM (β-D-maltoside n-Dodecyl). זכור כי הבחירה של הרכב חיץ ניתן לשנות בקלות על פי השיטה למדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את כל המאגרים ודגימות חלבון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים. ודא מראש כי מסנני חלבוניםתואם. באופן כללי, פלטפורמות SPR שווקו לאחרונה להכיל דה-גאסר באונליין; אם זה לא המקרה, דה-גז המאגרים לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze הלילה או לדלל את הדגימות נגד RB, כדי למנוע חוסר התאמה חיץ. דיאליזה (או כל שיטה אחרת של חילופי חיץ) מומלצת במיוחד בעת שימוש בכימיקלים של צמיגות גבוהה (למשל, סוכרוז, גליצרול, DMSO). לפני חיבור בקבוק RB לכניסת המשאבה לשמור בצד 10 ​​מיליליטר של RB בצינור נפרד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות יגנד מרוכזות לRB לריכוז סופי של ~ 20 מיקרוגרם / מיליליטר. ככלל אצבע, לקיבוע יגנד יציב, להשתמש בריכוזים נמוכים יגנד עם זריקות כבר בזרימה נמוכה, בניגוד לריכוזים גבוהים, תזרים גבוה וזריקות קצרות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את אנליטי לRB לריכוז הרצוי. בדרך כלל, לבדוק את הטווח של ריכוזים למערכת של זיקה לא ידועה מ10 מיקרומטר עד 10 ננומטר בדילולים של פי עשרה. תמיד להתחילעם הריכוזים הנמוכים הראשון. </li></ol> 2. שבב חיישן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת שבב: השתמש בחומצת nitrilotriacetic (נת&quot;ע) שבב בשילוב מתאים ללכידת חלבונים עם תג אוליגו-היסטידין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשבב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת השימוש בשבב חדש, לקחת את השבב החוצה מהנדן, לשטוף בעדינות עם מים מזוקקים כפולים (DDW), לייבש את הנוזלים שנותרו בזהירות באמצעות מגבים עדינים, ולוודא שלא לגעת במשטח שכבת זהב. מניחים את השבב בחזרה לנדנה בכיוון הנכון (ההכנסה היא חלק כאשר השבב ממוקם כראוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שימוש חוזר שבב, להוציא את השבב מאוחסן מהחיץ, לשטוף היטב עם DDW ויבש בעדינות כאמור לעיל, והנח לנדנה המקורי. הערה: ההצטברות של זבל חומר שאינו ספציפי על השבב יכולה להשפיע על &quot;הכדאיות&quot; שלה. זה יכול להיות במעקב על ידי השוואת RUS לפני קיבוע יגנד ופוסט הפשטה. למרות מדידות רבות יכולות להיותנעשה שימוש באותו השבב NiNTA, הנושא של אריכות הימים שלו הוא לא &quot;ברור&quot; ומשתנה מאוד בין שבבים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עגינה שבב: פתח את דלת שבב חיישן ולמקם את השבב בנדנה. בעת שימוש בשבב חדש, המספר הסידורי של קלט השבב לשמור תיעוד שימוש. סגור את הדלת ולחץ על &#39;שבב מזח &quot;. </li></ol> 3. הגדרות טמפרטורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את טמפרטורת תא שבב 25 ° C (או בטמפרטורת הניסוי המועדפת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להגדיר את תא הדגימות עד 7 מעלות צלזיוס כדי לשמור על החלבונים יציבים לאורך כל הניסוי. </li></ol> 4. פתרונות לטעינה ושלילה הכן את הפתרונות לטעינה וההפשטה הבאים: 0.5 מ&quot;מ NiCl 2 בRB, 350 mM EDTA בRB (להוסיף חומר ניקוי לפתרון EDTA לריכוז סופי כמו בRB), 0.25% SDS בH 2 O, ו -100 מ&quot;מ HCl בH 2 O. בעת שימוש באמבטית מיקרו צנטריפוגותes ולא SPR צינורות מיועדים, אל תשכח לנתק את הכובעים של הצינורות. 5. ראש Instrument SPR עם RB 6. התחל ניו הפעלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה שישמש במהלך הניסוי. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הזרימה 50 μl / min. הערה: פרמטר זה יכול להיות שונה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את נתיבי הזרימה וחיסור התייחסות. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הנתיבים Fc = 1 וFc = 2, Fc חיסור = 2-1. הערה: התכנית תציג בזמן אמת החיסור של שני תאים נמדדו. זכור כי פרמטר זה לא ניתן לשנות במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מדף המדגם המתאים (זה יכול להשפיע על מדגם צריכת הנפח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קובץ התוצאות. </li></ol> 7. מחזורי ניסוי כל ניסוי מורכב ממחזורים, לשמור תיעוד ברור של הזריקות נעשו בeaמחזור ch, ולהפריד בין הטעינה &#39;ligands, ההזרקה ריקה של החיץ, וההזרקה אנליטי למחזורים שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת הכנת צ&#39;יפ וניקל: מחזור 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את הזרימה והנתיבים נקבעים בהתאם לצעד 6.1 ו -6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 350 mM EDTA ל1 דקות כדי לשטוף את השאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה להגדיר עד 10 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 0.5 מ&quot;מ NiCl 2 למשך 2 דקות. הערה: עכשיו שרף השבב מצופה על ידי יוני ניקל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 2: ligands קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק יגנד עד שמגיעים ערכי RU כי הם 10-20 קפל של המשקל המולקולרי שלה. לדוגמא, טען יגנד של 50 kDa ל500-1,000 RUS. שמור תיעוד של ערך RU הושג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק יגנד B (שליטה) עד אותו ערך RU לזה של א &#39;יגנד צג sensogram החיסור (Fc = 2-1) על השורה כדי לעזור לשלוט באורך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 50 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, לשטוף את המערכת ל5-20 דקות, עד שהבסיס (Fc = 2-1) מייצב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 3: הזרקה בלנק. הזרקה זה תשמש לחיסור ריק, ולכן כולל את כל המרכיבים שניתן להזריק עם אנליטי, למעט אנליטי עצמו. הערה: אורך הזרקה יכול להשתנות בהתאם לזמן שנדרש כדי להגיע לשיווי משקל (מישורי אות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, Fc = 2-1 חיסור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הפקודה &quot;לחכות&quot; (להלן כ &#39;לחכות&#39;) במשך 30 שניות (יש בסיס יציב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 15 שניות RB. הערה: משך ההזרקה ינוע בין מערכות שונות, בהתאם להקבועים מראש שיווי המשקל הקינטית (בעיקר k). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 120-600 שניות כדי להקליט את שלב הניתוק. הערה: אורכו של שלב זה משתנה בהתאם ל <eמ &#39;&gt; k d: איטי דיסוציאציה עוד צעד זה צריך להיות. למתחמי dissociating איטיים מאוד (ד k &lt;10 -4 שניות -1), לחכות 10-15 דקות ולאחר מכן להמשיך אל פני השטח התחדשות (ראה בהמשך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 4: הזרקה אנליטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק / דבק התנאים המדויקים המשמשים בהזרקת ההתייחסות (מחזור 3) ולכן שתי זריקות אלה יכולים להיות מופחתים מאוחר יותר. לשנות את המיקום של החריץ במעמד מהאחד מחזיק את פתרון שליטה לאחד שמחזיק את הפתרון אנליטי. בחר ריכוז שהוא מעט מעל D K הצפוי. אם אין ידע מוקדם זמין, לבחור 1 מיקרומטר כנקודת התחלה טובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 5: הזרקת מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור חזור על 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 6: הזרקה אנליטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור חזור על 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 7: צ&#39;יפ לערטל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה להגדיר עד 50 μl / min. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 350 mM EDTA דקות 1. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.25% SDS 1 דקות. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הוא לא הגיע לרמה בסיסית, להזריק 100 מ&quot;מ HCl דקות 1 כצעד הפשטה נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הפקודה &quot;לרוץ סוף &#39;שעוברת למצב המתנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון שבב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את שבב החיישן ומוציא אותו מהמכשיר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את החיישן החוצה מנדנה, להימנע מנגיעה במשטח, לשטוף עם DDW, ומקום בצינור 50 מיליליטר מכיל RB. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 8. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה יעודיים להערכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים כדי לעבד את הנתונים הגולמיים שהושגו על ידי SPR לפני הגזירה של הפרמטרים קינטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ההערכה, פתוחקובץ התוצאות, מחזורים בחרו 3-6 Fc = 2-1 (התייחסות מופחתים נתונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משמרת ציר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזורי תצוגה 3-6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפס ערך ציר ה- Y של נקודת ההתחלה (זמן ההמתנה 30 שניות הראשוניות בכל מחזור) לכל ארבעת העקומות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את ציר X- של ארבע עקומות. בחרו תכונות בולטות (לדוגמא, קוצים של תחילת הזרקה או לסיים) כדי ליישר מושלם ארבע עקומות לאורך ציר ה- X. קבע את הזמן של תחילת אנליטי (או חיץ שליטה) לאפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסור התייחסות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את תגובת רקע על ידי הפחתת עקומה של מחזור 3 מעקום של מחזור 4 ועקומה של מחזור 5 מעקום של מחזור 6. השתמש בפעולת חיסור עקומה שניתן למצוא בציר ה- Y משמרות תפריט. הערה: חשוב לבצע שלב זה כפי שהוא מבטל את כל רכיבים ספציפיים (שאינם קשורים לאנליטי) שאולי השפיעו על מקדם שבירת פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העקומות מופחתים בtהוא גיליון של הפרויקט תחת שם אחר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בעקומות אלה כאל &quot;עקומות מופחתים כפליים&quot;: החיסור הראשון הוא החיסור 2-1 מבוצע בשני הזריקות, והשני הוא החיסור של עקומה אחד למשנהו. הערה: התייחסות כפולה כזה היא סטנדרטי בניסויי SPR זהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי העקומות מופחתים על ידי ביצוע שינוי ציר כפי שהוסבר קודם לכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת קבועי קינטיקה ומתאימה מודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניסוי הקינטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק סדרה של 6-7 ריכוזים אנליטי ליש לי אמין של נתונים לקביעת קבועים קינטית. בחר ריכוזים אנליטי מ10-לקפל מעל לפי 10 מתחת לאומדן K D, בדילולי 2-3 פי. כולל ריכוז &quot;אפס&quot;, מאוחר יותר המשמש לחיסור כפול התייחסות (ראה לעיל). לנהל זריקות בtriplicates ובסדר אקראיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישרולחסר כל העקומות ביחס לציר Y וציר ה- X לפני שתנסה מודל מתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים מודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תכנית ניתוח מתאימה. הערה: רוב התוכניות מתאימות הזמינות מציעות מספר דגמים שניתן להחיל על הולם ונחישות של קבועים קינטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישם את המודל הפשוט ביותר (אנגמיור) בהנחת 1 הפיכה: אינטראקציה בין 1 אנליטי ויגנד למתאים. אלא אם כן לשכנע את הנתונים זמינים משיטות ניסיוניות אחרות לקיומה של אינטראקציה מורכבת יותר, תמיד להשתמש במודל אנגמיור פשוט. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li><li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance:+a+laboratory+medicine+perspective.">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).</li><li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique.">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+RNA&#8211;protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance.">Kinetic studies of RNA&#8211;protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li><li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+molybdate/tungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins.">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li><li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique.">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging.">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li><li>Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).</li><li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface plasmon resonance. Protein&#8211; ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li></ol>

All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR הוא שיטה רגישה מאוד ללמוד אינטראקציות מולקולריות, ולעתים קרובות היא הגישה היחידה שמספקת ניטור של אינטראקציות חולפות (עדיין חשובות) בזמן אמת. דוגמה לכך היא האינטראקציה החולפת המוצגת כאן, שלא ניתן הייתה לזהות בכל דרך אחרת (מבחני נפתחים, מבחני שקיעת יפוזומים 6). יתר על כן, בעוד ששיטות אחרות מוגבלות לשיווי משקל מדידות (אם כמותי או איכותי), SPR הוא אחת הטכניקות רק המודדות גם קינטיקה מראש שיווי המשקל. הרגישות שלה היא גם האזהרה שלה. sensograms החיובי שגוי נרשם בקלות. לכן מומלץ להקים את קיומה של האינטראקציה בשיטות אחרות לפני שתנסו מדידות SPR. ידע מוקדם של המאפיינים של המערכת (הערכה גסה של K D, יציב לעומת אינטראקציה חולפת) היא מועיל מאוד בהקמת experime SPRNTS והערכה רלוונטי התפקודית של המדידות שהושגו. נושא חשוב שכדאי לזכור לפני שמתחיל מדידות SPR היא איכות דגימות החלבון. SPR הוא רגיש מאוד לאגרגטים ואלה יש להסיר מן שניהם יגנד והכנות אנליטי (על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל או ultracentrifugation במידת האפשר). מקור נוסף לרעש ואותות שווא יכול לנבוע חוסר התאמה חיץ בין RB והחיץ של אנליטי. זה עשוי להיפתר על ידי dialyzing אנליטי נגד RB, או על ידי שימוש בהכנה מרוכזת מאוד של אנליטי המדולל קפלים רבים (~ 100-1,000 פי) לRB. נתונים חיוביים כוזבים יכולים לנבוע גם מאינטראקציות הלא ספציפיות של אנליטי עם המטריצה ​​של השבב או עם הביקורת השלילית. אינטראקציות אלה זיקה נמוכה, אז לפעמים יכול להימנע על ידי שימוש בריכוזים נמוכים אנליטי. בנוסף, הכללת BSA הנמוך ו / או ריכוזי חומרי ניקוי (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר ו / או 0.05-0.1% (W נ /), בהתאמה) לRB ולמדגם אנליטי המוזרק יכולים להקטין אינטראקציות ספציפיות. שינוי התוכן בתא השלילי השליטה (שליטה שלילית שונה) הוא גישה אחרת להתמודדות עם סוגיות מחייבות ספציפיות. לחלופין, באמצעות סוג אחר של שבב יכול להשפיע גם על איכות הנתונים. סוגים שונים של שבבי חיישן זמינים מסחרי, המבוססים על chemistries שונה. בשבב הנפוץ ביותר חיישן (שבב CM-5) carboxymethylated dextran מצורף קוולנטית למשטח זהב. חלבונים יכולים להיות בשילוב קוולנטית אל פני השטח החיישן תוך שימוש במגוון של chemistries משטח פשוט מאוד (רוב אמין או צימוד תיאול נפוץ). עם זאת, בידיים שלנו, בעבודה עם קיבוע קוולנטיים חלבוני קרום לעתים קרובות מניב חפצים ולכן לא מדוברת בשיטה של ​​בחירה. בהקשר של לימוד חלבון קרום, ראוי לציין כי יש שבבים מסחריים שמצופים במולקולות lipophilic. אלה מאפשרים immobilization של חלבונים בממברנה על סביבה כמו-ילידים. יכולים גם להיות מוכנים שבבי חיישן דומים &#39;בבית&#39;. לתיאור שיטות צימוד אחרים רואה 10,11. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתבסס על השימוש בשבב Ni-נ.ת.ע לקיבוע של המשאית שלו מתויגת, חומרי הניקוי solubilized (אנליטי הוא לא מתויג כדי למנוע אנליטי מחייב את משטח השבב). מניסיוננו 6,12, קבועים הקינטית נובעים מניסויים שנערכו עם שבבי Ni-נ.ת.ע הם בהסכם טוב עם אלה שנקבעו בסביבות כמו-ילידים. למרות שבבי Ni-נ.ת.ע יקרים יחסית, היתרון העיקרי שלהם הוא שהם יכולים להיות חשוף ליגנד ושימוש חוזר. מאות מדידות ניתן לעשות לכל שבב. יתר על כן, הנטייה של יגנד על השבב נקבעה על ידי המיקום של התג שלו ולכן די הומוגנית. ברגע אינטראקציה נרשמה בהצלחה על ידי SPR, סדרה של בקרות וrepeיש צורך ATS כדי לוודא את תוקפו של אות SPR. אימות של הפרמטרים הבאים עשויה לסייע כדי לאמת את נתוני SRP: 1. ספציפי של אות SPR: בשל הרגישות הגבוהה של SPR, השימוש בפקדים שליליים המתאימים הוא בעלת חשיבות מיוחדת. אינטראקציה שאינה ספציפית נרשמה על ידי SRP יכולה להיות בגלל הספיחה של אנליטי למטריצה. לכן, תא זרימה ריק הוא לעתים קרובות לא האופציה הטובה ביותר מאז תא זרימה עמוס חלבון (ליגנד) הוא לא כימי שווה ערך לתא זרימה ריק. אפשרות טובה יותר היא להשתמש בגרסה לא פעילה מוטציה של יגנד, אחד שידוע שלא יחייבו את אנליטי. לחלופין, אפשר להשתמש אנליטי מוטציה דומה. אם מוטציות אמורות לא תהיינה זמינות חלבון הומולוגי (אך ייחוד מחייב שונה) יכול לשמש 12. דוגמאות לבקרות שליליות טובות ליגנד הומולוגי (כפי שמתוארים כאן), או מוטציה נקודתית באחד מהשותפים באינטראקציה שידועהלבטל את העמותה. מומלץ נוסף ביקורת שלילית היא שינוי של שינוי לאחר translational (למשל, זרחון, מתילציה, גזירת תיאול) כי הוא חיוני לאינטראקציה. לדוגמא, דה-זירחון של טירוזין שהוא חיוני לאינטראקציה תחום SH2. בקרות שליליות אחרות עשויות להיות מערכת ספציפית. בעת שימוש SPR, את החשיבות של שימוש בבקרה שלילית קפדנית לא יכולה להיות מוגזמת. 2. שחזור של אות SPR: SPR הוא שיטה מאוד לשחזור. כאשר כמויות יגנד שווים מועמסות על שבב biosensor וריכוזים שווים של אנליטי מוזרקים החזרות צריכים ליישר בצורה מושלמת (ראה איור 3). 3. התחדשות של המערכת: באינטראקציות עם שיעור ניתוק איטי (ד יא), אנליטי חייבת להיות חשוף מיגנד תוך שמירה על השלמות הפונקציונלית ומבנית של latter. אם ניתוק ו / או התחדשות אינה שלמים, אות SPR תתפרק בהדרגה על הזריקות הבאות של אנליטי. תנאי התחדשות אופייניים שניתן לבדוק הם ריכוזים גבוהים של Mg 2 + (עד 2 מ &#39;), תנאים (לדוגמא, 10 מ&quot;מ pH 2.5 גליצין, 10 מ&quot;מ NaOH), מלח גבוה (עד 4 M NaCl), או חומצי או בסיסיים ריכוז חומר ניקוי גבוה (למשל, 1% DDM). עם זאת, יעילות ההתחדשות של חומרים כימיים אלה (ואחרים) היא מאוד ספציפית למערכת ובכך תנאי regenerations חייבים להיבדק. במקרים מסוימים, האינטראקציה היא כל כך יציבה וחזקה שההתחדשות היא לא שלמה, כמו במקרה של א &#39; מערכת תחבורת coli ויטמין B 12 (BtuCD-F) 7. בתנאים כאלה, האפשרות היחידה היא להתפשט ליגנד משבב biosensor וטען מחדש אצווה טרי לכל זריקה. במקרים שבהם הניתוק של אנליטי מיגנד הוא התחדשות משטח מהירה ושלמה היא מיותרת(ראה פרוטוקול ואיורים 2-3). 4. חלבוני ממברנה תמיד הם מטוהרים בנוכחות של חומר ניקוי, אשר יכול להשפיע על שיעורי רגישות ותגובת SPR. עם זאת, בניסיון שלנו עם BtuCD, השיעורים הנמדדים הם דומים מאוד. אחד תמיד צריך להשיג ראיות התומכות תוך שימוש בגישות חינם כגון כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC), מבחני נפתחים, assay שקיעת liposome, וכו &#39;לדוגמא מתאם בין SPR וטכניקות אחרות הוכח למתיונין, ויטמין B 12, ושתי מערכות molybdate 6,12. קביעה שגויה של קבועי קצב הקינטית לעתים קרובות מתעוררת בתהליך הראוי. ככלל אצבע, תמיד להחיל את אנגמיור 1 הפשוט: מודל האינטראקציה 1 לניסויים הקינטית ניתוח. מודלים מורכבים יותר להניח הנחות נוספות של שינויי קונפורמציה, אנליטי דו ערכי, או הטרוגניות מדגם. הנחות אלה צריכה להיותעשה רק אם היא נתמכת על ידי ראיות מגישות ניסיוניות אחרות. שימו לב שיישום מודלים אלה יהיו ככל הנראה תוצאה בצ&#39;י 2 ערכים טובים יותר הולמים ונמוכים, אבל זה לא צריך להיתפס כעדות על האמינות שלהם. מעלות גבוהות יותר של חופש הניתנות על ידי המודלים מורכבים יותר הן בדרך כלל אחראים לטובה יותר הולם, ולא רלוונטי מכניסטית שלהם. אחד היתרונות של SPR הוא התאימות הכימית הרחבה שלה, במיוחד בכל קשורים לחומרי ניקוי המשמשים לsolubilize ולטהר חלבוני קרום. עם זאת, יש לי סוכרוז וגליצרול (ופתרונות צמיגים אחרים) שמתווספים לעתים קרובות במהלך תהליך הטיהור של חלבונים בממברנה השפעות דרמטיות על RU. לכן מומלץ להימנע מאלה במידת האפשר, או לפחות להפחית את הריכוז שלהם. בעת השימוש בפתרונות צמיגים, הימנעות חוסר התאמת חיץ הופכת להיות חיונית. הוספת שומנים לחומר ניקוי המכיל RB יכולה להגביר את האות המחייבתאל ידי ככל פי עשרה. עם זאת, מאמץ כזה הוא יקר (עבור רוב השומנים) ונוטה לקצר את אורך החיים של שבבי biosensor. העצות ופתרון הבעיות שצוינו לעיל עשויות לעזור בעת כיול מערכת חדשה. עם זאת, מערכת נתונה לעתים קרובות דורשת tweaking הספציפי (למשל, בחירה של חומר ניקוי, מלח, pH) על מנת להשיג תוצאות אופטימליות. SPR כבר זמן רב מוכר כגישה רבת עוצמה וייחודית למדידת אינטראקציות מולקולריות. בשנים האחרונות את הזמינות של פלטפורמות שונות SPR וירידת המחירים שלהם הפכה SPR נגיש יותר. זה הופך במהירות את הגישה סטנדרטית הזהב ללמוד אינטראקציות בין חלבונים, אינטראקציות חלבון-סמים יעד, ולגלות מעכבי מולקולה קטנים עופרת.

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI); ההיווצרות והניתוק של קומפלקסי חלבונים, הם אירועי מפתח בתהליכים ביולוגיים רבים (למשל, שכפול, שעתוק, תרגום, איתות, תקשורת תאי תאים). מחקרים חצי כמותית של PPI לעתים קרובות מתבצעים באמצעות נפתחים או ניסויים חיסוניים ממטרים. עם זאת, בטכניקות אלה (ודומים) מוגבלים בטווח של זיקות שניתן למדוד (מייקרו הנמוך וזיקה גבוהה יותר) בשל צעדי הכביסה כי הם טבועים בטכניקות כאלה. טכניקות &quot;נקודת סיום&quot; כזה לא יכול לזהות אינטראקציות זיקה חולפות או נמוכות, כי הם לעתים קרובות השלכות ביולוגיות גדולות. בנוסף, ההחלטה הזמנית של גישות כגון מוגבלת מאוד, בדרך כלל בסדרי גודל איטי יותר מאשר שיעורי התגובה. SPR מתגבר חסרונות אלה בשל רגישותו והחלטה זמנית מעולה 1,2. SPR הוא שיטה ללא תווית, ובתור שכזואינטראקציה מולקולרית ניתן למדוד (כל עוד ניתן לאתר את שינויי המסה). בנוסף למדד המחירים ליצרן, זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין חלבון ליגנד, חלבון תרופתי (או מולקולה קטנה), חלבון ה- DNA, ואינטראקציות החלבון-RNA 3-5. תוצאות נרשמות וזממו בזמן אמת, המאפשר שינוי מהיר של תנאי ניסוי ועיצוב ניסיוני גמיש. העיקרון הפיזי מאחורי מכשירים מבוססים SPR הוא הניצול של מערכת אופטית המודדת שינוי של מקדם השבירה על פני השטח החיישן על המסה משתנה 2. אחד מהשותפים באינטראקציה (ליגנד להלן) הוא משותק על גבי שבב מטריצת פולימר והמולקולה השנייה (אנליטי להלן) הוא זרם על פני השטח. אנליטי מחייב ליגנד משנה את המסה על פני השטח השבב. שינוי מסה זו באופן ישיר ויחסי הקשורים לשינויים במדד השבירה של פני השטח. התוצאות נרשמות בזמן אמת ומוצג כיחידות תגובה (RU) כפונקציה של זמן. כגון עלילה נקראת sensogram (למשל, איור 1). מאז SPR עוקב אחרי מסלול הזמן השלם של האינטראקציה, קבועי קצב הקינטית מראש שיווי משקל נגזרים, בנוסף לשיווי משקל זיקות. כפי שיפורט להלן, מראש שיווי משקל התנהגותה של מערכת נתונה מחזיקה הרבה מידע, ומספקת נקודת מבט שונה מאוד משיווי המשקל לבד. ברגע שהמערכת מכוילת, ניסויים הם מהירים מאוד ודורשים רק כמויות קטנות של חומר חלבונים (מיקרוגרם לננוגרם כמויות). איסוף המידע הקינטית המלא של מערכת נתונה ניתן להשיג בימים. הרגישות הגבוהה של SPR מאפשרת מדידות שאינן אפשריים באמצעות כל טכניקה אחרת 6. עם זאת, רגישות גבוהה זה היא &quot;חרב פיפיות&quot; שכן הוא יכול להיות מקור עיקרי לנתונים חיוביים כוזבים. כל גורם המשפיע על המדד רעיוני נרשם וזמם על sensogram. ככזה, apבקרות propriate יש להשתמש כדי לחסל שווא-תוצאות חיוביות, ותמיכה מגישות משלימות מומלצת מאוד. איור 1 מדגים את ההתקדמות של ניסוי SPR באמצעות שבב חיישן מצופה נת&quot;ע. Sensogram בפנל מראה את הזריקה של יוני ניקל על מטריצת נת&quot;ע (נתונים unsubtracted), וBD לוחות להציג את הנתונים לאחר הפחתת האות נגזרת מתא הבקרה השלילי. אדום וחצים כחולים מראים תחילת הזרקה וסופו של דבר, בהתאמה. קיבוע של יגנד על השבב משנה בהדרגה את המסה עד ההזרקה מסתיימת. הרמה היציבה נצפתה לאחר סיום ההזרקה של יגנד משקפת את העמותה היציבה של יגנד אל פני השטח (איור 1, מחזור 2). ברגע שבסיס יציב מושגת חיץ מוזרק מעל ליגנד ותא ההתייחסות (איור 1, מחזור 3) הזרקת .זה משמש כ&#39;ביקורת ריקה &quot;, ויהיהנגרע במהלך ניתוח. על הזריקה, שינויים קלים נרשמים, המשקפים זרימת המונית דרך השבב. לאחר מכן, במחזור נפרד (איור 1 ב, מחזור 4), אנליטי מוזרק; העלייה ההדרגתית בRU מייצגת עמותה של אנליטי ליגנד. אתרי הקישור הופכים בהדרגה הכבושה עד שיגיע לשיווי המשקל. ברגע שההזרקה מסתיימת, ירידה בRUS משקפת ניתוק של המתחם. מsensograms כזה ניתן לגזור קבוע שיעור ריבית לפני שיווי משקל ושיווי המשקל (ראה בהמשך). איור 1 מתאר אינטראקציה בין חולפת יגנד ואנליטי. כאשר האינטראקציה היא יציבה יותר, הירידה ברמת RU היא איטית יותר, המשקף ד k נמוך יותר. במסמך זה, אנו מתארים ניסוי SPR שנועד לאפיין את האינטראקציה בין טרנספורטר קרום (חומר ניקוי solubilized) והשותף הפונקציונלי שלה, מצעו המקור שלה מחייב חלבון 6,7. Mod נבחרמערכת אל היא טרנספורטר קלטת מחייבת ATP (ABC), ModBC-של fulgidus Archeaglobus. מערכת זו נבחרה לתוצאות מאוד לשחזורה, גבוהה יחס אות לרעש, וקלאסי &quot;on / off&quot; שיעורים. בנוסף, מובילי homologues ABC זמינים לשרת בקרות שליליות חשובות. טרנספורטר, ModBC (ליגנד) מופק מקרום שימוש בחומרי ניקוי, מטוהר ומשותק על השבב. שותפו המסיס באינטראקציה, Moda, הוא אנליטי. כיגנד שליטה שלילי, RbsBC טרנספורטר ABC שונה משמש (&quot;ליגנד B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

במערכת המתוארת במסמך זה, שבב NiNTA משמש כדי לשתק את טרנספורטר הקרום מתויג 6,7. להיות הומו-דימר, כל טרנספורטר מתויג כפליים, שיפור שלה מחייב את שבב NiNTA. בעקבות טעינת ניקל, יגנד (טרנספורטר של עניין) הוא משותק על Fc = 2, עד ~ 3500 RU (מחזור 2 פרוטוקול, איור 2 א תווית שחורה). ואז, תוך שימוש באותה הזרימה ומשך הזרקה, יגנד B (ליגנד השליטה) מוזרק על Fc = 1, בתחילה להגיע רק עד ~ 3000 RU. כדי לוודא שסכומי חלבון דומים הם משותקים בשני תאי הזרימה; יגנד B נטען עוד, באמצעות הזרקה קצרה יותר, תוך מעקב הטעינה בזהירות עד 3,500 RUS. הצורה &#39;המדרגות&#39; מייצגת עלייה ההדרגתית במסה על Fc = 1 על כל זריקה (תווית אפורה איור 2 א). ניטור של Fc = על שורת 2-1 מסייע שליטה טעינת יגנד שווה. איור 2 מדגים את Fc = 2חיסור 1, כלומר, הפחתת הערך המקסימאלי RU בFc = 2, ממרווחי הצעד חכם בשווי RU בFc = 1. חשוב לגוון את משך הזריקות &#39;ligands להשיג טעינה שווה של ligands חקר ושליטה. ולעומת זאת, כאשר הזרקת אנליטי, משך ההזרקה חייב להישמר קבוע לכל הריכוזים המשמשים. איור 3 א ו3B להדגים את התגובות נמדדות על ידי הזרקת &#39;אנליטי ריק &quot;(כלומר, RB ההשמטה רק אנליטי) במחזורים 3 5, וזריקות אנליטי (במחזורים 4 ו -6). שים לב ששני sensograms מייצג את Fc = 2-1 החיסור. בכל אחד ממחזורי הזרקה זהה אנליטי (ריקה או ריכוז נתון) (3-6) מוחל על שני תאי הזרימה, משותק עם ligands שונה. שתי החזרות להרכיב טובה מאוד, הממחישות את שחזור הגבוה של SPR. תגובה נרשמה בשני המקרים; ~ 3 RU לריק לעומת ~ 40 RU לאנליטי. ערכים אלה מייצגים יחס אות לרעש של 13 ~. כדי להשיג את sensograms הפניה הכפולה, המייצג את התגובה מחייבת הספציפית בלבד, ההזרקה ריקה עכשיו יורדת מהזרקת אנליטי (~ 37 RU, איור 3 ג). Sensogram נרשם מגלה דפוס האופייני של אינטראקציה חולפת. על הזריקה, שלב העמותה מתאפיין בגידול מהיר בכמות אנליטי-מחויב ליגנד, להגיע למצב יציב לאחר ~ 7 שניות. המצב היציב נשמר במשך זמן רב ככל אנליטי מוזרק. כאשר ההזרקה מסתיימת, התאים נשטפים עם RB מפעילה את שלב הניתוק. המורכב במהירות dissociates, וכאנליטי הוא נשטף מיגנד חוזר אות SPR לנקודת התחלה. כדי לקבל נתונים כמותיים (pre-שיווי משקל וקבועים שיווי משקל), טווח ריכוזי אנליטי מוזרק בכפילויות או triplicates (ראה 8.3.1 בפרוטוקול). <stרונג&gt; איור 4 מראה זריקות של ריכוזים שונים אנליטי (כפילויות לכל ריכוז), שמירה על אורך הזרקה קבוע. ריכוזי אנליטי השונים מוזרקים בסדר אקראי, וsensograms הכפול מחק הם ציר ה- X מיושר לפני הניתוח. לגזור את קבועי זיקה ושיעור, מתאים מודל מיושם (ראה סעיף 8.3.2.2 בפרוטוקול). הניתוק מחושב שיווי המשקל קבוע (K D) לModBC-אינטראקציה מוצגת באיור 4 הוא ~ 3 x 10 -6 M, עם מתינות מהירה k (~ 10 4 M -1 שניות -1) וד k המהיר ( ~ 0.1 שניות -1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51937/51937fig1highres.jpg" /> איור איור 1. מהצעדים של ניסוי SPR באמצעות שבב חיישן Ni-נת&quot;ע. ( </הזרקת strong&gt;) של ניקל על מטריצת נת&quot;ע על תאי זרימת Fc = 1 וFc = 2 (המוצגת הן עקומות unsubtracted). העלייה במסה נמוכה (~ 30-50 Rus). (B - D) איור של = 2-1 sensogram Fc שנרשם במהלך ניסוי SPR. במחזור 2 כיגנד מתויג מוזרק על פני השטח טעון-Ni, מסה מצטברת בהדרגה. הזרקה מסתיימת כאשר מגיע ערך RU סופי הנע בין 1,000-5,000 RU (תלוי בMW של יגנד). נקודת התחלה נוצר, המשקפת את היציבות מחייבת של יגנד לשבב. במחזור 3, הזרקה ריקה הופיעה, הזרקת הרכיבים של מדגם אנליטי לא כולל רק את אנליטי. בהזרקה זה לעתים קרובות תגובה נמוכה נרשמה (1-5 Rus). במחזור 4 אנליטי מוזרק באמצעות אותו המשטר שההזרקה ריקה. RUS הגדלת לשקף את שינוי המסה על פני השטח, כלומר, המחייב של אנליטי ליגנד. האות מגדילה במהירות ולאחר מכן מישורים כהמערכת דואר מגיעה לשיווי משקל. כאשר ההזרקה מסתיימת, אנליטי dissociates מיגנד, וכתוצאה מכך לירידה באות ולחזור לרמות בסיס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51937/51937fig2highres.jpg" /> איור 2. בניטור קו של מקדמי יגנד. (א) עקומות Unsubtracted של טעינת יגנד. יגנד של עניין (ליגנד &quot;&quot;) נטען לזרום תא 2 (Fc = 2, שחור) עד שמגיע לרמה הרצויה RU (~ 3500 RU בדוגמא זו). ואז, ליגנד הבקרה השלילי (&quot;B&quot; ליגנד) הוא צעד חכם הועמס על תא זרימת 1 (Fc = 1, אפור) עד רמת RU זהה הוא הגיע. (ב) שתי הזריקות מבוצעות ב() מעקב בזמן אמת כפי Fc = 2-1 חיסור. מעקב זה מאפשר טעינה זהה של ligands של עניין ושליטה. <img alt= &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 51,937 / 51937fig3highres.jpg&quot; /&gt; איור 3. התייחסות זוגית. () כפילויות של חיסור 2-1 (כלומר, Fc = 2-1) של ההזרקה ריקה. (ב) כב (א), רק אנליטי מוזרק. (C) sensograms הסופי לאחר הפחתת תגובת הרקע שמוצגת ב( א &#39;) מהתגובה המדודה ב( B). עקומות אלה המכונים &#39;כפולים נמחק &quot;או&quot; כפולים בהפניה &quot;. כפילויות הן מחזורים עוקבים. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51937/51937fig4highres.jpg" /> . איור 4. קביעת קבועי קצב הקינטית על ידי זריקות של ריכוזי אנליטי מרובים (בכפילויות) הקווים השחורים הם המתאימים שחושבו באמצעות פשוט 1: מודל אינטראקציה 1 אנגמיור.

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR at JoVE.com

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.5K Views.  The Technion-Israel Institute of Technology.  משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה. 

Video: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...