אנו מודים מת&#39;יו רוברט Weatherhead עבור שירות טכני מעולה ג&#39;ון רלף, אוניברסיטת ויסקונסין עצה, דיונים חשובים, ואת מדגם עץ צפצפה. עבודה זו מומנה על ידי משרד האנרגיה האמריקני (DOE) Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER משרד המדע DE-FC02-07ER64494) ועל ידי למדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע , משרד האנרגיה של ארה&quot;ב (ללא פרס. DE-FG02-91ER20021).

1. קיר בידוד נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים בערך 60-70mg של אוויר או חומר להקפיא מיובש צמח עם 5.5 מ&quot;מ נירוסטה כדורי פלדה צינורית 2 מ&quot;ל בורג מכסה Sarstedt באמצעות iWall, רובוט שחיקה מחלק (30 י). החלופה הלא רובוטית נמוך התפוקה ההליך באמצעות כדור הטחנה (retschmill) מוצג חלק II 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ&quot;ל של אתנול מימית 70% לחומר הקרקע לוותר, והמערבולת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 10,000 עבור 10 דקות עד גלולה שאריות אלכוהול מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב או למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ&quot;ל של כלורופורם פתרון / מתנול (01:01 v / v) כדי שאריות ולנער צינור ביסודיות כדי resuspend גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 10,000 עבור 10 דקות ו לשאוב או למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 500 μl של אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס עם זרם של אוויר ב 35 ° C עד יבש. אם דגימות מיובשות הצורך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, עד לעיבוד נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליזום את הסרת עמילן מן המדגם resuspend את הכדור בתוך 1.5 מ&quot;ל של 0.1 נתרן אצטט M חיץ pH 5.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינורות Sarstedt וחום במשך 20 דקות. בשעה 80 ° C בבלוק חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את ההשעיה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את סוכני הבאים אל גלולה: 35 μl של 0.01% אזיד הנתרן (NaN3), עמילז 35 μl (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל H 2 O; ממינים Bacillus, Sigma); 17 pullulanase μl (17.8 יחידות מ acidopullulyticus Bacillus: Sigma) . שווי הצינור ואת המערבולת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה היא מודגרות מעל בלילה 37 מעלות צלזיוס ב שייקר. מכוונת את הצינורות אופקית משופרת עוזרים ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה מחממים ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתוך גוש חימום לסיים את מערכת העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (10,000 סל&quot;ד, 10 דקות) וזורקים supernatant solubilized המכיל עמילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הנותרים גלולה שלוש פעמים על ידי הוספת 1.5 מ&quot;ל מים, vortexing, centrifuging ו decanting מים הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 500 μl של אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס עם זרם של אוויר ב 35 ° C עד יבש. זה עשוי להיות נחוץ גם כדי לשבור את החומר בתוך הצינור עם מרית לייבוש טוב יותר. חומר יבש מציג דופן התא המבודד (lignocellulosics). אם דגימות מיובשות הצורך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, עד לעיבוד נוסף. </li></ol> 2. ליגנין תוכן שיטה זו מבוססת על שיטת שדווחו על ידי Fukushima ו הטפילד 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 1-1.5 מ&quot;ג של חומר התא מוכן קיר (ראה 1) לתוך הבקבוק 2 מ&quot;ל נפח עוזב אחד שפופרת ריק ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם צינור קירות 250 μl של אצטון כדי לאסוף את דופן התא חומר על החלק התחתון של הצינור, להתאדות אצטון מאוד עדין תחת זרימת האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 100 μl של פתרון טריים ברומיד אצטיל (25% v / v ברומיד אצטיל חומצה אצטית קרחונית) לאורך קירות הצינור כדי למנוע התזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי נפח בקבוק חום של 50 מעלות 2hrs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים במשך שעה נוספת עם vortexing כל 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים על הקרח לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400 μl של סודיום הידרוקסיד 2M ו 70 μl של המוכן טרי hydrochloride 0.5 hydroxylamine ז. וורטקס volumetric צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הבקבוק volumetric בדיוק על 2.0 מ&quot;ל סימן עם חומצה אצטית כובע קרחונים, וכן להפוך מספר פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של התמיסה לתוך צלחת UV 96 ספציפי היטב לקרוא קורא ELISA ב 280nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אחוז ליגנין ברומיד אצטיל מסיסים (% ABSL) באמצעות מקדם המתאים (צפצפה = 18.21; העשבים = 17.75; ארבידופסיס = 15.69) עם הנוסחה הבאה: % ABSL Calc: <img src="/files/ftp_upload/1745/1745eq.jpg" alt="איור 1" /> כפל של ABSL% עם 10 תוצאות יחידת UG / מ&quot;ג דופן התא זה עוזר לעשות לפחות 3 צלחת קורא לממוצע ספיגת (ABS) מאז חלקיקים יכול לגרום שינוי קל ספיגת ערכים. הערה: 0.539 ס&quot;מ מייצג את pathlength, אבל תלוי על הצלחת זה אולי צריך להיות נחוש. </li></ol> 3. ליגנין הרכב שיטה זו אומצה משיטת שפורסם לאחרונה על ידי רובינסון מנספילד 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כ 2 מ&quot;ג של החומר דופן התא (ראה 1.) לתוך צינור בורג כתרים זכוכית thioacidolysis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכין trifluoride 2.5% בורון diethyl etherate (BF 3), 10% ethanethiol (EtSH) פתרון. עליך להשתמש בלון מלא גז חנקן כדי לתפוס את אובדן הנפח בבקבוק dioxane עם חנקן. Dioxane מסוכן מאוד, לא לוקחים דגימות או ציוד מתוך מכסה המנוע. כרכים הדרוש להכנת הפתרון לפי המדגם: 175 μl dioxane; 20 EtSH μl; 5 BF μl 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של EtSH, BF 3, פתרון dioxane לטעום כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון הטיהור אמיץ עם גז חנקן כובע מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם שעה עדין כל ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוף תגובה על ידי קירור על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של סודיום ביקרבונט 0.4M, מערבולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל לנקות להוסיף 1 מ&quot;ל מים 0.5 מ&quot;ל של אתיל אצטט מערבולת, ולתת שלבים נפרדים (אתיל אצטט על המים העליונה, על התחתונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 150 μl של שכבת אתיל אצטט לתוך צינור 2 Sarstedt מ&quot;ל. ודא שאין מים מועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות ממס על ידי concentrator עם האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl אצטון ו להתאדות (לחזור על סך של שתי פעמים להסיר עודפי מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור derivatization TMS להוסיף 500 μl של אתיל אצטט, 20 μl של פירידין, ו 100 μl של N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide אל צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 2 שעות במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של התגובה לתוך בקבוקון GC / MS ולהוסיף 100 μl של אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי GC מצויד ספקטרומטר מסה-quadrupole או יינון גלאי להבה. טור HP-5ms Agilent מותקן (30 מ&quot;מ X 0.25 X 0.25 מ&quot;מ עובי הסרט מיקרומטר). מפל הטמפרטורה הבא נמצא בשימוש עם השהיה של 30 דקות ממס של 1.1 מ&quot;ל / דקה ספיקה: להחזיק ראשוני ב 130 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 3 ° C / min כבש ל 250 מעלות צלזיוס והחזק דקות 1; לאפשר איזון הטמפרטורה ההתחלתית של 130 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיקס מזוהים פעמים החזקת קרוב משפחה באמצעות tetracosane פנימי סטנדרטי (לא חובה) או על ידי הקשת מאפיין יונים המונית של 299 מ &#39;/ z, 269 מ&#39; / z, ו - 239 מ &#39;/ z עבור S, G ו-H מונומרים, בהתאמה (ראה איור. 2). הרכב של רכיבים ליגנין היא לכמת ידי הגדרת אזור שיא בסך הכל 100% </li></ol> 4. נציג תוצאות דוגמה של ניתוח קיר מוצג באיור 2. במקרה זה צפצפה גזע (עץ) נותח על ידי נהלים שונים המתוארים בסעיף פרוטוקול. Chromatogram דוגמה הפרדת ליגנין רכיבים לאחר thioacidolysis ו-TMS derivatization מוצג. ברור, השפע היחסי של syringyl-(S), guaiacyl-(G), ו-p-hydroxyphenol (H) היחידות ניתן לקבוע. התוכן של ליגנין ברומיד אצטיל מסיסים הוא מובן מאליו, יש לצפות לערכים של בין 20-50% ממשקל קיר יבש. יש לציין כי ברומיד אצטיל לא solubilize כל ההווה ליגנין בקיר, וכי מידת solubilization יכול להשתנות בהתאם החומר. עם זאת, שיטה זו היא קלה יחסית לביצוע ומהירה והוא נותן קירוב מצוין של התוכן ליגנין בחומר lignocellulosic. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1:. סקירה כללית של ניתוח lignocellulosic קירות התא (lignocellulosics) מבודדים מן החומר הגולמי צמח מיובש. החומר הקיר משוקלל מכן לתוך aliquots ו לחלק את מבחני שונות. חומר וול מטופל עם ברומיד אצטיל ואת ליגנין solubilized לכמת ידי ספקטרוסקופיה-UV. לקביעת הרכב ליגנין, חומר הקיר נתונה thioacidolysis. Phenolics solubilized לעבור derivatization TMS ולאחר מכן יכול להיות מופרדים לכמת ידי ניתוח GC-MS. הרכב פוליסכריד מטריקס פרוטוקול גבישי תוכן תאית נדון בחלק ב &#39;2. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2:. Lignocellulosic ניתוח מקיף של עץ צפצפה שבבי עץ של צפצפה (Populus tremoloides) נחשפו הפרוטוקולים תיאר. Ligin הרכב; H p-hydroxyphenyl; G guaiacyl; S יחידות syringyl.

<ol>
	<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+isolation+of+lignin+for+utilization+as+a+standard+to+determine+lignin+concentration+using+the+acetyl+bromide+spectrophotometric+method.">Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method.</a> J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Robinson, A. R., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+poplar+lignin+monomer+composition+by+a+streamlined+thioacidolysis+procedure+and+near-infrared+reflectance-based+prediction+modeling.">Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling.</a> Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endo-transglycosylases.">Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li></ol>

השיטות שתוארו לאפשר הערכה כמותית מהירה של תוכן ליגנין והרכב של ביומסה הצמח lignocellulosic. השימוש ברובוט iWall כ 350 דגימות הקרקע ניתן לוותר ליום. התפוקה של שיטות אנליטיות שונות לאדם משתנה. שימוש בפרוטוקולים המתואר כאן, 30 דגימות יכול להיות מעובד על תוכן ליגנין, ו -15 עבור הרכב ליגנין ליום. בשל אופיו הכמותי של הגידולים אופטימלי נתונים חומרי גלם, מגוון או גנוטיפים ניתן להעריך מבחינת התאמתם לייצור דלק ביולוגי.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hydroxylamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>255580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetyl Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>135968</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanethiol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E3708</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borontrifluoride diethyl etherate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>15719</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>15241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dioxane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>296309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectromax Plus 384</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Plus384</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6890 GC/5975B MSD</td>
<td>(lignin composition)</td>
</tr>
<tr>
<td>5.5mm Stainless Steel Balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salem Ball Company</td>
<td>(N/A)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate heat spreader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocision</td>
<td>Coolsink 96F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>Dri-block DB-3D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sample concentrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>FSC400D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part i: lignin

הצורך מתחדשת, פחמן ניטרלי, וחומרי גלם לתעשיית קיימא והחברה הפכה להיות אחד הנושאים הדחופים ביותר של המאה ה -21. זה לעורר עניין מחדש השימוש במוצרים צמח כחומרי גלם לייצור תעשייתי של דלק נוזלי לתחבורה<sup&gt; 1</sup&gt; ומוצרים אחרים כגון חומרי biocomposite<sup&gt; 7</sup&gt;. ביומסה הצמח נשאר אחד שלא נוצל שומרת לעצמה הגדולה ביותר על פני כדור הארץ<sup&gt; 4</sup&gt;. היא מורכבת בעיקר של קירות התא מורכב של פולימרים אנרגיה עשיר כולל תאית, hemicelluloses שונים (סוכרים מטריקס, ואת ליגנין פוליפנול<sup&gt; 6</sup&gt; ולכן נקראת לפעמים lignocellulosics. עם זאת, קירות תא הצמח התפתחו להיות סרבן השפלה כמו קירות לספק חוזק מתיחה לתאים הצמחים כולו, להדוף פתוגנים, ולאפשר למים להיות מועבר ברחבי המפעל, במקרה של עצי עד יותר מ 100 לעיל הקרקע. בשל הפונקציות השונות של קירות, קיים מגוון עצום מבניים בתוך חומות של מיני צמחים שונים, סוגי תאים בתוך מפעל יחיד<sup&gt; 4</sup&gt;. לפיכך, בהתאם למה מינים היבול, מגוון הצומח, או רקמות הצמח משמש biorefinery, מדרגות עיבוד depolymerization על ידי תהליכים כימיים / אנזימטית ותסיסה הבאים של סוכרים שונים דלקים נוזליים צריך להיות מותאם אופטימיזציה. עובדה זו בבסיס הצורך אפיון יסודי של feedstocks ביומסה הצמח. כאן אנו מתארים מתודולוגיה אנליטית מקיפה המאפשרת קביעת הרכב lignocellulosics והוא מקובל בינוני ניתוח תפוקה גבוהה. בחלק ראשון זה אנו מתמקדים בניתוח של ליגנין פוליפנול (איור 1). השיטה של ​​מתחיל עם הכנת חומר destarched דופן התא. Lignocellulosics וכתוצאה מכך הם התפצלה כדי לקבוע את התוכן שלו על ידי ליגנין solubilization acetylbromide<sup&gt; 3</sup&gt; ו ליגנין הרכב שלה במונחים של יחידות שלה syringyl guaiacyl ו-p-hydroxyphenyl<sup&gt; 5</sup&gt;. פרוטוקול לניתוח הפחמימות ביומסה lignocellulosic לרבות תוכן תאית פוליסכריד הרכב מטריצה ​​נדון חלק II<sup&gt; 2</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin at JoVE.com

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן הרכב ליגנין polyphenolic.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

comprehensive-compositional-analysis-plant-cell-walls-lignocellulosic

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

SCIENTISTS IN ACTION

32.0K Views.  Michigan State University (MSU). ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן הרכב ליגנין polyphenolic.

Video: Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...