ליגנין הוא הטרופולימר מורכב המורכב משלושה מונוליגנולים. זהו הפולימר השני בשכיחותו על פני כדור הארץ ליד תאית. כאן, אנו מדגימים שיטת חומצה תיוגליקולית, שהיא השיטה האמינה ביותר להערכת תוכן ליגנין.
שיטה זו מבוססת על העיקרון כי ליגנין נקשר חומצה תיוגליקולית באמצעות קשרים thioether. יתר על כן, חילקנו את הפרוטוקול הזה לחמישה שלבים. בשלב הראשון, אנו מכינים את החומר הצמחי.
בשלב השני, אנו מבודדים את תמצית אלכוהול בלתי מסיס. בשלב השלישי, אנו לזרז ליגנין באמצעות חומצה תיוגליקולית ומצבים חומציים. בשלב הרביעי, אנו מכינים עקומה סטנדרטית ליגנין באמצעות ליגנין במבוק תעשייתי.
לבסוף, בשלב החמישי, אנו מעריכים את תוכן ליגינין באמצעות העקומה הסטנדרטית שהוכנה בשלב הרביעי. החומר הצמחי נאסף, הפך את הסירים כדי להפריד את השורשים, שטף אותם ביסודיות במים, האוויר התייבש במשך יומיים, העביר אותם למיכלים מסומנים והדגיר אותם באינקובטור ב 49 מעלות צלזיוס במשך שבוע עד 10 ימים. באמצעות מספריים, הרקמה נחתכת עוד יותר לחתיכות בגודל 1 מ"מ עד 3 מ"מ.
לחלופין, מטחנת ביומסה משמשת לריסוק רקמות הצמח. השתמש ברקמת השורש הפעל את מטחנת ביומסה לאסוף את האבקה כתוש לתוך מיכלים שכותרתו מראש. באופן דומה, חזור על רקמת הגזע ורקמת העלה.
האבקה המרוסקת נטענת לתוך אגרטל השחיקה אשר ממוקמים לאחר מכן בטחנת המקפיא ולהפעיל את טחנת המקפיא בקצב של 10 CP מהירות במשך שלושה מחזורים. שוקלים 20 מ"ג של אבקת רקמת הקרקע ומעבירים לצינור 2 מ"ל עשוי מראש. רשום לעצמך את הצינור הריק ואת הצינור עם אבקת הרקמות ואבקת הרקמות במחברת המעבדה שלך.
דגירה הצינורות עם כובע פתוח ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, מוסיפים 1.8 מ"ל מים לכל צנטריפוגת מערבולת מדגם ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. השלך את supernatant הוסף 1.8 מ"ל של מתנול.
וורטקס ודגרת בבלוק 60 מעלות צנטריגרד שחומם מראש למשך 20 דקות לאחר דגירה צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. חזור על שלב זה פעם נוספת. לאחר צנטריפוגה להשליך את supernatant ולייבש את כדורי במייבש ואקום במשך שעתיים עד שלוש שעות או עד המשטח יבש לחלוטין.
למדוד ולתעד את המשקל של כל צינור במחברת המעבדה שלך להערכת תוכן ליגנין בסוף. כוללים גם שליטה חיובית תעשייתי במבוק ליגנין בשלב זה החל מ 0.5 מ"ג ל 4 מ"ג טריפליקטים. הוסף 1 מ"ל של 3 חומצה הידרוכלורית נורמלית, יחד עם מאה מיקרוליטרים של חומצה גליקולית לכל מדגם וורטקס ודגירה ב 80 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
לאחר 3 שעות הדגירה להעביר אותם למתלה ולאפשר לו להתקרר במשך 10 דקות. ואז צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, צבע הפתרון נראה כך.
השלך את הסופרנט. מוסיפים 1 מ"ל מים. מערבולת צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות.
השלך את הסופרנט. יש להוסיף 1 מ"ל של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד. וורטקס ודגרת ב 37 מעלות צלזיוס שייקר לילה.
לאחר דגירה לילה צנטריפוגה הצינורות ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. מעבירים את צינורות ה-2 מ"ל הטריים והטריים מוסיפים 200 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית מרוכזת לסופרנאטנט. מערבבים אותם על ידי היפוך עדין כפי שמוצג כאן.
דגירה אותם במקרר ב 4 מעלות צלזיוס לילה. לאחר דגירה צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. השלך את הסופרנט.
מוסיפים 1 מ"ל נתרן הידרוקסידי. וורטקס ודגרת בשייקר בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. השתמש ספקטרופוטומטר כדי לאסוף את קריאות הספיגה 280 ננומטר, לקחת 2 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד כמו ריק מאז lignin זירז מומס נתרן הידרוקסיד.
הפוך את הריק לאפס. באופן דומה, חזור על הדגימות. השתמש בשני מיקרוליטרים של כל דגימה כדי לאסוף את קריאות הספיגה במחברת המעבדה שלך.
קח שלוש קריאות עבור כל מדגם עבור שלושה משכפלים טכניים. בעמודה הראשונה, יש לנו את מספר הדגימה. בעמודה השנייה, יש לנו משכפלים ביולוגיים שבהם R1, R2, R3 מייצגים שלושה משכפלים ביולוגיים של קו ניסיוני אחד.
בעמודה השלישית, ממוצע קריאות הספיגה שהושגו ב 280 ננומטר. חישבנו את תוכן ה- lignin בעמודה הרביעית באמצעות הנוסחה y=mx-c כאשר x הוא ערך ה- OD.m ו- c הממוצע מותווים מקו הרגרסיה של העקומה הסטנדרטית שהוכנה. הגיס החמישי הוא המשקל לאחר שהמתנול והמים שוטפים.
אז זו הדרך המשמשת להערכת תוכן ליגנין ב- mg. אז אנחנו מחלקים את הערך שהושג בעמודה הרביעית על ידי העמודה החמישית כדי לקבל את הערך לכל מ"ג של תוכן ליגינין בעמודה השישית. וערך זה מוכפל ב- 1000 כדי להשיג לכל גרם משקל קיר תא.
ואחוז התוכן lignin מחושב על ידי חלוקת ערך זה על ידי 1000 והכפלה על ידי 100. לבסוף, אנו משיגים את הלינגינין הממוצע על ידי ממוצע ליגנין של שלושה משכפלים ביולוגיים של כל קו ניסיוני אשר יושוו לממוצע של קו ניסיוני אחר בצורה של גרף בר כדי להבין את ההבדלים בתוכן הignin. אנחנו יכולים גם ליישם מבחן t של תלמידים כדי לבחון את רמת המשמעות שלהם.
בטור א', יש לנו ליגנין במבוק מסחרי, ואז המשקל של ליגנין הבמבוק שנלקח לפני TGA וקריאות הספיגה שלהם בהתאמה ב 280 ננומטר. ערכים אלה בטבלה א' שימשו להתווית גרף מפוזר בעמודה B, המעניק לנו את קו הרגרסיה בערכי m ו- c. ב- C, השווינו את הערכים שהושגו באמצעות העקומה הסטנדרטית ואת קו הניסוי התעשייתי במבוק ליגנין אחד ושתיים הושוו בצורה של גרף עמודות והתוצאה היא שהם מראים הבדל בין אחד לשני.
