ברצוננו להודות לאנשים הבאים שללא עזרתה אוסף של רקמות אורן לא היה אפשרי: ד&quot;ר ג&#39;ו נעים, מאט Bryman, מיכאל בורדו, Ujwal Bagal, Huizhe ג&#39;ין, ואמנדה Bouffier.

חלק 1: קציר עץ לאחר עץ נבחרה כרותים, חשוב לעבוד בזהירות במהירות האפשרית. כמו כל סוג רקמה שונה שנקטפו, הם צריכים להציב מיד לתוך כלי משלהם חנקן נוזלי, כדי למנוע זיהום לחצות החומר המדגם. זה פרוטוקול בידוד RNA הוא מדרגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור ברגים לתוך באורכים של מ כ ו 0.5-0.75 עם ציון מסור את הקליפה בשניים או שלושה מקומות בעקבות ציר האורך של הבורג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל עץ, העבודה קצה האזור הבקיע עד הקליפה מתחילה נפרד מן העץ ולהמשיך לעבוד את האזמל תוך משיכת חזרה על הקטע של לנבוח עד שהוא מפריד לחלוטין מן הגבעול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העצה המשנית שנקטפו עם תער קצה, על ידי גירוד צדדית יחיד לאורך ציר האורך של הבורג כי כבר מקולף. ללבוש כפפות גומי כדי למזער זיהום של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיפה, הנמצא על הצד הפנימי של הסעיפים לנבוח, הוא לקצור בקלות על ידי מדריך מתקלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עץ תגובת נאסף מן החלק התחתון של הגפיים לאחר סימון אותם עם ספריי כדי לציין האוריינטציה המקורית שלהם לגבי הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איברים נחתכים לתוך גלילים של 1-2 מ &#39;והבקיע בצדדים מנוגדים לאורך ציר האורך פי במיקום המשוער של שני סוגי עץ תגובה: עץ מול (בצד העליון של האיבר) ועץ דחיסה (בתחתית בצד של האיבר). הנביחה מופרד הגפה כפי שתואר לעיל, אלא רק את הקליפה מכסה כל סוג של עץ תגובת מוסר בבת אחת. העצה השיפה המשני או נאסף אז כפי שתואר לעיל והושמו חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות אחרות, כמו מחטים, טיפים לירות קונוסים צעיר, ניתן לקצור ביד או באמצעות מזמרה כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות שנאספו מוקפאת בחנקן נוזלי צריך להיות ממוקם בתוך שקיות או מיכלים המסומנים מתאים ארוז בקרח יבש עבור המשלוח בחזרה למעבדה. </li></ol> חלק 2: מיל מקפיא עיבוד של דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את 6850 טחנת Spex מאגר במקפיא עם חנקן נוזלי והמקום בר השפעה לאחד צלוחיות שחיקה למלא עם חנקן נוזלי לצנן מראש. יוצקים את חנקן נוזלי ולהוסיף מדגם בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי לא נותר עודף חנקן נוזלי בתא כרסום כי גז חנקן עודף פרקו לחלוטין לפני את הכובע בסוף יושב לאטום את החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בקבוקון טחינה לתוך המוביל ולסגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיל דגימות וודי עבור שני מחזורים של דקה 1 / מחזור בהגדרה שיעור של 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית חנקן נוזלי מקורר כדי להסיר את המדגם הסתובבו (קמח עץ) לתוך מבחנה כי כבר מראש מקורר והוא מכיל כמות קטנה של חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את slurry חנקן נוזלי / מדגם לתוך מיכל אחסון מקום -80 ° C עד הצורך. </li></ol> חלק 3: בידוד RNA, יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 20mL של הצפת בידוד RNA לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל כתרים ולהוסיף 400 בקצרה μL β-mercaptoethanol, מערבולת, אז חום לאמבטיה מים 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 גרם של רקמה קפוא צינור אחד. שווי ולנער במרץ ביד ואחריו vortexing למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של כלורופורם אל הצינור להפוך בעדינות לתערובת. מניחים את הצינור על גלגל מסתובב ולאפשר סוף סוף על ערבוב במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את התערובת לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל ו Oak Ridge צנטריפוגות ב 12,000 (17,200 XG) סל&quot;ד ב הרוטור קבוע זווית SS34 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי צינור Oak Ridge טרי ולהוסיף חצי נפח של כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס דקה 1 וממשיכים לערבב על גלגל מסתובב במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 12,000 סל&quot;ד (17,200 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי צינור Oak Ridge טרי ולהוסיף חצי נפח של כלורופורם. וורטקס דקה 1. צנטריפוגה ב 12,000 סל&quot;ד (17,200 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי צינור 50 מ&quot;ל מהירות גבוהה פוליפרופילן. צנטריפוגה ב 10,000 סל&quot;ד (11,900 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל ומוסיפים 1 / 4 נפח 10 M פתרון LiCl כדי supernatant. בקצרה מערבולת מקום ב 4 ° C עבור משקעים בין לילה. </li></ol> חלק 4: בידוד RNA, יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SSTE חום חיץ אמבטיה 65 מעלות צלזיוס המים לפני ההתחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את המדגם LiCl-זירז לתוך צינור פוליפרופילן גלולה הרנ&quot;א על ​​ידי צנטריפוגה ב 11,000 סל&quot;ד ב הרוטור SS34 זווית קבועה (14,450 XG) במשך 30 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה,לשפוך וישאירו את הנוזל, ו להפוך את הצינורות על Kimwipes דקה בערך 1. פיפטה את כל supernatant הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה ב 800 μL של SSTE מחומם בעזרת פיפטה כדי לערבב היטב את הדגימות. העברת דגימת resuspended עד 2 מ&quot;ל Ambion RNAse ללא צינורות microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מחממים על 65 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ואחריה vortexing נמרצת על מנת להבטיח resuspension להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של פנול, כלורופורם, pH8, אל צינור כל המדגם. וורטקס כל מדגם למשך 30 שניות ואז ספין microfuge בסל&quot;ד 14,000 עבור 3 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי חדש 2ml RNAse ללא צינורות Ambion microfuge, ולהוסיף נפח שווה של כלורופורם. וורטקס כל מדגם למשך 30 שניות ספין microfuge ב 14,000 סל&quot;ד למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השלב מימית לשלב-Lock שפופרות ג&#39;ל שהוכנו בעבר על ידי microfuging בסל&quot;ד 11,000 במשך 2 דקות. הוסף חצי נפח של כלורופורם בעדינות פיפטה לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 11,000 במשך 5 דקות ולהעביר את השלב מימית כדי טריים 2ml Ambion RNAse ללא צינורות microfuge. </li></ol> חלק 5: RNA רטיבות ולשטוף אתנול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 אצטט μL 3.0 M נתרן, pH 4.8, ו - 1 מ&quot;ל 100% אתנול לשלב מימית. וורטקס ו להאיץ ב -80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microfuge דגימות 14,000 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב 4 ° C, ובזהירות לשאוב את supernatant. נא לא להפריע את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כדורי RNA עם 1 מ&quot;ל אתנול ° C 70% (v / v) -20. Microfuge בסל&quot;ד 14000 לרגע 1 ו לשאוב את אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסירה את הפקק מעל צינורות אוויר יבש כדורי על הספסל במשך 3-5 דקות. </li></ol> חלק 6: Resuspension כימות הסופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה במים 100 DEPC שטופלו μL. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה הצינורות על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לפני ששמים על הקרח. חזור במידת הצורך, כדי להבטיח resuspension המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת כמו דגימות אם רוצים ולעשות 50 μL של דילול 1:10 ב 10mm טריס, pH 7.5, עבור quantitation spectrophotometric. יחס ספיגת עבור 260/280 ו 260/230 הם בדרך כלל יותר מ 2.1 ו -2.2, בהתאמה. RNA התשואות בידוד נע בין 60-120μg / גרם רקמה קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות ידי הפעלת 1.5-2.5 מיקרוגרם RNA על 1% agarose ג&#39;ל חיץ טה. לקבלת דוגמיות יותר קריטי, לנתח את RNA באמצעות 2100 Agilent Bioanalyzer לפי הוראות היצרן. </li></ol> נציג תוצאות: התשואות RNA בידוד מטווח כוניפאר רקמות שונות 60-120 מיקרוגרם / גרם רקמה קפוא עם דגימות וודי מניב בדרך כלל סביב 70-80g / גרם רקמה קפוא. יחסי אבחון של 260/280 ו 260/230 הן בדרך כלל יותר מ 2.1, הם אינדיקטורים טובים כי המדגם RNA ללא פנוליות משמעותי או זיהום הפחמימות, בהתאמה. דוגמאות נותחו על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ואחריו מכתים EtBr צריך להראות שלוש להקות שונות עבור 25s, 18S, 5S ו-RNA (איור 1). קביעת stoichiometry של 18S ל -28 על agarose ג&#39;ל הוא סובייקטיבי במקצת, גורמים כגון ריצה התנאים הג&#39;ל, מכתים, והוא יכול לטעון מדגם כל השפעה. באופן כללי, -28: יחס 18S ייראה&gt; 1.5. עם זאת, כמה דוגמאות כוניפאר יש יחס נמוך יותר. לדוגמה, לאחר ניתוח Agilent 2100 ראינו כמה מקרים של דגימות מן כוניפאר סוגי רקמות שונים שבהם stoichiometry הוא קרוב יותר 1.2:1. לכן, לכאורה -28 נמוך: 18S stoichiometry ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose אינו מצביע בהכרח על מדגם באיכות ירודה. ליף, לירות, דגימות חרוט לעתים קרובות יהיה להקות שונות נוספות הנוכחי בשל RNAs ריבוזומלי chloroplastic. EtBr מוכתם מחומרים שאינם נודדים מן המדגם טוב או גבוה להקות מסה מולקולרית (&gt; 8-10 kb) בדרך כלל מצביעים על זיהום הדנ&quot;א הגנומי (איור 2). מסה מולקולרית נמוכה מריחות בקרבת או מתחת הלהקה 5S והלהקה מופחת מכתים ריבוזומלי או 18S לכאורה&gt; stoichiometry -28 הוא אינדיקטור טוב כי RNA השפלה אירעה (איור 3). בסופו של Agilent 2100 electropherogram, קו הבסיס צריך להיות נמוך יחסית וחלק גדול עם פסגות המתאים 18S ו -28 RNAs ריבוזומלי שיש -28: 18S יחסי בכל מקום החל 1.2-2.0. מספר RNA Agilent יושרה (רין) ערך עשויה להיות מנבא טוב יותר של איכות רנ&quot;א צריך להיות לפחות 7 או יותר עבור רנ&quot;א היא לשמש להכנת מטרות microarray. איור 4 מראה טיפוסי Agilent 2100 electropherogram עבור RNA עם העצה -28: 18S יחס שווה 1.4 וערך רין של 8.6 בעוד איור 5 מראה העצה עניים RNA לאחר הכנה בסיסית גבוהה מאוד מורגש השפלה, כפי שהיא מתגלה על ידי -28: 18S raשווה ל 0.65 וערך רין של 3.4 טיו. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. איור ג&#39;ל agarose ניתוח באיכות גבוהה RNA אורן. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, ליין 2 מראה אופייני הכולל בידוד RNA מן העצה loblolly אורן המשני -28 ריבוזומלי, 18S אופיינית, ו 5S להקות -28 לעין: היחס 18S&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור ג&#39;ל agarose ניתוח של מדגם RNA אורן מזוהם עם הדנ&quot;א הגנומי. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, ליין 2, העצה RNA מדגם מראה זיהום הדנ&quot;א הגנומי. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור ג&#39;ל agarose ניתוח של מדגם אורן מראה השפלה RNA וזיהום עם הדנ&quot;א הגנומי. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, Lane2, העצה RNA מדגם מראה זיהום הדנ&quot;א הגנומי וחמור השפלה RNA. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. Agilent 2100 electropherogram של רנ&quot;א סך העצה מבודדים בשיטה המתוארת על העצה אורן loblolly. -28: יחס שווה 1.4 18S, ערך רין שווה 8.6 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. Agilent 2100 electropherogram של רנ&quot;א קצה apical מסך המציג והשפלה קשות זיהום גנטי. -28: יחס שווה 18S 0.65, ערך רין שווה 3.4

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

קבלת באיכות גבוהה RNA ממינים כוניפאר יכול להיות משימה קשה בהתחשב רמות גבוהות של תרכובות פנוליות וכן פוליסכריד נמצא ברקמות וודי. החל פרוטוקול שפותח על ידי Chang et al. (1), נמצא כי מיצוי קפדני יותר לנקות צעדים להוביל לבידוד עקבית של RNA מסך מאוד איכותי של וודי וודי שונים שאינם ר...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

רקמות שבודד מינים כוניפאר, בעיקר אלה השייכים למשפחת Pinaceae, כגון אורן loblolly (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; ל), מכילים ריכוז גבוה של תרכובות פנוליות ופוליסכרידים שמפריעים טיהור RNA. בידוד איכותיים RNA ממינים אלה מחייב איסוף קפדני רקמות נהלים בתחום וכן את העסקתם של פרוטוקול בידוד RNA מורכב מספר שלבים מיצוי אורגני כדי לבודד RNA באיכות מספקת microarray גנומי וניתוחים אחרים. הבידוד באיכות גבוהה RNA מן השדה שנאספו אורן loblolly דגימות יכול להיות מאתגר, אבל כמה שינויים ברקמת תקן ונהלים RNA בידוד לשפר באופן משמעותי את התוצאות. היקף השפלה RNA כללי מגדילה אם דגימות אינם נאספים כראוי והעבירו מהשדה, במיוחד במהלך רחב היקף היבול. סך התשואות RNA ניתן להגדיל באופן משמעותי טחנת במקפיא חנקן נוזלי לפני RNA בידוד על ידי דגימות כתישה, במיוחד כאשר מגיעים דגימות מרקמות וודי. זה בעיקר בשל נוכחותם של סוכני חמצון, כגון תרכובות פנוליות, ופוליסכרידים כי הן נוכח רמות גבוהות של תמציות מרקמות של מינים מעוצים כוניפאר ביותר. אם לא יוסר, מזהמים אלו יכולות לשאת מעל המובילים לבעיות, כגון רנ&quot;א השפלה, כי בעקבות התשואות נמוכות מדגם באיכות ירודה RNA. שריד של תרכובות פנוליות, כמו גם סוכרים, יכול גם להפחית או אפילו לבטל לחלוטין את הפעילות של transcriptase הפוכה או polymerases השני הנפוץ לסינתזה cDNA. בפרט, RNA נועד לשמש כתבנית לסינתזה פעמיים תקועים cDNA בדור של ספריות cDNA, חד גדילי סינתזה cDNA עבור PCR או qPCR של, או לסינתזה של חומרים היעד microarray חייב להיות באיכות הגבוהה ביותר אם החוקרים לצפות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. טכניקות בידוד RNA מועסקים בדרך כלל על מיני צמחים רבים אחרים הם לעתים קרובות מספיק ביכולתם להסיר מזהמים אלה מדגימות כוניפאר ולכן לא התשואה הכולל דגימות RNA מתאים מניפולציות במורד הזרם. בסרטון הזה אנחנו מדגימים שיטות לאיסוף השדה של רקמות כוניפאר, החל כריתת עץ בן ארבעים, על קצירת של השיפה, העצה המשנית, ועץ העצה התגובה. אנחנו גם להדגים פרוטוקול בידוד RNA אשר הניב באופן עקבי באיכות גבוהה של רנ&quot;א מניפולציות האנזימטית הבאים.

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species at JoVE.com

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

הצמח וברקמות רבים, כולל השיפה ו העצה של אורן loblolly (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; ל), מכילים רמות גבוהות של phenolics ופוליסכרידים שמפריעים טיהור RNA. מצגת זה דן טכניקות הקציר השדה גדל רקמות הבידוד של רנ&quot;א באיכות מספקת microarrays ומנתח גנומית אחרים.

שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ &#39; taeda ל) ומינים אחרים Conifer

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

13.7K Views.  University of Georgia (UGA). הצמח וברקמות רבים, כולל השיפה ו העצה של אורן loblolly ( Pinus taeda ל), מכילים רמות גבוהות של phenolics ופוליסכרידים שמפריעים טיהור RNA. מצגת זה דן טכניקות הקציר השדה גדל רקמות הבידוד של רנ"א באיכות מספקת microarrays ומנתח גנומית אחרים.

Video: An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...