לבידוד קריפטה של המעי הדק של מורין, יש להשתמש בשברים שטופים כראוי של חמישה מילימטר על חמישה מילימטר של המעי הדק המבודד. לדגור על חתיכות באנטיביוטיקה PBS המכילה שני EDTA מילימולרי במשך 30 דקות על קרח מבלי לרעוד. כדי להקל על התמצקות המטריצה החוץ תאית, או ECM, לדגור מראש על צלחת 24 בקידוח באינקובטור תרבית רקמה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שאיפת תמיסת EDTA משברי הרקמות, הוסף 25 מיליליטר של אנטיביוטיקה PBS קרה טרייה. לאחר מכן נערו את המיכל במרץ ביד, 30 עד 40 פעמים. מסננים את המתלה פעם אחת דרך מסננת של 70 מיקרון.
לפני המעבר לשלב הבא, לאשר את נוכחותם של crypts מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, צנטריפוגו את המתלה ב 390 G וארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את גלולת הקריפטה ב -20 מיליליטר של DMEM המכיל 2% סורביטול, המכונה מעתה סורביטול DMEM.
העבר 10 מיליליטר של השעיית הקריפטה לכל אחד משני צינורות 15 מיליליטר חדשים. הפעם, צנטריפוגו את שני הצינורות במהירות נמוכה יותר של 80 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את מסת התאים הגדולה מהתאים או הפסולת. שאפו את הסופרנאטנט בעדינות, והשאירו כשני מיליליטר של סופרנאטנט בכל צינור.
לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של סורביטול DMEM לכל צינור. צנטריפוגו את המתלים שוב ב-80 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. שאפו את הסופרנאטנט כפי שהודגם קודם, והוסיפו 10 מיליליטר של סורביטול DMEM להשעיה מחדש.
לאחר שאיפת הסופרנטנט, הוסף 10 מיליליטר של DMEM מלא והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. השאירו את המתלים לנוח דקה אחת כדי להשיג את הקריפטים הצפים ביעילות. לאחר דקה, סננו את התרחיף משני הצינורות לתוך צינור טרי דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי לטהר את הקריפטות.
כדי לספור את הקריפטים הטהורים לפני הזריעה, טפטפו 25 טיפות מיקרוליטר לתוך צלחת של שישה סנטימטרים בשלוש נקודות. ספרו את מספר הקריפטות תחת מיקרוסקופ בהגדלה פי 4 וחשבו את ריכוז הקריפטות לכל 25 מיקרוליטר. לאחר מכן, צנטריפוגו את כל התסנין ב 290 גרם במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
עבור זריעה, להשעות את הקריפטים ב ECM בריכוז של 100 crypts לכל 40 מיקרוליטר של ECM. פיפטה אותו למעלה ולמטה חמש עד 10 פעמים בעדינות הימנעות מבועות אוויר כדי לקבל מתלה הומוגני. לאחר מכן, זרעו 40 מיקרוליטר של השעיית הקריפטה לכל באר בצלחת 24 באר שחוממה מראש.
לדגור על צלחת 24 בארות במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עבור פילמור של ECM. כסו את ה-ECM לבאר ב-500 מיקרוליטר מדיום תרבית המכיל גורם גדילה אפידרמלי של עכבר, עכבר רקומביננטי R-Spondin 1 ונוגין עכבר רקומביננטי. הריכוז הסופי של חומרים לבאר מוצג כאן.
תרבית את הקריפטות על ידי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בצע הדמיה חיה כדי להקליט מורפוגנזה אורגנואידית באמצעות מיקרוסקופ תמונה Timelapse כל שלוש שעות למשך עד שבעה ימים ולקבל תמונות מוערמות Z סדרתיות. כמעט כל הקריפטים המבודדים נאטמו מיד ונראו בצורת חרוט לאחר שנסחטו מגומחות האפיתל.
יתר על כן, הקריפטים בשבר הסופי שולבו והתאימו לשימוש בתרבות. תמונות Timelapse של צמיחת אורגנואידים גילו כי התפשטות פעילה והתמיינות של תאי גזע במעי התרחשו באזור הקריפטה עם ניצנים. הניצנים היו מלווים בנדידת תאים, התפשטות והתמיינות תאי פאנת'.
