Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

בתוך ארון בטיחות ביולוגית, להסיר את רקמת השומן murine עם מלקחיים סטריליים. לאחר הסרת עודפי PBS, העבירו את הרקמה לצלחת פטרי אחרת ושטפו פעמיים במשך חמש דקות כל אחת עם 10 מיליליטר של תמיסת PBS AA. הוסיפו 20 מיליליטר של תמיסת קולגנאז מוכנה לכוס קריסטל המכילה רקמה מקוטעת בגודל סנטימטר מרובע אחד ופס מגנטי.

דוגרים על הכד האטום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמשכת. סנן את ההומוגנט דרך צמצם נירוסטה 0.38 מ"מ 40-רשת סנן על צלחת פטרי ואסוף את תרחיף התא בצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. בזהירות להשעות את החלק כלי הדם סטרומה ב 20 מיליליטר של DMEM בתוספת חם צנטריפוגה את ההשעיה.

לאחר השלכת supernatant, בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם 40 מיליליטר של מדיום DMEM ללא תוספת. להשעות את החיך בחמישה מיליליטר של DMEM מוסף. מעבירים את המתלה לבקבוק T בגודל 25 ס"מ מרובע ודוגרים.

יש לשטוף תאים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS AA חם ופעמיים עם DMEM ללא תוספת. כדי להסיר פסולת תאים ותאים שאינם מורין להוסיף חמישה מיליליטר של DMEM טרי וחם בתוספת ולשנות את המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 90% עד 100%, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין EDTA חמה לתאים שטופי DMEM.

דוגרים במשך חמש עד שבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף ארבעה מיליליטר של DMEM בתוספת לחד-שכבה של התא המנותק ופרק בעדינות את המתלים. להשעות את התאים בחמישה מיליליטר של DMEM בתוספת חם.

לאחר צנטריפוגה והשלכת הסופרנטנט, ערבבו בעדינות את הגלולה במיליליטר אחד של תוסף DMEM. צובעים את התאים בכחול טריפאן וסופרים אותם בתא נויבאואר. תאי זרעים בצלוחיות T-75.

כדי להבטיח היווצרות מושבה והתפשטות גבוהה, התבוננו במורפולוגיה של התאים המוכתמים בהמטוקסילין ובאאוסין תחת מיקרוסקופ אופטי. צביעת המטוקסילין ואאוזין חושפת ציטופלסמה נרחבת עם הארכות מוארכות ומיקרופילמנטים תוך-תאיים בשפע.