Selection, Expansion, and Quality Control of hiPSCs Generated from Dermal Fibroblasts

כדי להתחיל, לקחת את הצלחת של פיברובלסטים electroporated ולצפות היווצרות של מושבות hiPSC תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה אובייקטיבית 10x עד 20x. מושבות hiPSC בקוטר 300 מיקרומטר, גבולות ברורים ויחס גרעינים לגוף גבוה מתאימות לקטיף. לפני הקטיף, מצפים את הבארות של צלחת באר 96 המתאימה לתרבית hiPSC עם 100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי.

ולדגור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה, לסמן את המושבות המעניינות בתחתית צלחת תרבית התא עם עט. להכנה הסופית של צלחת הבאר 96, הסר את תמיסת הציפוי והוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית hiPSC מחומם מראש, המכיל 10 מיקרומול של מעכב ROCK Y-27632 לכל באר.

לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS שחומם מראש והוסיפו תרבית hiPSC טרייה שחוממה מראש המכילה 10 מיקרומול של מעכב ROCK Y-27632 לפני הקטיף להסרת תאים מתים. בחר את מושבות hiPSC באמצעות מחט מד וחלק את המושבות לחתיכות קטנות על ידי ציור רשת לכל מושבה. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לבדוק שהמושבות מחולקות בהצלחה לחתיכות.

לבסוף, מעבירים את המושבות עם פיפטה של 100 מיקרוליטר לצלחת הבאר 96 המוכנה, ומחזיקים את הפיפטה זקופה מעל המושבה. אפשרו לתאים להיצמד למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ללא הפרעה. למחרת, החליפו את המדיום ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית hiPSC טרי כדי להסיר את מעכב ה-ROCK Y-27632 ולהחזיר את הצלחות לאינקובטור.

עקוב אחר צלחת הבאר 96 וסמן את הבארות בשיבוטים שנבחרו בהצלחה. ניתן להרחיב ולהקפיא את השיבוטים המסומנים בשלב זה. תמונות ניגודיות פאזה תכנתו מחדש בהצלחה מושבות hiPSC, מוצגות hiPSC נבחרות, מושבות מובחנות באופן ספונטני, מושבות שאינן hiPSC ותרבות hiPSC צפופה מדי.