כדי להתחיל, להכין שני מיליליטר של 4% פורמלין או כל קיבוע מתאים אחר. כמו כן, הכינו צלחת פטרי, מלקחיים ומספריים כירורגיים לפני תחילת ההליך. הניחו את הדג הקפוא שעבר המתת חסד כראוי בצלחת פטרי המכילה מים שעברו דה-יוניזציה.
באמצעות מספריים, לבצע חתך דרך הגוף, הקדמי והאחורי כדי peduncle caudal. תנו לרקמה לדמם החוצה במים שעברו דה-יוניזציה בתוך צלחת הפטרי. באמצעות מלקחיים, לאסוף ולהעביר את peduncle caudal לתוך פתרון קיבוע מוכן בצינור microcentrifuge.
בזהירות להפוך את הצינור מספר פעמים. לפני ההרכבה, לשטוף את הרקמה הקבועה PBS במשך 10 דקות על נדנדה. לאחר מכן העבירו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל תמיסה של 30% סוכרוז במים נטולי יונים, מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס והפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים.
השאירו את הצינור זקוף בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. ממלאים תבנית הטבעה בשכבה של חמישה מילימטר של אמצעי הרכבה OCT. בעזרת מלקחיים, מניחים את הפדונקל הקאודלי בתחתית התבנית.
התאם את הכיוון שלו לחתכים רוחביים או קורונליים. תן למדיום להקפיא בקופסת קרח יבש. ברגע שהרקמה מיוצבת במיקום הרצוי, ממלאים את שאר התבנית לפני שה-OCT קופא לחלוטין.
אחסנו את התבנית בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות לפני חיתוך הרקמה באמצעות הקפאה. מידת הקריו-פציעה בימים שונים לאחר ההקפאה, או DPCI, נותחה בקטעי הפדונקל הקאודלי באמצעות צביעת טריכרום המורכבת מכחול אנילין, חומצה פושין ואורנג'-G. האזורים הפגועים נקבעו על ידי היעדר כתמים כתומים.
ב 4 ו 7 dpci, החלק הרוחבי הציג שרירי שלד מנוונים באופן נרחב באגף הקפואה של הגוף. ניתוח אימונופלואורסנציה הראה כי, ב 4 DPCI, הצד הפגוע של peduncle caudal הכיל תאים חיוביים DAPI בשפע, אבל מעט או ללא F-actin ו tropomyosin 1, המציין שרירים מנוונים. ב 7 dpci, tropomyosin 1 ו F-actin יכול להיות מזוהה בפצע, קרוב לקו האמצע האנכי של הגוף, המציין את תחילתו של היווצרות myofiber חדש.
ב 30 dpci, שני צידי הגוף הציגו התפלגות דומה של צביעת F-actin, מה שמצביע על שיקום יעיל של שרירי השלד.
