לפני צביעה אימונופלואורסצנטית מרובה, לתקן את הרקמה ולבצע deparaffinization ועיכוב peroxidase אנדוגני. לאחר מכן לצביעה אימונופלואורסצנטית מרובה, השקיעו את המגלשות בצנצנת צביעה של 300 מיליליטר המכילה חיץ ציטראט 10 מילימולרי בתוספת 0.1% Triton X-100. מניחים את צנצנת הכתמים כשהמכסה סגור במיקרוגל למשך שלוש עד חמש דקות בעוצמה מרבית עד שהמאגר מתחיל לרתיחה.
לאחר הרתיחה, השאירו את החיץ בטמפרטורת רתיחה קרובה על ידי הנחת המיקרוגל על עוצמה נמוכה למשך 15 דקות. שוב, חממו את המאגר על ידי הצבת המיקרוגל בעוצמה מרבית למשך 90 שניות. מוציאים את הצנצנת מהמיקרוגל ומניחים למאגר להתקרר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
שטפו את המגלשות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת במים מזוקקים, ולאחר מכן חמש דקות של שטיפה במי מלח חוצצים טריס המכילים 0.1% Tween 20 או TBS Tween. לאחר הכביסה האחרונה, הסירו את ה-TBS Tween על ידי הכתמת השקופיות על מגבת נייר. לאחר מכן, הניחו את השקופיות על קופסת שקופיות במיקרוסקופ והקיפו את הרקמה בעט הידרופובי.
חסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים על ידי כיסוי הרקמה עם 5% BSA מומס ב- TBS Tween. לאחר 30 דקות, הסר את מאגר החסימה על-ידי מחיקת השקופיות על מגבת נייר. לאחר מכן, לדגור על הרקמה במשך 60 דקות עם 300 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל ב 1% BSA, TBS Tween.
לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחת עם TBS Tween. לאחר השטיפה, לדגור על הרקמה במשך 40 דקות עם 300 מיקרוליטר של נוגדן משני Poly-HRP. לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחת עם TBS Tween.
לאחר מכן, לדגור על הרקמה במשך 10 דקות עם 300 מיקרוליטר של מגיב טירמיד fluorochrome מדולל פי 200 בחיץ borate בתוספת זמנית עם 0.003% מי חמצן. לאחר מכן שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם TBS Tween ודגרו על הרקמה במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן פאן-ציטוקרטין אנושי מדולל ב-1% BSA, TBS Tween. למחרת, שטפו את הרקמה עם TBS Tween ודגרו במשך 120 דקות עם הנוגדן המשני יחד ישירות עם פלואורוכרום מדולל פי 200 ב-1% BSA, TBS Tween.
לאחר הדגירה, לשטוף את הרקמה עם TBS Tween לפני צביעת הגרעינים עם bisBenzimide מדולל 1, 000 פעמים ב 10% BSA, TBS Tween במשך חמש דקות. שטפו את הרקמה שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחת במים מזוקקים לפני הרכבתה על מגלשה באמצעות מדיום הרכבה פלואורסצנטי וזכוכית כיסוי בורוסיליקט. לניתוח תמונות, ייבא את הסריקות לתוכנה לניתוח תמונות.
לאחר מכן עבור אל ניתוח הכרטיסייה ובחר את אלגוריתם הפלואורסצנטיות הגבוה על ידי לחיצה הגדרות, פעולות ולאחר מכן טען. בחר בכרטיסייה בחירת צבע ואת הצבע המעניין. בכרטיסיה זיהוי גרעיני, עבור אל סוג פילוח גרעיני ובחר מותאם אישית AI.
לאחר מכן במסווג סגמנטציה גרעינית, בחר את AI.In המאומן שנשמר בכרטיסייה זיהוי ממברנה וציטופלסמה, בחר את רדיוס הציטופלסמה המרבי ואת מספר צבעי הממברנה. עבור כל צבע, בחר את הסף החיובי לגרעין, את הסף החיובי לציטופלסמה, ואת הסף החיובי לממברנה. עבור כל צבע, בחר את הגרעין, הממברנה ואחוז הציטופלסמה של ערכי השלמות.
שמור את האלגוריתם על-ידי בחירה באפשרות הגדרות, פעולות ושמירה. נתח את אזור תחומי העניין על-ידי לחיצה על נתח ובחירה באפשרות שכבת ביאור. לאחר מכן עבור אל תוצאות הכרטיסייה ובחר את כל הנתונים בנתוני אובייקט.
יצא את הנתונים בתבנית CSV על-ידי לחיצה ימנית על ייצוא ובחירה באפשרות objectdata.csv. מוצגת תוצאה מייצגת של צביעה אופטימלית על ידי immunofluorescence multiplex. בחירת הדילול הנכון הייתה חיונית לאימות ספציפיות הנוגדנים ולמיטוב יחס האות לרעש של הצביעה.
