כדי להדביק קוטילדונים של פולי סויה עם קני שורש של אגרובקטריום, תכננו פריימרים לזיהוי הגן פלסמיד TI virD2 באמצעות הרצף של קני שורש אגרובקטריום PRI2659 פלסמיד. לאחר הטרנספורמציה, בדוק את מושבות אגרובקטריום לשימור virD2 על ידי PCR באמצעות ערכת PCR. לאחר בחירת מושבות קנה השורש Agrobacterium המכילות הן את virD2 והן את הגן המעניין, פזרו כמה מושבות על לוחות LB המכילים 100 מיליגרם לליטר ספקטינומיצין עבור הפלסמיד המעניין.
למחרת, באמצעות קצה פיפטה P200, גרדו אורך של 1.5 ס"מ של אגרובקטריום מצלחת LB והשעו אותו מחדש במיליליטר אחד של חיץ פוספט. לדלל את תרחיף התא המרחף מחדש ומים אולטרה-טהורים מעוקרים באצטוסירינגון. למדוד את הספיגה באמצעות צינור קובטה בצפיפות אופטית של 600 ננומטר.
לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגית, טבלו אזמל מעוקר בתמיסת אגרובקטריום ובצעו חתך בעומק של מילימטר אחד לאורך פני השטח הפנימיים של הקוטיילדון. מניחים שישה עד שמונה קוטילדונים חתוכים על צלחת פטרי המכילה נייר פילטר רווי נביטה ומדיום טיפוח עם אצטוסירינגון. דגרו על הצלחות בטמפרטורת החדר במשך שלושה ימים תחת תקופת צילום של 16 שעות.
לאחר שלושה ימים, העבירו את הקוטילדונים הנגועים לצמיחת שורשים שעירים, או צלחות HRG. יש לדגור על הלוחות בתאי הגידול המוגדרים ל-22 מעלות צלזיוס ולעוצמת אור של 100 מיקרומול בצילום של 16 שעות עד לצפייה בשורשים ראשוניים בעלי שורשים משניים עד שלושה סנטימטרים. לאחר שלושה עד ארבעה שבועות, קוצרים שורשים ראשוניים הצומחים מהיבלת ומכילים שורשים משניים באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים.
מעבירים את השורשים לצלחות HRG המכילות אנטיביוטיקה מתאימה ומאפשרים להם לצמוח במשך חמישה ימים נוספים. ביום החמישי, קצרו שורשים שעירים טרנסגניים עם שורשים משניים שאורכם שלושה עד שישה סנטימטרים. אם אתם מתבוננים בחלבונים פלואורסצנטיים, ודאו שלשורשים המשניים יש מעט אוטופלואורסצנטיות.
לאחר מכן, כדי לבצע טיפולים מעוררי השראה או כימיים, לחתוך את השורשים המשניים לחתיכות סנטימטר אחד ולהניח כ 100 מיליגרם על אגר HRG בערימה. לאחר מכן להרוות את הערימה עם 80 מיקרוליטר של פתרון הטיפול המתאים ולאפשר את הצלחת לדגור בטמפרטורת החדר. לאחר 24 שעות, לצורך מיצוי RNA, ייבשו במהירות את השורשים על מגבת נייר מעוקרת וקצרו אותם ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.
מיד לאטום את החלק העליון של הצינור באמצעות parafilm ולעשות שני חורים קטנים באמצעות מלקחיים מחודדים. תוצאות PCR המושבה של אגרובקטריום שעבר טרנספורמציה מוצגות. המושבות החיוביות ב-PCR הצביעו על הגן המעניין.
עם זאת, שליש עד מחצית מהמושבות היו שליליות לבדיקת הגן virD2. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מדגים לוקליזציה תת-תאית של GFP-GmJAZ1-6. ניתוח ביטוי גנים אישר את ביטוי היתר של גורם השעתוק גליצאולין GmHSF6-1 והשתקת RNAi של GmMYB2912 בשורשי ויליאמס 82.
