Mini-Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR

יש לחסן את L.reuteri ב-10 מיליליטר של מרק MRS המכיל אנטיביוטיקה מתאימה ולדגור במשך הלילה באופן אירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגות את התרבית בצנטריפוגה מקוררת מראש השליכו את הסופרנאטנט ושטפו שוב את הגלולה בשני מיליליטר של צנטריפוגת חיץ P1 סטנדרטית והשליכו את הסופרנאטנט לפני שתשעו מחדש את הגלולה ב-250 מיקרוליטר של חיץ P1 שונה. דוגרים במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להוסיף 250 מיקרוליטר של חיץ P2 ולערבב על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים. לאחר חמש דקות, להוסיף 350 מיקרוליטר של חיץ N3 ולערבב על ידי היפוך הצינור. צנטריפוגה ב 10, 000 G במשך 10 דקות ולהעביר כמה supernatant ככל האפשר לעמוד סיבוב.

צנטריפוגה שוב למשך 60 שניות ומשליכה את הזרימה. שטפו את עמוד הסחרור עם 500 מיקרוליטר של PB חיץ וצנטריפוגה, והשליכו את הזרימה. לשטוף את עמוד הסחרור עם 750 מיקרוליטר של PE חיץ וצנטריפוגה ב 10, 000 G במשך 60 שניות.

יש להשליך שוב את הזרימה והצנטריפוגה למשך 60 שניות כדי להסיר את שאריות החוצץ. הניחו את עמוד הסחרור בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף 20 עד 30 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים נטולי DNASE ו- RNase למסנן עמוד הסחרור והשאר דקה עד שתי דקות לפני צנטריפוגה ב 10, 000 גרם למשך 60 שניות.

בצע תגובת PCR סטנדרטית באמצעות פריימרים ספציפיים לפלסמיד עם אלואט המספק את ה- DNA של התבנית, כולל בקרה חיובית עם פלסמיד הנגזר מהמיני-הכנה של E.coli. הפעלת המיני-פרפ דרך ג'ל אגרוז גורמת למריחה, ולא לרצועות נצפות. עם זאת, PCR עוקב באמצעות eluate כתבנית DNA מייצר גדלי פס צפויים.