Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

התחילו בהנחת הרקמה בצלחת תרבית רקמה סטרילית והסרת עודפי מדיה. מדדו את הרקמה בעזרת סרגל מתכת סטרילי וצלמו אותה. הוסף שלושה מיליליטר של מדיה מתקדמת DMEM/F-12 לרקמה החתוכה ופיפטה את הרקמה למעלה ולמטה כדי לשטוף אותה.

לאחר מכן לשטוף את הרקמה עם שלושה מיליליטר של PBS. שאפו את המדיום מצלחת תרבית הרקמה וחתכו אותו לחתיכות קטנות באמצעות להבים סטריליים ושני מיליליטר של אמצעי עיכול. לאחר מכן לאסוף את הרקמה לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר בסך הכל של מדיום העיכול.

לדגור על הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. מעת לעת לערבב את המתלה על ידי pipeting למעלה ולמטה. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטר של DMEM/F-12 מתקדם לצינור.

לאחר מכן סנן את הדגימה דרך מסננת נקבוביות של 70 מיקרומטר כדי להסיר לכלוך גדול. עכשיו פיפטה שני מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS לחלק העליון של המסנן, ולהשתמש פיפטה לאסוף את הפסולת ואת שאריות רקמות עבור תרבית פיברובלסט. ואז צלחת את הפסולת עבור תרבית פיברובלסט.

צנטריפוגו את התסנין בטמפרטורת החדר ב 200 עד 300 גרם במשך חמש דקות, ולאחר מכן לשאוף את supernatant. הוסף חמישה מיליליטר של DMF 12 מתקדם לגלולה וצנטריפוגה את המתלה שוב ב 300 G למשך חמש דקות. עבור ליזה של תאי דם אדומים, השהה מחדש את הגלולה בארבעה מיליליטר של מאגר אשלגן ליזה אמוניום כלורי, והעבר אותה לצינור של 15 מיליליטר.

דוגרים על התאים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר צנטריפוגה של התערובת באותם תנאים כפי שהודגם קודם לכן, שואפים את הסופרנטנט. לכדור, הוסף חמישה מיליליטר של DMEM/F-12 מתקדם, וצנטריפוגה שוב בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר שאיפת הסופרנטנט, הוסיפו מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה תאי זמין מסחרית לגלולה ודגרו עליו במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ושאפו שוב את הסופרנאטנט. לאחר מכן השהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של DMEM/F-12 מתקדם.

נתק גושי תאים על ידי פיפטציה של המתלה מספר פעמים עם פיפטה P1000. צנטריפוגר את המתלה והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, השג קצוות פיפטה P1000 ו-P200 מקוררים מראש, והשתמש בקצוות הקרים המקובעים על פיפטת P1000 כדי להשהות מחדש את כדורית התא במטריצת הממברנה, לפני הנחת הבז על קרח כדי למנוע התמצקות.

להשיג את הצלחת שחוממה מראש מן האינקובטור. בעזרת פיפטת P200 במשקל 48 מיקרוליטר ובעזרת קצוות קרים, יוצרים כיפות מטריצת קרום מרתף בצלחת שחוממה מראש. לאחר מכן לדגור אותו כדי למצק את תערובת קרום המרתף.

לאחר שהמטריצה מתמצקת, מוסיפים שניים עד שניים וחצי מיליליטר של DMEM/F-12 מתקדם, בתוספת גורמי הגדילה והמעכבים. תאי הגידול בודדו ואורגנואידים סרטניים הוקמו מרקמה טרייה במשך תקופה של 15 יום. לעיתים, נפחי פסולת תאים גדולים מונעים הדמיה מדויקת של אורגנואידים סרטניים מתפתחים.

אורגנואידים מתפתחים נצפו כמשתנים פנוטיפית מתרביות מבודדות, מעוגלות לכדוריות או דמויות אגרגטים, בהתאם למקור הגידול. תרביות אורגנואידים עלולות להיות מזוהמות על ידי פיברובלסטים, תוצר PI נפוץ של תרבית תאי גידול ראשונית. לאחר כשבעה ימי תרבית, הפיברובלסטים נודדים מכיפות מטריצת קרום המרתף ונדבקים ללוחות התא, מה שעלול לפגוע בגדילה אופטימלית של אורגנואידים.

תרביות פיברובלסטים נוצרות מפסולת הרקמה המוחזרת מהמסנן. התאים נודדים מתוך פסולת הרקמה ונדבקים ללוחות התרבית.