Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells

כדי להתחיל, לשמור על תאים בבקבוק תרבית של 75 סנטימטרים רבועים. שאפו את מדיום התרבית ושטפו את התאים עם PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA כדי לנתק תאי היצמדות.

לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהשהות מחדש את התאים ב 10 מיליליטר של בינוני. לאחר מכן, לאסוף את התאים מן הבקבוק לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 480 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולשאוף את המדיום.

להשעות מחדש את התאים ב 5 עד 10 מיליליטר של מדיום מבוסס על המפגש המקורי של התרבית. הסר 100 מיקרוליטר של תאים והוסף לצינור 1.5 מיליליטר עם 100 מיקרוליטר של 0.4% טריפאן כחול. הוסף את התאים להמוציטומטר, וספור אותם על ידי התבוננות מתחת למיקרוסקופ ובאמצעות מונה המספרים הידני.

לדלל את התאים לשלוש פעמים 10 עד התאים הרביעי למיליליטר בתווך התרבית ללא פנול אדום. הוסף 2.5 מיליליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת שש בארות עם כיסוי מצופה פולי-D-ליזין בהתאם להוראות היצרן. גדלו את התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור לח כדי לאפשר חיבור תאים לחלקת הכיסוי.

למחרת, בחנו את חיבור התאים תחת מיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרה של פי 20. הכינו את תמיסות מלאי הטיפול בריכוזים הרצויים וצרו בקרת מדיה בלבד, בקרה לרכב בלבד בריכוז התואם את תרכובת הבדיקה, ובקרה עם FCCP היונופור ותרכובות הבדיקה. עבודה עם כיסוי אחד בכל פעם, להוסיף 1.8 מיליליטר של מדיום עבור המצב תחת המחקר לתאים.

לדגור על התאים המטופלים בתרכובת הבקרה או הבדיקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% בסביבה לחה למשך הזמן הרצוי. לאחר תקופת הטיפול, יש להוסיף 200 מיקרוליטר של 10X TMRE לתאים. יש לדגור במשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה רוויית לחות של 5% פחמן דו-חמצני.

שאפו בעדינות את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי למזער הפרעות רקע. לאחר מכן הפוך את החלקת הכיסוי לשקופית מיקרוסקופ המסומנת בתנאי הטיפול. דמיינו את התאים חיים בעירור של 549 ננומטר ובפליטה של 575 ננומטר.

השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי ללכוד מספר שדות מחסנית Z עם לכידת תמונה במהירות גבוהה לפני אובדן שלמות התא. שמור ואחסן את קובץ התמונה לניתוח מאוחר יותר. התאים עם מיטוכונדריה פעילה שמרו על צביעת TMRE והראו פלואורסצנטיות גבוהה.

מיטוכונדריה דה-פולריים או לא פעילים הפחיתו את פוטנציאל הממברנה, אינם מצליחים לשמור על TMRE ומראים אות פלואורסצנטי נמוך.