Mounting and Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain

כדי לבצע הדמיה של תאים חיים של מוח הזחל הכוכב השלישי, התחל באיסוף המוחות המנותחים וגופי השומן המבודדים בבאר האחרונה של צלחת דיסקציה בת שלוש בארות המכילה את אמצעי הדיסקציה וההדמיה. הניחו קרום חדיר גז על גב המגלשה ולחצו על הטבעת המפוצלת במרכז. באמצעות מיקרו פיפטה של 200 מיקרוליטר, העבירו עד 10 מוחות מנותחים עם גופי שומן מקסימליים אפשריים ו-130 עד 140 מיקרוליטר של התווך למרכז הממברנה.

כוונו את המוח בהתאם לאוכלוסיית תאי הגזע העצביים שיש לצלם ולסוג המיקרוסקופ, וודאו שהדגימות קרובות למטרת המיקרוסקופ. לדוגמה, כדי לדמיין תאי גזע עצביים באונות המוח המרכזיות, ודא שאונות המוח קרובות ביותר למטרה. לאחר מכן הניחו בעדינות כיסוי זכוכית על התמיסה על הממברנה כדי לפזר את התמיסה עם הגוף של המוח והשומן ברחבי הממברנה.

החזיקו את רקמת המעבדה בקצה הכיסוי כדי לכתם את התמיסה העודפת עד שהמוח ייגע בחלקת הכיסוי מבלי להימעך. לאחר מכן, לשתק את החלק כיסוי על ידי מריחת וזלין מותך לאורך הקצוות שלה באמצעות מברשת צבע ולאפשר לג'לי להתמצק. הוסף 400 מיקרוליטר של אמצעי הדמיה לבאר בשקופית מיקרו מרובת בארות.

העבירו את גופי השומן שנותחו בעבר לבאר זו. לאחר מכן, מקמו עד 10 מוחות בצביר ליד מרכז הבאר. כוונו את המוח בהתאם לאוכלוסיית תאי הגזע העצביים שיש לצלם ולסוג המיקרוסקופ.

אפשרו למוח להתיישב בבאר למשך שתיים עד חמש דקות. כסה את שקופית המיקרו בכיסוי השקופית לפני העברתה למיקרוסקופ. התחל את תהליך הרכישה באמצעות עוצמת הלייזר וזמן החשיפה הנמוכים ביותר כדי למזער את הלבנת התמונה.

הדמיה של מוחות זחלים המבטאים כטב"מים המונעים על ידי דובדבן-יופיטר וסיכות תיוג אנדרוגיני GFP באמצעות שקופיות הדמיה מרובות בארות וללא תוספת גוף שומן גילתה כי הסיכות יצרו סהר אפיקלי בולט בחלוקת נוירובלסטים שאליהם הצירים המיטוטיים התיישרו באופן עקבי במהלך מיטוזה. בדגימות אלה, אורך מחזור התא גדל ככל שזמן ההדמיה גדל. דגימות שצולמו בגוף שמן בתוספת מדיום על שקופית הקשורה לקרום לא הראו עלייה באורך מחזור התא.

יתר על כן, נוירובלסטים עם ארבע חלוקות נצפו בשקופית הקשורה לקרום במשך 10 שעות.